Abstract
injections sous-rétiniens ont été utilisées avec succès chez les humains et les rongeurs pour fournir des interventions thérapeutiques des protéines, des agents viraux et les cellules du interphotorécepteur / compartiment sous-rétinien qui a une exposition directe à photorécepteurs et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). injections sous-rétiniens de plasminogène ainsi que des essais précliniques et cliniques récentes ont démontré la sécurité et / ou l'efficacité de la prestation des vecteurs viraux et des cellules souches à des personnes ayant une maladie rétinienne avancé. Des modèles murins de maladie de la rétine, en particulier héréditaire de la rétine dystrophies, sont essentielles pour tester ces thérapies. La procédure d'injection la plus courante chez les rongeurs est d'utiliser petite transcornéenne ou incisions transclérale avec une approche antérieure à la rétine. Avec cette approche, l'aiguille d'injection pénètre dans la rétine neurosensorielle perturber le RPE sous-jacente et à l'insertion peut facilement nick la lentille, ce qui provoque l'opacification du cristallin et la dépréciation des imagi non invasiveng. Accès à l'espace sous-rétinien via un transclérale, approche postérieure évite ces problèmes: l'aiguille traverse la sclérotique environ 0,5 mm du nerf optique, sans pénétration de la rétine et évite de perturber le vitré. Les dommages collatéraux est limitée à celle associée à la sclérotomie focale et les effets d'un transitoire, décollement de la rétine séreux. La simplicité de la méthode minimise des lésions oculaires, assure réapplication de la rétine rapide et la récupération, et a un faible taux d'échec. Le minimum de dommages à la rétine et RPE permet une évaluation précise de l'efficacité et les effets directs des agents thérapeutiques eux-mêmes. Ce manuscrit décrit une nouvelle technique d'injection sous-rétinienne qui peut être utilisé pour cibler des vecteurs viraux, des agents pharmacologiques, les cellules souches ou de cellules souches pluripotentes induites (iPS) à l'espace sous-rétinien chez des souris avec une grande efficacité, un minimum de dommages, et une récupération rapide.
Introduction
Injections sous - rétiniens sont les principaux moyens de délivrer des agents cellulaires et viraux aux rétines de souris pour étudier leurs effets sur les photorécepteurs et l'EPR sous - jacente 1,2. La plupart des protocoles d'injection sous - rétinienne chez les souris utilisent un transcornéen ou d' un site d'injection transclérale antérieure à l'équateur (figure 1). Cette approche peut entraîner des dommages collatéraux inhérents qui comprend entailler et opacification résultante de la lentille, la perturbation de l'intégrité du corps vitré, la pénétration de la rétine neurosensorielle et de l' iris, hémorragie rétinienne, décollement de la rétine substantielles et durables œdème sous - rétinien 3-9. Les manipulations expérimentales doivent surmonter ces effets afin d'évaluer les effets des interventions thérapeutiques 3,7,10,11. Cette étude fournit une description détaillée et validation d'une méthode d'injection transclérale postérieure qui évite ces complications, minimise les traumatismes et a un taux de réussite élevé de cibler le sousl'espace de la rétine.
Injections ciblant l'espace sous - rétinien chez les souris sont souvent très difficiles à réaliser et la plupart des chercheurs se heurtent à une fréquence élevée de tentatives infructueuses dans lequel le vecteur est livré à un emplacement incorrect ou il y a des lésions rétiniennes importantes, par exemple dans un décollement de la rétine complète 6. Le nombre d'yeux exclus de l'analyse en raison de complications d'injection est généralement pas signalé dans les études de la souris, mais dans notre propre expérience et en discussion avec d'autres chercheurs, le nombre d'injections échoué peut être aussi élevé que 50% et varier en fonction de l'expérience et capacités de l'enquêteur qui effectue les injections. Le succès de l'injection est généralement évaluée par imagerie rétinienne directe et / ou tomographie par cohérence optique (OCT) 7,9. Une méthode facile à maîtriser avec des taux de réussite élevés pour les injections sous-rétiniens chez les souris peut accélérer l'expérimentation et de réduire le coût des études précliniques de treatments pour les maladies rétiniennes qui sont les principales causes de cécité aux Etats-Unis.
Le postérieur, transclérale technique d'injection sous - rétinien décrite ici est une adaptation de protocoles cliniques et précliniques 9,12. Les évaluations diagnostiques non invasives réalisées chez des souris injectées démontrent des dommages doux et très localisée et manquent de lentille supplémentaire de garantie, d'une blessure rétinienne et RPE. En outre, avec relativement peu de pratique, un expérimentateur peut atteindre ces résultats avec un taux de réussite élevé (80 - 90% ou plus), réduisant ainsi les coûts associés à ces études. Cette procédure peut être utilisée pour délivrer des interventions thérapeutiques cellulaires, virales ou pharmacologiques à photorécepteurs et / ou EPR dans des études précliniques et d'évaluer facilement les interventions expérimentales.
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Protocol
Animaux: de type sauvage souris C57BL / 6J élevés à l'Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Tous les animaux étaient âgés de 11 - de 17 semaines et inclus souris mâles et femelles. Toutes les souris étaient groupe logé, maintenu dans un cycle d' obscurité 12h12 lumière / avec de la nourriture et de l' eau ad libitum. Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives institutionnelles de l'UCLA et de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie Déclaration pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research.
NOTE: Tous les médicaments et les agents injectables sont United States Pharmacopeia (USP).
1. Préparation chirurgicale
- Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg / kg de kétamine et de 8 mg / kg de xylazine dans un mélange de solution saline. L'anesthésie à une profondeur telle que la souris n'a pas de pincement de l'orteil ou des réflexes de contact de la cornée.
- Maintenir la température du corps à 37,0 ° C avec un tampon d'eau en circulation.
- Dilater élèves avec 2,5% phényléphrine oeil drops et tailler les moustaches pour faciliter la visualisation. Moustaches fournissent l'entrée sensorielle significative à la souris, donc, moustache rognage devrait enlever seulement la partie qui bloque l'accès clair à l'œil, et non à la base du cheveu. Dans notre expérience, les souris montrent la récupération normale après cette procédure. Appliquer des gouttes oculaires méthylcellulose pour prévenir la sécheresse et minimiser anesthésiants cataracte transitoire induit 13.
- Stériliser les instruments avant la chirurgie ( par exemple, la bétadine et de l' éthanol ou de perles chaudes).
- Préparer fluorescéine dilué (0,01% en utilisant une solution saline à 0,9%) dans un environnement stérile (c. -à- biosécurité armoire) si la visualisation sera effectuée (voir la section 3 ci - dessous).
2. Injection Préparation du site
- Préparer une seringue (par exemple, 5 pi de seringue) avec le volume approprié d'injection (par exemple, de 0,3 à 1,0 pi).
- Placez la souris afin que l'œil est orienté vers le haut et clairement visible dans le dissecting microscope.
- Pincez doucement la conjonctive temporelle avec pince fine à bout. Faire une incision circonférentielle d'environ 90 degrés à l'aide des ciseaux Vannas incurvées.
- Répétez l'étape 2.3 avec la capsule de Tenon sous-jacente.
- Réséquer le tissu conjonctif environnant avec pince fine à bout tout en faisant tourner le globe par voie nasale. Travailler vers le site d'injection d'environ 0,5 mm temporelle du nerf optique. Utilisez un grand soin pour éviter de perturber le sinus rétro-orbital.
3. sclérotomie et sous-rétinienne Injection
NOTE: Il est recommandé que l'injection de 0,01% de fluorescéine dans 0,9% Saline être utilisé pour aider à la visualisation, tout en apprenant cette procédure. La répartition topographique de la fluorescéine peut être efficacement documenté avec l'imagerie rétinienne (voir la section 4 ci-dessous).
- Faire une petite incision scléral sur le site d'injection en grattant doucement l'œilleton avec une lame ophtalmique 22,5 degrés. Cette shou incisionld seulement être suffisamment grand pour permettre à la pointe de l'aiguille de passer à travers la sclérotique.
- Insérez le 33 aiguille G biseauté (angle 5 -. 10 ° dans le sclérotomie avec le biseau orienté et incliné parallèlement à la rétine Injecter volume désiré (par exemple, 0,3 à 1,0 pi de 0,01% fluorescéine à des fins d'apprentissage).
NOTE: maintenir la stérilité de la seringue en nettoyant soigneusement avec des lavages successifs d'un solvant approprié et de l'eau déminéralisée avant chaque injection. - Enfoncer le piston lentement (~ 3 sec) sans bouger l'aiguille et avec une pression.
REMARQUE: Lorsque l'aiguille est dans l'espace sous-rétinien, une légère résistance se fera sentir tout en appuyant sur le piston. Il n'y aura pas de résistance minimale si l'aiguille perce la rétine, et une résistance élevée si l'aiguille ne pénètre pas la sclérotique ou RPE. - Attendez quelques secondes avant de retirer l'aiguille pour minimiser le reflux.
- Rincer l'oeil avec une solution saline stérile tamponnée et veiller à l'oeil hcomme tourné dans sa position normale.
4. Évaluation du décollement de la rétine par PTOM et Fundus Imaging
- Effectuer l'imagerie octobre immédiatement après l'injection pour évaluer la qualité de l'injection et au moment approprié pointe post-injection nécessaire pour évaluer la structure de la rétine.
NOTE: Des exemples de l'utilisation de l' OCT dans des études similaires ont été décrits précédemment 7,14.- Ajuster et aligner l'image OPO pour cibler le site d'injection. Le site d'injection doit être la ligne médiane et 0,5 mm temporelle à la tête du nerf optique. Répéter au besoin si le détachement est hors du cadre ou non de manière optimale centrée.
- Visualisez décollement de la rétine et le colorant zone d'injection avec en face fundus imagerie 7,14.
NOTE: Si un système d'imagerie OCT pas disponible, l'injection d'une petite quantité de fluorescéine avec un vecteur pour la pratique permettra la visualisation avec tout appareil photo rétinienne qui effectue fluorescéine angioGraphie en utilisant les mêmes longueurs d'onde d'excitation et de filtres de blocage. zones localisées de l'hyper-fluorescence apparaîtront sous la vascularisation et la vascularisation auront des limites nettes et distinctes si l'espace sous-rétinien est ciblée correctement. Le bord de la bulle à partir de l'injection sera délimité par le passage de l'hyper- à fluorescence hypo. Plusieurs instruments offrent cette possibilité pour la souris; l'instrumentation utilisée ici est décrit ailleurs 14.
Soins 5. post-opératoire
- Appliquer une couche épaisse de crème ophtalmique antibiotique triple à la surface de la cornée de l'œil injecté.
- Placez la souris dans des cages propres solitaires pour la récupération. Ne pas combiner les souris qui ont subi une chirurgie jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis.
- Surveiller la respiration et de la température lors de la récupération d'anesthésie. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils puissent maintenir décubitus sternale.
- Effectuer le suivi post-opératoire appropriée supplémentaireet le traitement, y compris une injection sous-cutanée de carprofène (5 mg / kg) pour le traitement de la douleur post-chirurgicale.
6. Évaluation de la fonction rétinienne par Électrorétinographie (ERG)
- Effectuer une analyse ERG pré-injection et à des moments appropriés post-injection nécessaire pour évaluer la fonction rétinienne. Si l'injection a été faite dans l'espace sous-rétinien, le décollement de la rétine devrait résoudre dans les 72 heures.
- Utiliser des techniques ERG standard pour évaluer la fonction rétinienne avant et après l' injection comme décrit précédemment 14,15.
7. Reconstruction 3D et Bleb Volume Quantification
NOTE: octobre balayages avec un contraste élevé englobant tout le détachement dans le cadre de vue sont optimales pour l'utilisation. ImageJ / Fidji 17,18 et Imaris ont été utilisés, mais d' autres logiciels peuvent être utilisés.
- Export de la b-scan d'intérêt, l'importation à ImageJ / Fidji et culture (Image> Crop) la partie de la sc octobreun à modéliser en utilisant l'outil de sélection rectangulaire.
- Réglez le contraste (Image> Réglages> Luminosité / Contraste) et de délimiter des frontières manquantes en reliant deux sections avec une ligne.
- Tracer une ligne droite avec le (changement de portefeuille) outil de ligne qui enjambe la RPE à la couche des photorécepteurs. Mesure (Analyse> Mesure) la longueur de la ligne pour obtenir la taille de détachement maximale pour l'étape 7.8.
- Importation recadrée cadres au logiciel 3D-reconstruction (voir le tableau des matériaux) en utilisant le "RVB à Gray" plug-in et MATLAB Compiler Runtime.
- Définissez la taille de voxel (sous Propriétés de l'image) en utilisant les paramètres d'étalonnage de l'analyse OCT (x, y, z).
- Exécuter le plugin "RGB Gray" (sous Propriétés de l'image), avec une pondération égale à chaque canal, pour créer un quatrième canal. Supprimer les canaux Rouge-Vert-Bleu d'origine.
- Inversez le canal gris en utilisant le changement de contraste. Magasin Image.
- Cliquez sur le "ajouter unsurface de ew "bouton dans l'onglet Vue 3D, et commencer le processus de 4 étapes guidée de la création de la surface.
- Réglez le niveau de détail de surface (étape 1 de 4).
NOTE: Dans notre expérience à 12,0 était 8,0 la gamme la plus efficace. - Définissez la taille maximale de la sphère (sous Sélection de base) à un peu moins que la taille de détachement maximale mesurée en 7.1.2. Créer la surface et défaire une inversion de canal gris (étape 2 de 4).
- Fixer le seuil à la valeur maximale de sorte que la surface des espaces négatifs à l'extérieur de la rétine et le détachement ne viennent pas en contact (étape 3 de 4).
- Définissez le type de filtre pour le nombre de voxels et isoler l'espace négatif dans le site de détachement par taille. Terminez la surface (étape 4 de 4).
NOTE: Le volume de la surface de décollement est situé sous le volume dans l'onglet des statistiques.
- Réglez le niveau de détail de surface (étape 1 de 4).
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Representative Results
Des injections sous-rétiniennes Postérieur approche transclérale ont été effectuées sur 31 des yeux sains de 16 souris de type sauvage avec des injections de 0,3 pi (n = 18), 0,5 pi (n = 8) et 1,0 pi (n = 5), 0,01% de fluorescéine. Un œil a été exclu de l'injection en raison d'une opacification de la cornée préexistante qui empêchait une analyse structurelle et fonctionnelle. Chaque oeil injecté est inclus dans le présent rapport. Aucun décollement de la rétine non désirées, les crevaisons de la rétine neurosensorielle, ou une fuite dans le corps vitré ont été détectés ni était une preuve de la lentille entaillage, des réponses inflammatoires, l'uvéite, ou des infections post-chirurgicales dans tous les yeux observés.
La structure rétinienne a été évaluée de pré-injection, 10 min après l'injection et 4 semaines après l'injection en utilisant l' imagerie OCT (figures 2 et 3). Une grille de 9 points, avec le point central recouvrant le centre de détachement maximale, a été placée sur le 10-minpost-injection en scan du visage (figure 2B). Utilisation des repères vasculaires, pré-injection et les analyses post-injection de 4 semaines ont été mis en rotation pour être en concordance avec l'analyse post-injection de 10 minutes. Ceci a permis l' identification d'exactement les mêmes endroits dans injection scans rétiniens avant et après (figure 2A, C).
Injections sous - rétiniens ont abouti à la formation de vésicules qui a été centrée loin du site d'injection où l'aiguille est entrée l'espace sous - rétinien (figure 2B flèche), et étaient soit à plat (figure 3A) avec un détachement peu profond étirement sur une zone étendue ou bombé (figure 3B - D) avec un profond détachement dans une zone contrainte (tableau 1). Une bulle en forme de dôme a été défini comme un détachement qui a dépassé 50 pm orthogonale à la RPE. Aucun rosettes, un motif ondulé produit par étirement des couches rétiniennes externes, ont été observées. Le EXtente de dépôt d'injection a été visualisé avec en face à OCT (figure 2D, ligne pointillée), l' imagerie rétinienne fluorescéine (figure 2F) et OCT B-Scans (figure 3). La majorité des bulles (29 sur 31) prolongée au-delà du champ de vision des scans OCT, qui couvrent environ 10% de la rétine de souris. Il n'y avait pas de contrôle sur la forme de bleb autre que la fréquence accrue des bulles en forme de dôme avec de plus grands volumes d'injection (tableau 1). Tous les blebs résolus par les 2 semaines (données non présentées).
Épaisseur de la rétine (membrane de Bruch à la couche de fibres nerveuses) Total a été évaluée quantitativement 4 semaines après l' injection de 0,3 pi (figure 3A), 0,5 pi (figure 3B) et 1,0 ul (figure 3C) des volumes d'injection à chaque point de la grille présente dans b-Scans correspondant (tableau 1). La différence de pour cent (% en Δ) wcalculé comme étant la différence par rapport aux mesures de pré-injection pour les deux métriques structurelles et fonctionnelles. Pas tous les points de la grille ont été acquises au cours de toutes les séances d'imagerie. Par exemple, 3 yeux avaient 1 ou 2 points, 4 yeux avaient 3 ou 4 points, et 23 yeux avaient 5 à 9 points de toutes les analyses. Volumes bombés et blebs plats, et d' injection ont été regroupées depuis l' épaisseur rétinienne totale n'a pas été significativement différent pour pré et post-injections, même si une tendance générale à l' amincissement de la rétine a été observée pour les deux (tableau 2).
Une analyse plus poussée a montré faible mais statistiquement significative amincissement de 6,5% ± 1,9 globale (pré = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (tableau 3). Pour déterminer où l'amincissement de la rétine est survenue, un sous-ensemble de 10 yeux qui contenait des mesures d'épaisseur pour les 9 points de la grille a été analysée. Semblable à l'analyse pour tous les yeux, lasous - ensemble des yeux a également montré faible mais significative éclaircie rétinienne globale (10,3% ± 3,5, pré = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). Aucun amincissement de la rétine n'a été observée au niveau des sites distaux du site d'injection (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11). Amincissement rétinienne a été observée sur le site de décollement de la rétine maximale (11,2% ± 5,0, pré = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), le site d'injection sans dommage (13,8 ± 6,0, pré = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), les sites d'injection avec l' incarcération rétinienne quand une petite région de la rétine est tiré à travers la sclérotique au moment du retrait de l' aiguille (14,1% ± 1,0, pré = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) et d' injection des sites avec des cicatrices (26,5% ± 1,6, pré = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). Au total, les incarcérations ont eu lieu dans 14 des 31 injections, dont 3 ont abouti à la formation de cicatrices de la choroïde avec une perte de près de la moitié des couches rétiniennes externes (Figure 3E). Dans chaque cas, cependant, ce sont des effets très localisés.
Plein champ électrorétinogramme a été réalisée avant l'injection et répété 4 semaines après l' injection avec des changements relatifs évalués individuellement pour chaque œil pour évaluer les altérations fonctionnelles (tableau 1). Seulement adaptés à l'obscurité et les réponses de la tige à médiation ont été enregistrées. Fonctions de réponse d'intensité ont été équipées avec des équations de Michaelis-Menten pour dériver Vmax pour les deux photorécepteurs (un -waves) et la rétine centrale (b de -waves). Les réponses ne sont pas affectées par la forme de vésicules et ont donc été effondrés (tableau 4). Il y avait une petite mais statistiquement significative diminution de la Vmax surun -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013) , mais pas b -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) après l' injection (tableau 4). Formes d' onde représentatives pour pré et post-injection de 0,3 pi, 0,5 pi et 1,0 pi sont représentés (figure 4). Il y avait un effet de volume d'injection sur deux a - b et -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 et F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, respectivement).
Enfin, la modélisation 3D a été utilisé pour visualiser la structure des deux blebs bombées et plates. Un exemple d'une bulle en forme de dôme (figure 5A) montre un détachement rempli de fluide en forme de dôme contenu dans la zone de balayage. Des exemples de blebs plats (figure 5B, C) montrent des zones remplies de liquide peu profondes qui vont au - delà de la région de l'analyse. Lorsque l' incarcération rétinienne se produit, un petit trou dans la reconstruction est vu (Figure 5C). frontières artificielles sont présentés au bord d'un balayage to permettre la reconstruction (Figure 5C). Calcul des volumes de blebs à partir de ces échantillons a indiqué que les injections d'un minimum de 0,15 et 0,01 ul ul a été ciblé avec succès à l'espace sous-rétinien pour préparations injectables 0,3 ul entraînant blebs bombés ou plats, respectivement. Le volume calculé injecté probablement sous-estime le volume réel en raison de la résolution de l'imagerie et de la reconstruction, la résorption du liquide pendant la procédure comme cela se produit dans les injections sous-rétiniennes humaines, et pour blebs plates ou bombées en particulier, si l'ensemble du détachement n'a pas été représenté dans les scans OCT.
Tableau 1. Effets fonctionnels et structurels de sous - rétiniens Injections par Eye. Metrics des yeux et de leurs résultats des injections sous-rétiniens. Réponses rétiniennes à la lumière (rétine milieu b -waves et photorécepteur un -waves) et l'épaisseur de la rétine (mesures de la membrane de Bruch pour nerf couche de fibres) sont donnés. Notes:
un type BT = Bleb, plat (F) ou Bombé (D)
b #gp = nombre de points de grille mesurée
* Les yeux utilisés pour la reconstruction du volume d'injection.
** Seulement 1 point disponible pour les mesures à la cicatrice de la grille.
# Les yeux avec la formation de cicatrices.
| Temps | bombé Bleb | Bleb Flat | 0,3 pi | 0,5 ul | 1,0 ul | |
| (pm) | (pm) | (pm) | (pm) | (pm) | ||
| Préinjection 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Post-injection | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tableau 2. Effet de sous - rétiniens Injections sur Epaisseur totale rétinienne. L'analyse de la forme de vésicules et le volume d'injection sur l'épaisseur rétinienne.
| Épaisseur (pm) | |||||
| Site | n (yeux) | Pré | 4 sem | Δ | % Δ |
| Retina (tous les points concordant) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina avec les 9 points de la grille * | dix | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distal à Injection * | dix | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| Détachement Maximal * | dix | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11.2 ± 5.0 |
| Injection sans dommages * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13.8 ± 6.0 |
| Incarcération à Injection * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14.1 ± 1.0 |
| Scar à Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Tableau 3. Effet des dommages sur la structure rétinienne. Analyse d'un site dépendant amincissement de la rétine. Notes: * L' analyse de 10 souris avec des données provenant de tous les 9 points de grille.
| Vmax (uV) | Bombé (n = 12) | Flat (n = 6) | 0,3 pi (n = 18) | 0,5 pi (n = 8) | 1,0 pi (n = 5) |
| un -waves | |||||
| Préinjection | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Post-injection | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Préinjection | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Post-injection | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
dans les pages = "1"> T en mesure 4. Effet de la sous - rétinienne Injections sur scotopique Rod-médiation a - et b -waves. L' analyse de la forme de vésicules et le volume d'injection sur les réponses de la rétine à la lumière (rétine milieu b -waves et photorécepteur un -waves).
Figure 1. Représentation schématique du sous - rétinienne Injection. Un schéma de haut en bas d'un oeil de la souris dans la douille montre l'approche en injections traditionnelles sous-rétiniens, en utilisant un transcornéenne (flèche a) ou transclérale (flèche b) d'injection à proximité de la pars plana. Cette méthode utilise une approche transclérale près du pôle postérieur (flèche c), obtenu en faisant tourner l'œil par voie nasale pour exposer le pôle postérieur.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Enregistrement des PTOM Images Permet d' identification des sites rétiniennes pour Analyse de l' épaisseur. AC, face à l' image PTOM souris 1OS dans l' orientation originale en. A) Image de pré-injection rétine avec grille d'enregistrement fondu. B) Image de post-injection de 10 min rétine. Une grille de 9 points a été positionné avec le point central sur le site de décollement de la rétine maximale. site d'injection est visible (flèche). C) Image de la rétine 4 semaines après l'injection avec grille d'enregistrement fondu. DE, des images de la souris 9OS. D) face à l' image PTOM rétine 4 semaines post-injection montrant prolonger de détachement sous - rétinien En. E)Superposition de fond (vert) et en visage images OCT de post-injection de 10 min rétine. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Injections sous - rétiniens Parce que temporaire Retinal Détachements avec Minimal Retinal éclaircissage. Représentant OCT B-Scans sur le site de décollement de la rétine maximale sont indiqués pour la pré-injection, 10 min après l'injection et 4 semaines après l'injection. A) Formation et de la résolution d'un bleb plat à partir d' une injection de 0,3 pi. B) Formation et de la résolution d'un bleb bombé d'une injection de 0,5 ul. C) La formation et la résolution d'un bleb bombé d'une injection de 1,0 ul. D) Exemple de cho sévèrecicatrices Roidal et l'amincissement de la rétine au site d'injection. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. rétines Retain Fonction normale Après Bleb Résolution. Waveforms pour les réponses de tige médiée scotopique sont présentés pour la pré-injection (ligne noire) et 4 semaines après l'injection (ligne rouge pointillée) A) 0,3 ul, B) 0,5 pi et C) injections 1,0 pi à 9 intensités d'éclairage allant de 4,37 x 10 -6 à 0,51 cd / m 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. reconstruction 3D de blebs. A) Logiciel généré reconstructions 3D de représentant A) en forme de dôme et B, C) blebs plats à partir des injections de 0,3 ul. Ribbing est un artefact de logiciel de reconstruction. frontières artificielles ont été placés dans C pour permettre la reconstruction. Barre d'échelle = 150 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
injections sous-rétiniens sont la méthode de choix pour la fourniture de vecteurs viraux et de la tige thérapie dérivée des cellules pour manipuler les photorécepteurs et l'EPR dans la recherche fondamentale et le traitement clinique. Chez les patients, des injections sous-rétiniennes sont typiquement réalisées avec une sclérotomie antérieure à la pars plana, une vitrectomie postérieure de base et de pénétration de la rétine par l'aiguille avec la visualisation directe. Comme avec la plupart des procédures de vitrectomie, il est courant pour la formation de la cataracte se produire prématurément à moins que l'oeil est déjà pseudophaque. Chez les souris, des injections sous-rétiniennes sont traditionnellement réalisées avec la sclérotomie antérieurement à la rétine, une méthode fréquemment associée à la fois entaillage de la lentille, qui occupe la majeure partie de la cavité postérieure de l'oeil, et la pénétration Transretinal qui peut conduire à une occlusion vitreuse et complète décollement de la rétine. En utilisant une technique postérieure-approche chez des souris réduit ces conséquences indésirables et améliore la capacité d'interpréter effets de la manipulation prévue.
Avantages de la technique d'injection sous - rétinien rapportés ici comprennent des effets structurels ou fonctionnels minimes et les dommages collatéraux réduite (par exemple, opacification du cristallin entaillage, fuite vitreux ou inflammation) qui permet d' évaluer plus facilement des résultats expérimentaux et plus rapides les temps de récupération. Cette technique nécessite une plus grande manipulation de l'œil pour atteindre le pôle postérieur, mais peut être complété en environ 10 - 15 min par oeil avec un taux de réussite élevé que sans yeux ont été rejetés de l'analyse. Dans la plupart des injections, la structure et la fonction rétinienne normale a été observée dans les 4 semaines. Par comparaison, les études antérieures rapportent 5 - 8 semaines pour la récupération de la structure et de la fonction ou ne signalent pas un temps de récupération 6,7. Par conséquent, les expériences peuvent être effectuées en moins de temps avec moins d'animaux.
Les complications de cette technique d'injection sous-rétinien inclus la formation de cicatrices et la perte dephotorécepteurs dans environ 10% des injections, avec seulement trois cas de déficits structurels et fonctionnels importants. La rétine a retenu les réponses normales à la lumière avec seulement la plus grande cicatrice fonction décroissante à 80% de la réponse des photorécepteurs et 77% de la réponse rétinienne intérieure par rapport à pré-injection. incarcérations rétiniennes pourraient être réduites avec l'utilisation d'une nouvelle aiguille pour chaque injection, bien que cela n'a pas été évaluée dans l'étude actuelle. Alternativement, ils peuvent se produire en raison de la pression négative et donc être inévitable. Incarcérations sont très fréquents dans les injections sous-rétiniennes humaines, cependant, en raison de la grande taille de l'œil, les incarcérations représentent moins de dommages à la rétine totale. Par conséquent, si un agent thérapeutique a été injecté, 90% des yeux injectés serait disponible pour l'évaluation des effets de cette intervention.
La variabilité des mesures de l'épaisseur de la rétine avant et après injection sous-rétinienne reflète la reproductibilité des til octobre instrument sur la souris, la précision de l'alignement des emplacements de la rétine à travers des images et des altérations de la rétine de l'injection de sérum physiologique avec une faible dose de colorant à la fluorescéine. Ces mesures peuvent servir à guider les enquêteurs dans les calculs de puissance pour le nombre d'yeux et les emplacements rétiniens nécessaires pour détecter les changements statistiquement valides à la suite d'injections sous-rétiniens si oui ou non un agent thérapeutique est présent. Dans les 10 cas pour lesquels il y avait 9 points de grille dans tous les balayages de la rétine, la variabilité de l'épaisseur de la rétine en dehors du site d'injection (5 - 8 points par oeil) était de 7,2% ± 4,0%, même en l'absence d'une substance toxique ou l'agent thérapeutique ou une dystrophie rétinienne héréditaire. Cette variabilité est une considération pour l' établissement de critères pour la comparaison des résultats cliniques en utilisant des modèles de souris pour les traitements sous - rétiniens, et suggère fortement que les contrôles appropriés comprennent l' injection sous - rétinienne du véhicule plutôt que d' un oeil non injecté 3. Enfin, nous encourageons investigateurs à faire de nombreux scans OCT de plusieurs régions de la rétine avant l'injection pour améliorer la couverture du site d'injection dans toutes les analyses.
L'efficacité thérapeutique sera probablement obtenu lorsque les agents expérimentaux sont livrés à une plus grande étendue de la rétine. Dans ces cas, des volumes plus importants sont idéales, mais peuvent ne pas être nécessaire que 0,3 injections ul souvent formés blebs plats qui couvraient une grande surface de la rétine. La forme de bulle était pas contrôlable, bien que de plus grands volumes d'injection produits blebs plus bombées. Jusqu'à 1 pi peut être injecté sans résultats négatifs, cependant, il est possible que des bulles en forme de dôme deviennent si étendues que les touches de la rétine et adhère à la capsule postérieure du cristallin, en particulier chez les jeunes souris avec de faibles volumes vitreux. Malgré le volume délivré par la seringue, le volume réel ciblé vers l'espace sous-rétinien est calculée pour être inférieure. Cela peut refléter le volume qui ne sont pas acquis dans les analyses des PTOM, en particulier pour dôme ou fblebs lat, ou un artefact de l'analyse octobre et la reconstruction, mais peuvent refléter la perte de volume de refoulement au moment du retrait de l'aiguille.
En résumé, en utilisant une approche postérieure pour les injections sous-rétiniens a moins de complications et récupération améliorée, ce qui entraîne un taux de réussite élevé de ciblage et un faible taux d'exclusion. Cette technique est idéale pour les manipulations viraux, pharmacologiques et cellulaires de rétines de rongeurs.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
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