Abstract
Subretinale injecties zijn met succes gebruikt bij zowel mensen als knaagdieren therapeutische interventies van eiwitten, virale middelen, en cellen leveren aan de interphotoreceptor / subretinale ruimte die directe blootstelling aan de fotoreceptoren en retinaal pigmentepitheel (RPE) heeft. Subretinale injecties van plasminogeen en recente preklinische en klinische onderzoeken hebben aangetoond veiligheid en / of werkzaamheid van het leveren van virale vectoren en stamcellen voor personen met gevorderde ziekte van het netvlies. Muismodellen van het netvlies en vaatziekten, in het bijzonder erfelijke retinale dystrofie, zijn van essentieel belang voor het testen van deze therapieën. De meest voorkomende injectieprocedure bij knaagdieren is om kleine transcorneal of transcleral incisies gebruiken met een anterieure benadering van de retina. Met deze aanpak, de injectienaald dringt de neurosensorische retina het verstoren van de onderliggende RPE en bij het inbrengen kan gemakkelijk nick de lens, waardoor de lens vertroebeling en bijzondere waardevermindering van niet-invasieve Imaging. Toegang tot de subretinale ruimte via een transcleral, posterior aanpak vermijdt deze problemen: de naald steekt de sclera ongeveer 0,5 mm van de oogzenuw, zonder retinale penetratie en voorkomt het verstoren van het glasvocht. Nevenschade wordt beperkt tot die welke samenhangt met de focale sclerotomie en de effecten van een voorbijgaande sereuze netvliesloslating. De eenvoud van de methode minimaliseert oculaire verwonding, zorgt voor een snelle retinale herbevestiging en het herstel, en heeft een laag uitvalpercentage. De minimale schade aan het netvlies en RPE maakt een goede evaluatie van de werkzaamheid en de directe effecten van de therapeutische middelen zelf. Dit manuscript beschrijft een nieuwe subretinale injectie techniek die kan worden gebruikt om te richten virale vectoren, farmacologische middelen, stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan de subretinale ruimte in muizen met hoge efficiëntie, minimale schade en snel herstel.
Introduction
Subretinale injecties zijn het belangrijkste middel van het leveren van cellulaire en virale middelen om de netvliezen van muizen om hun effecten op fotoreceptoren en de onderliggende RPE 1,2 bestuderen. Meest subretinale injectie protocollen muizen hebben een transcorneal of transcleral injectieplaats juist voor de evenaar (figuur 1). Deze benadering kan leiden tot inherente nevenschade die knikken en resulterende vertroebeling van de lens, verstoring van de integriteit van het glasachtig lichaam binnendringen van de neurosensorische retina en iris, retinale bloeding, netvliesloslatingen aanzienlijke en blijvende subretinale oedeem 3-9 omvat. Experimentele manipulaties moeten deze effecten om de effecten van therapeutische interventies 3,7,10,11 evalueren overwinnen. Deze studie geeft een gedetailleerde beschrijving en validatie van een posterior transcleral injectie methode die deze complicaties vermijdt, minimaliseert trauma en heeft een hoog slagingspercentage van gericht op de subretinale ruimte.
Injecties gericht op de subretinale ruimte in muizen vaak zeer moeilijk uit te voeren en de meeste onderzoekers geconfronteerd met een hoge frequentie van mislukte pogingen waarbij de vector een onjuiste locatie wordt geleverd of er significante schade aan het netvlies, bijvoorbeeld in een volledige netvliesloslating 6. Het aantal ogen uitgesloten van de analyse door de injectie complicaties is meestal niet gemeld in de muis studies, maar in onze eigen ervaring en in overleg met andere onderzoekers, kan het aantal mislukte injecties zo hoog als 50% zijn en variëren afhankelijk van de ervaring en de capaciteiten van de onderzoeker die het uitvoeren van de injecties. Het succes van de injectie wordt typisch bepaald door directe fundus beeldvorming en / of optical coherence tomography (OCT) 7,9. Een gemakkelijk onder de knie methode met een hoge slagingspercentages voor subretinale injecties in muizen kunnen experimenteren bespoedigen en de kosten van preklinische studies van treatments voor retinale ziekten die belangrijkste oorzaken van blindheid in de Verenigde Staten.
De achterste, transcleral subretinale injectie techniek die hier beschreven is een aanpassing van de klinische en preklinische protocollen 9,12. De niet-invasieve diagnostische evaluaties uitgevoerd in geïnjecteerde muizen tonen mild en zeer plaatselijk schade en het gebrek aan aanvullende zekerheden lens, het netvlies en RPE letsel. Bovendien, met relatief weinig praktijk, een experimentator kan deze resultaten met een hoog slagingspercentage te bereiken (80 - 90% of beter), waardoor de kosten in verband met dergelijke studies verminderen. Deze procedure kan worden gebruikt om cellulaire, virale of farmacologische therapeutische interventies fotoreceptoren en / of RPE leveren preklinische studies en experimentele ingrepen gemakkelijk evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren: Wild-type C57BL / 6J muizen gekweekt aan de Universiteit van Californië in Los Angeles (UCLA). Alle dieren waren tussen 11-17 weken oud, en omvatte mannelijke en vrouwelijke muizen. Alle muizen werden in groepen te huisvesten, onderhouden in een 12:12 licht / donker-cyclus met voedsel en water ad libitum. Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen van UCLA en de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde Verklaring voor het gebruik van dieren in Oogheelkundige en Vision Research.
LET OP: Alle drugs en injecteerbare agenten zijn United States Pharmacopeia (USP) rang.
1. Chirurgische Voorbereiding
- Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 8 mg / kg xylazine in een zoutoplossing mix. Dien anesthesie tot een diepte zodanig dat de muis heeft geen teen knijpen of hoornvlies aanraking reflexen.
- Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37,0 ° C met een circulerend water pad.
- Verwijden leerlingen met 2,5% fenylefrine eye drops en trim snorharen om visualisatie te vergemakkelijken. Bakkebaarden bieden significante sensorische input voor de muis derhalve whisker trimmen mag alleen het gedeelte te verwijderen die blokkeert goed toegankelijk voor het oog, en niet aan de basis van de whisker. In onze ervaring, muizen tonen normaal herstel na deze procedure. Solliciteer methylcellulose oogdruppels tot droog te voorkomen en te minimaliseren verdoving geïnduceerde voorbijgaande cataract 13.
- Steriliseren instrumenten voorafgaand aan de operatie (dwz betadine en ethanol of warm kralen).
- Bereid verdunde fluoresceïne (0,01% met behulp van 0,9% zoutoplossing) in een steriele omgeving (dat wil zeggen, bioveiligheid kast) of visualisatie wordt uitgevoerd (zie punt 3 hieronder).
2. Injectie Site Voorbereiding
- Bereid een injectiespuit (bijvoorbeeld 5 gl spuit) gepaste injectievolume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 gl).
- Plaats de muis, zodat het oog naar boven en duidelijk zichtbaar in de dissecting microscoop.
- Knijp de temporele bindvlies met fijne getipt pincet. Maak een omtrek incisie van ongeveer 90 graden met behulp van gebogen Vannas schaar.
- Herhaal stap 2.3 met capsule de onderliggende Tenon.
- Resect het omringende bindweefsel met fijne getipt pincet tijdens het draaien van de hele wereld nasaal. Werken aan de injectieplaats ongeveer 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw. Gebruik grote zorg om te voorkomen dat het verstoren van de retro-orbitale sinus.
3. sclerotomie en Subretinal Injection
OPMERKING: Het wordt aanbevolen dat de injectie van 0,01% fluoresceïne in 0,9% zoutoplossing worden gebruikt om te helpen met visualisatie tijdens het leren van deze procedure. De topografische distributie van fluoresceïne kan effectief worden gedocumenteerd met fundus beeldvorming (zie punt 4 hieronder).
- Maak een kleine sclerale incisie op de injectieplaats door zachtjes krassen op de oogschelp met een 22,5 graden oogheelkundige mes. Deze incisie shouLD alleen groot genoeg om de punt van de naald door de sclera te passeren.
- Plaats de afgeschuinde 33 G naald (hoek 5 -. 10 ° in de sclerotomie de afschuining gericht en hoekig evenwijdig aan het netvlies Injecteer gewenste volume (bijvoorbeeld 0,3 tot 1,0 ui van 0,01% Fluoresceïne voor leerdoeleinden).
OPMERKING: Handhaaf steriliteit van de injectiespuit door het grondig reinigen met opeenvolgende wassingen van een geschikt oplosmiddel en DI-water voor elke injectie. - Druk de zuiger langzaam (meer dan 3 sec) zonder het verplaatsen van de naald en met gelijkmatige druk.
LET OP: Als de naald in de subretinale ruimte, zal een lichte weerstand gevoeld worden, terwijl het indrukken van de zuiger. Er zal geen tot minimale weerstand zijn als de naald prikt het netvlies, en een hoge weerstand als de naald de sclera of RPE niet doordringen. - Wacht enkele seconden voordat de naald terug te trekken om terugstroom te minimaliseren.
- Spoel het oog met steriele zoutoplossing en zorgen voor het oog hals terug naar zijn normale positie geroteerd.
4. Beoordeling van Netvliesloslating van oktober en Fundus Imaging
- Voer oktober beeldvorming direct na de toediening van de kwaliteit van de injectie te evalueren en op geschikte tijdstippen na injectie als nodig netvliesstructuur evalueren.
OPMERKING: Voorbeelden van het gebruik van LGO soortgelijke studies is eerder beschreven 7,14.- Pas en lijn beeld oktober naar de plaats van injectie te richten. De injectieplaats moet middellijn en 0,5 mm tijdelijk aan de oogzenuw hoofd. Herhaal dit zo nodig als het detachement is uit frame of niet optimaal gecentreerd.
- Visualiseer netvliesloslating en kleurstof injectie met en-gezicht fundus imaging 7,14.
LET OP: Als een LGO imaging-systeem niet beschikbaar is, injectie van een kleine hoeveelheid fluoresceïne met een vector voor de praktijk zal visualisatie bij elke fundus camera die fluoresceïne angio presteert toestaanGraphy met dezelfde golflengten en filters blokkeren. Gelokaliseerde gebieden van hyper-fluorescentie zal verschijnen onder het vaatstelsel en het vaatstelsel zullen scherpe en duidelijke grenzen hebben als de subretinale ruimte correct is gericht. De rand van de bleb van de injectie wordt afgebakend door de overgang van hyper- hypo- fluorescentie. Diverse instrumenten voorzien deze mogelijkheid voor de muis; de instrumentatie die hier gebruikt wordt elders 14 beschreven.
5. postoperatieve zorg
- Breng een dikke laag van triple antibiotica oogheelkundige room aan de cornea oppervlak van de geïnjecteerde oog.
- Plaats muizen in schone eenzame kooien voor herstel. Niet muizen die een operatie hebben ondergaan, totdat ze volledig hersteld te combineren.
- Monitor ademhaling en temperatuur tijdens anesthesie herstel. Monitor dieren totdat ze borstligging kunnen handhaven.
- Voer extra juiste post-operatieve bewakingen behandeling, met een subcutane injectie van carprofen (5 mg / kg) voor post-operatieve pijn.
6. Beoordeling van retinale functie door Electroretinografie (ERG)
- Voer ERG analyse pre-injectie en op geschikte tijdstippen na de injectie als nodig is om het netvlies functie te evalueren. Als de injectie werd gemaakt in de subretinale ruimte, moet netvliesloslating verdwijnen binnen 72 uur.
- Gebruik standaard ERG technieken om retinale functie geëvalueerd voor en na de injectie zoals eerder beschreven 14,15.
7. 3D Wederopbouw en Bleb Volume kwantificering
LET OP: oktober scans met een hoog contrast omvat het gehele detachement in het kader van het uitzicht zijn optimaal voor gebruik. ImageJ / Fiji 17,18 en Imaris werden gebruikt, maar ook andere software kan worden gebruikt.
- Exporteer de b-scan van belang, de invoer in ImageJ / Fiji en gewas (Afbeelding> Crop) het gedeelte van de oktober sceen te worden gemodelleerd met behulp van de rechthoekige selectie tool.
- Stel contrast (Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast) en de afbakening van eventuele ontbrekende grenzen door het verbinden van twee delen met een lijn.
- Trek een rechte lijn met de line tool (met shift) dat de RPE aan de fotoreceptor laag overspant. Measure (Analyze> Measure) de lengte van de lijn om de grootte van de maximale onthechting te krijgen voor stap 7.8.
- Import bijgesneden frames om de 3D-reconstructie software (zie tabel van materialen) met behulp van de "RGB naar grijs" plugin en MATLAB Compiler Runtime.
- Stel de voxel grootte (onder Eigenschappen afbeelding) met behulp van de kalibratie parameters uit de LGO scan (x, y, z).
- Voer de "RGB Gray" plugin (onder Eigenschappen afbeelding), met gelijke weging voor elk kanaal, een vierde kanaal te maken. Verwijder origineel rood-groen-blauw-kanalen.
- Keren de grijze kanaal met contrast verandering. Store Afbeelding.
- Klik op de "voeg eenew oppervlak "knop in het tabblad 3D-View, en beginnen met de begeleide 4 stap proces van het creëren van het oppervlak.
- Stel het maaiveld detail (stap 1 van 4).
LET OP: In onze ervaring 8,0-12,0 was de meest effectieve bereik. - Zet de bol grootte (onder Achtergrond Selectie) iets minder dan de maximale grootte detachement gemeten in 7.1.2. Maak het oppervlak en ongedaan te maken grijze kanaal inversie (stap 2 van 4).
- Stel de drempel op de maximale waarde, zodat het oppervlak van de negatieve ruimte buiten het netvlies en de onthechting niet in contact komen (stap 3 of 4).
- Stel het filtertype het aantal voxels en isoleren negatieve ruimte in het losmaken plaats op grootte. Finish het oppervlak (stap 4 van 4).
Opmerking: Het volume van de loslating oppervlak onder volume in het tabblad statistieken.
- Stel het maaiveld detail (stap 1 van 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Postérieure benadering transcleral subretinale injecties werden uitgevoerd op 31 gezonde ogen van 16 wildtype muizen injecties van 0,3 ui (n = 18), 0,5 ui (n = 8) en 1,0 ui (n = 5) van 0,01% fluoresceïne. Eén oog werd uitgesloten van injectie door een bestaand hoornvlies dat structurele en functionele analyse voorkomen. Elk geïnjecteerd oog is opgenomen in dit rapport. Geen onbedoelde netvliesloslatingen, puncties van de neurosensorische retina, of lekkage in het glasvocht werden ontdekt noch was enig bewijs van lens knikken, ontstekingsreacties, uveitis, of post-operatieve infecties bij elke ogen waargenomen.
Netvliesstructuur werd bepaald pre-injectie, 10 min na injectie en 4 weken na de injectie met behulp oktober beeldvorming (figuren 2 en 3). Een 9-puntraster, met het middelpunt ligt over het midden van de maximale onthechting, werd op de 10-minna de injectie en face scan (Figuur 2B). Gebruik vasculaire oriëntatiepunten, pre-injectie en 4 weken na injectie scans werden gedraaid in registratie met de 10 minuten na injectie scan. Dit maakte identificatie van dezelfde locaties voor en na injectie retinale scans (Figuur 2A, C).
Subretinale injecties resulteerden in bleb formatie die weg van de injectieplaats waar de naald ging de subretinale ruimte (figuur 2B pijl) werd gecentreerd en waren of vlak (Figuur 3A) met een ondiepe onthechting uitstrekt over een groot gebied of gewelfd (Figuur 3B - D) met diepe onthechting in een opgesloten gebied (tabel 1). Een koepelvormige bleb werd gedefinieerd als onthechting die 50 urn loodrecht op de RPE overschreden. Nr rozetten, een golvend patroon door het uitrekken van de buitenste retina lagen werden waargenomen. de extent van de injectie afzetting werd zichtbaar gemaakt met een eigen gezicht oktober (figuur 2D, stippellijn), fluoresceïne fundus imaging (figuur 2E) en oktober B-Scans (figuur 3). De meerderheid van blebs (29 of 31) tot na het gezichtsveld van de oktober scans, die ongeveer 10% van de muizen retina omvatten. Er was geen controle over bleb vorm anders dan vaker koepelvormige blebs met meer injectievolume (tabel 1). Alle blebs opgelost door 2 weken (gegevens niet getoond).
Totaal retinadikte (membraan Bruch de zenuwvezellaag) werd kwantitatief bepaald 4 weken na injectie van 0,3 pl (figuur 3A), 0,5 pl (figuur 3B) en 1,0 pl (figuur 3C) injectievolume op elk punt van de onderhavige grid overeenkomstige b-scans (Tabel 1). De procentuele verschil (Δ%) wberekend als het verschil ten opzichte van de pre-injectie metingen van zowel structurele als functionele metrieken. Niet alle raster punten werden gedurende alle beeldvorming sessies verworven. Bijvoorbeeld, had 3 ogen 1 of 2 punten, 4 ogen had 3 of 4 punten, en 23 ogen moesten 5-9 punten in alle scans. Bolle of platte blebs en injectie volumes waren ingestort sinds totale retinadikte was niet significant verschillend voor pre- en post-injecties, hoewel een algemene trend in de richting van het netvlies dunner werd waargenomen voor beide (tabel 2).
Verdere analyse toonde kleine maar statistisch significante verdunning van 6,5% ± 1,9 overall (pre = 196 ± 1, n = 31; record = 183 ± 4, n = 31, 60 T = 3,4, p = 0,001) (Tabel 3). Om te bepalen waar netvlies dunner plaatsgevonden, een subset van 10 ogen die diktemetingen voor 9 roosterpunten bevatte werd geanalyseerd. Vergelijkbaar met de analyse van alle ogen, dedeelverzameling ogen toonde ook kleine maar significante algehele netvlies dunner (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; record = 179 ± 8, n = 10, 18 T = 2,4, p = 0,02). Nr netvlies dunner werd waargenomen op plaatsen distaal van de injectieplaats (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; record = 185 ± 8, n = 10, 18 T = 1,7, p = 11). Retinale dunner werd waargenomen op de plaats van maximale netvliesloslating (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; record = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), de injectieplaats zonder schade (13,8 ± 6,0, pre = 201 ± 1, n = 4; bericht = 173 ± 10, n = 4, t 6 = 2,8, p = 0,03), injectieplaats met retinale opsluiting wanneer een klein gebied van het netvlies is getrokken door de sclera op naald terugtrekken (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; record = 171 ± 3, n = 3, T4 = 8,9, p = 0,001) en injectieplaatsen bij littekens (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, 4 T = 5,1, p = 0,007). In totaal opsluitingen zich in 14 van de 31 injecties van 3 waardoor littekenvorming van het vaatvlies met verlies van de helft van de buitenste retina lagen (figuur 3E). In elk geval, maar deze waren sterk gelokaliseerde effecten.
Volvelds elektroretinografie deze vóór de injectie en herhaalde 4 weken na injectie met relatieve veranderingen afzonderlijk beoordeeld voor elk oog functionele veranderingen (tabel 1) beoordelen. Alleen donker aangepaste en-rod-gemedieerde reacties werden geregistreerd. Intensiteit responsfuncties werden uitgerust met Michaelis-Menten vergelijkingen Vmax af te leiden voor zowel de fotoreceptoren (a -waves) en de middelste netvlies (b -waves). Reacties werden niet beïnvloed door blaar vorm en werden daarom stortte (tabel 4). Er was een kleine, maar statistisch significante vermindering aan Vmaxeen -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013), maar niet b -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) na injectie (tabel 4). Representatieve golfvormen voor en na injectie van 0,3 pl, 0,5 pi en 1,0 pi getoond (figuur 4). Er was een effect van injectievolume zowel op - en b -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 en F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, respectievelijk).
Tenslotte werd 3D-modellering gebruikt om de structuur van zowel bolle of platte blebs visualiseren. Een voorbeeld van een koepelvormige bleb (Figuur 5A) toont een koepelvormige vloeistof gevulde onthechting opgenomen in het scangebied. Voorbeelden van vlakke blebs (Figuur 5B, C) tonen ondiepe vloeistof gevulde gebieden die buiten het gebied van de scan. Bij retinale opsluiting optreedt, wordt een gaatje in de reconstructie gezien (figuur 5C). Kunstmatige grenzen worden getoond op de rand van een scan to laat de reconstructie (figuur 5C). Berekening van de blaar volumes uit deze steekproef injecties gaf aan dat een minimum van 0,15 ui en 0,01 ul succesvol is gericht op de subretinale ruimte voor 0,3 ul injecties resulteert in bolle of platte blebs, respectievelijk. De berekende volume waarschijnlijk geïnjecteerd onderschat de werkelijke volume als gevolg van de resolutie van de beeldvorming en de wederopbouw, resorptie van vloeistof tijdens de procedure zoals bij de mens subretinale injecties, en voor vlakke of koepelvormige blebs bijzonder, indien het gehele detachement niet vertegenwoordigd was in de LGO scans.
Tabel 1. Functionele en structurele effecten van Subretinal injecties door Eye. Metrics van de individuele ogen en de resultaten van subretinale injecties. Retinale reacties op licht (midden netvlies b -waves en fotoreceptor een -waves) en retinale diktemetingen (membraan Bruch om zenuwvezellaag) worden gegeven. voetnoten:
BT = Bleb Type, Flat (F) of Domed (D)
b #gp = aantal raster punten gemeten
* Eyes gebruikt voor de wederopbouw van de injectie volume.
** Alleen 1 rooster punt beschikbaar voor meting bij litteken.
# Ogen met littekenvorming.
| Tijd | koepelvormige Bleb | Flat Bleb | 0,3 pl | 0,5 pl | 1,0 gl | |
| (pm) | (pm) | (pm) | (pm) | (pm) | ||
| Pre-injectie 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Na injectie | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabel 2. Effect van Subretinal Injecties op Total retinadikte. Analyse van de blaar vorm en injectie volume op het netvlies dikte.
| Dikte (urn) | |||||
| plaats | n (ogen) | Pre | 4 wk | Δ | % Δ |
| Retina (alle overeenstemmende punten) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1.9 |
| Retina met alle 9 raster punten * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distale naar Injection * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4.0 |
| Maximale Detachment * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5.0 |
| Injectie zonder Schade * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6.0 |
| Opsluiting in Injection * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Litteken op Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1.6 |
Tabel 3. Effect van schade aan het netvlies structuur. Analyse van de locatie-afhankelijke netvlies dunner. Voetnoten: * Analyse van 10 muizen met gegevens van alle 9 raster punten.
| Vmax (mV) | Koepelvormige (n = 12) | Flat (n = 6) | 0,3 ui (n = 18) | 0,5 ui (n = 8) | 1,0 ui (n = 5) |
| een -waves | |||||
| Pre-injectie | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Na injectie | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Pre-injectie | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Na injectie | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
binnen-page = "1"> T staat 4. Effect van Subretinal Injecties op Scotopic Rod-gemedieerde a - en b -waves. Analyse van de blaar vorm en injectie volume op het netvlies reacties op licht (midden netvlies b -waves en fotoreceptor een -waves).
Figuur 1. Schematische weergave van Subretinal Injection. Een top-down schema van een muis oog in het stopcontact laat de aanpak in traditionele subretinale injecties, met een transcorneal (pijl a) of transcleral (pijl b) injectie bij de pars plana. Deze werkwijze gebruikt een transcleral benadering bij de achterpool (pijl c), verkregen door het roteren van het oog nasaal de achterpool bloot.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De inschrijving van oktober Beelden maakt de identificatie van het netvlies locaties voor Dikte Analysis. AC, gezicht oktober beeld van de muis 1OS in de richting van het origineel en. A) Afbeelding van retina pre-injectie met gesmolten registratie rooster. B) Afbeelding van het netvlies 10 min na de injectie. Een 9-puntraster is opgesteld dat het middelpunt op de plaats van maximale netvliesloslating. Injectieplaats is zichtbaar (pijl). C) Afbeelding van het netvlies 4 weken na de injectie met gesmolten registratie rooster. DE, beelden van de muis 9OS. D) gezicht oktober beeld van de retina 4 weken na injectie laten zien uit te breiden van subretinale onthechting En. E)Overlay van fundus (groen) en een eigen gezicht oktober beelden van het netvlies 10 min na de injectie. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Subretinal Injecties Oorzaak Tijdelijke netvliesloslatingen met Minimal Netvliesdegeneratie Uitdunnen. Representatieve oktober B-scans op de plaats van maximale netvliesloslating worden getoond voor pre-injectie, 10 min na injectie en 4 weken na injectie. A) Vorming en de resolutie van een vlakke blaar van een 0,3 pl injectie. B) Vorming en de resolutie van een koepelvormige blaar van een 0,5 pl injectie. C) de vorming en de resolutie van een koepelvormige blaar van een 1,0 pl injectie. D) Voorbeeld van ernstige choroidal littekens en retinale dunner op de injectieplaats. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. netvliezen Behoud normale functie Na Bleb resolutie. Golfvormen voor scotopisch-rod-gemedieerde reacties worden getoond voor pre-injectie (zwarte lijn) en 4 weken na de injectie (rode stippellijn) voor de A) 0,3 ui, B) 0,5 pi en C) 1,0 ul injecties op 9 verlichting intensiteiten, variërend van 4.37 x 10 -6 tot 0,51 cd / m 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. 3D-reconstructie van blebs. A)-Software gegenereerde 3D-reconstructies van de vertegenwoordiger A) koepelvormige en B, C) platte blebs van 0,3 ul injecties. Ribbels is een artefact van de wederopbouw software. Kunstmatige grenzen werden in C geplaatst om de wederopbouw mogelijk te maken. Schaal bar = 150 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinale injecties zijn de voorkeurswerkwijze voor de afgifte van virale vectoren en stamcellen afgeleide therapie voor het manipuleren fotoreceptoren en RPE zowel fundamenteel onderzoek en klinische behandeling. Bij patiënten, worden subretinale injecties meestal gedaan met een voorste sclerotomie bij de pars plana, een posterior kern vitrectomie en penetratie van het netvlies door de naald met directe visualisatie. Zoals bij de meeste vitrectomie procedures, is het gebruikelijk voor cataract voortijdig plaatsvinden tenzij het oog reeds pseudofaak. Bij muizen worden subretinale injecties traditioneel met de sclerotomie juist voor de retina, een werkwijze vaak geassocieerd met zowel inknippen van de lens, die de meerderheid van de postérieure holte van het oog inneemt en Transretinal penetratie die kunnen leiden tot glasachtige invangen en volledige netvliesloslatingen. Met een postérieure benadering techniek muizen vermindert deze ongewenste gevolgen en verbetert het vermogen om ef interpreterenfecten van de beoogde manipulatie.
Voordelen van de subretinale injectietechniek hier gemeld omvatten minimale structurele of functionele effecten en minder collateral damage (bijv, vertroebeling van de lens knikken, glasvocht lekken of ontsteking) die gemakkelijker evaluatie van de experimentele resultaten en een sneller herstel tijden toestaat. Deze techniek vereist een grotere manipulatie van het oog naar de achterste paal te bereiken, maar kan in ongeveer 10 worden afgerond - 15 min per oog met een hoog slagingspercentage als geen ogen uit de analyse werden verworpen. In de meeste injecties normale retinale structuur en functie werd waargenomen binnen 4 weken. Ter vergelijking, de vorige studies rapporteren 5-8 weken voor het herstel van de structuur en functie of niet melden van een hersteltijd 6,7. Bijgevolg kan experimenten in minder tijd met minder dieren worden ingevuld.
Complicaties van deze subretinale injectietechniek opgenomen vorming en verlies van littekenfotoreceptoren in ongeveer 10% van injecties met slechts drie gevallen van aanzienlijke structurele en functionele gebreken. Het netvlies behouden normale reacties op licht met alleen de grootste litteken dalende functie tot 80% van de fotoreceptor respons en 77% van de binnenste retinale respons vergeleken met pre-injectie. Retinale opsluitingen kan worden gereduceerd met behulp van een nieuwe naald voor elke injectie, hoewel dit niet is geëvalueerd in de huidige studie. Als alternatief kunnen optreden als gevolg van onderdruk en derhalve onvermijdelijk zijn. Opsluitingen komen veel voor in menselijke subretinale injecties echter vanwege de grote omvang van het oog, opsluitingen minder schade aan de retina totale vertegenwoordigen. Dus als een therapeutisch middel was geïnjecteerd, 90% van de geïnjecteerde ogen zou beschikbaar voor het beoordelen van de effecten van deze interventie.
De variabiliteit in retinale diktemetingen voor en na subretinale injectie weerspiegelt de reproduceerbaarheid van tHij oktober instrument op muizen, de precisie van het uitlijnen van het netvlies locaties in afbeeldingen, en retinale veranderingen ten opzichte van injectie van fysiologische zoutoplossing met een lage dosis fluoresceïne kleurstof. Deze metingen kunnen dienen voor onderzoekers in vermogensberekeningen gids voor het aantal ogen en netvlies locaties nodig om statistisch geldige veranderingen als gevolg van subretinale injecties of een therapeutisch middel aanwezig is ingevoerd. In de 10 gevallen waarvoor er 9 roosterpunten in elke retina scans, de variabiliteit van de retinale dikte buiten de injectieplaats (5-8 punten per oog) was 7,2% ± 4,0%, zelfs bij afwezigheid van een toxische of therapeutisch middel of een erfelijke retinale dystrofie. Een dergelijke variabiliteit is een overweging voor het vaststellen van criteria voor de vergelijking van de klinische resultaten met behulp van muismodellen voor subretinale behandelingen, en suggereert sterk dat de nodige controles omvatten subretinale injectie van het voertuig in plaats van een niet-geïnjecteerde oog 3. Tot slot raden we onderzATORS tal van oktober scans van meerdere netvlies regio's te doen voor de injectie om de dekking van de injectieplaats in alle scans verbeteren.
De therapeutische werking zal waarschijnlijk worden bereikt wanneer experimentele middelen om een grotere uitgestrektheid van het netvlies worden geleverd. In deze gevallen grotere hoeveelheden zijn ideaal, maar niet te verschuiven als 0,3 gl injecties vaak gevormd plat blebs dat een groot netvlies te behandelen oppervlak. De blaar vorm was niet controleerbaar, hoewel grotere injectie volumes meer koepelvormige blebs geproduceerd. Tot 1 gl kunnen worden geïnjecteerd zonder negatieve resultaten, is het echter mogelijk dat koepelvormig blebs zo uitgebreid geworden dat het netvlies raakt en zich aan het achterste kapsel van de lens, vooral bij jonge muizen met lage glasachtige volumes. Ondanks het geleverde volume van de spuit, is de werkelijke volume gericht op de subretinale ruimte berekend minder. Dit kan het volume dat niet in de LGO scans wordt verworven, met name voor koepelvormige of f weerspiegelenlat blebs, of een artefact van het LGO-scan en de daaropvolgende wederopbouw, maar kan het volume verlies uit terugvloeien bij het terugtrekken van de naald te weerspiegelen.
Kortom, met een achterste benadering voor subretinale injecties heeft minder complicaties en verbeterde herstel, resulterend in een hoog slagingspercentage van targeting en lage uitsluiting. Deze techniek is geschikt voor virale, farmacologische en cellulaire manipulaties van knaagdieren netvliezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
