Abstract
injecções sub-retiniano têm sido utilizados com sucesso em humanos e roedores, para realizar intervenções terapêuticas de proteínas, agentes virais, e células para o compartimento interfotoreceptor / sub-retiniano que tem exposição directa à fotorreceptores e epitélio pigmentado da retina (RPE). injecções sub-retiniana de plasminogénio bem como recentes ensaios pré-clínicos e clínicos demonstraram segurança e / ou eficácia de entrega de vectores virais e das células estaminais para indivíduos com doença da retina avançada. modelos de rato da doença da retina, particularmente distrofias da retina hereditária, são essenciais para testar estas terapias. O processo de injecção mais comum em roedores é a utilização de pequenas incisões ou transcorneano transcleral com uma abordagem anterior para a retina. Com esta abordagem, a agulha de injecção penetra a retina neurosensorial perturbar o RPE subjacente e na inserção pode facilmente cortar a lente, fazendo com que a opacificação da lente e comprometimento da Imagi não invasivang. Aceder ao espaço sub-retiniano através de uma transcleral, abordagem posterior evita estes problemas: a agulha atravessa a esclera cerca de 0,5 mm a partir do nervo óptico, retina, sem penetração e evita perturbar o vítreo. Os danos colaterais é limitada a essa associada com a esclerotomia focal e os efeitos de um transiente, descolamento seroso da retina. A simplicidade do método minimiza a lesão ocular, descolamento de retina assegura uma rápida e recuperação, e tem uma taxa de falha baixa. O mínimo de danos na retina e EPR permite a avaliação clara da eficácia e dos efeitos directos dos próprios agentes terapêuticos. Este manuscrito descreve uma nova técnica de injecção sub-retinal, que pode ser utilizado para alvejar vectores virais, agentes farmacológicos, as células estaminais ou células estaminais pluripotentes induzidas (IPS) para o espaço sub-retiniano em ratos com uma elevada eficácia, danos mínimos, e rápida recuperação.
Introduction
Injecções sub-retiniana são o principal meio de entrega de agentes celulares e virais para as retinas de ratos para estudar seus efeitos sobre fotorreceptores e EPR subjacente a 1,2. A maioria dos protocolos de injecção subretinal em ratinhos usar um transcorneano ou um local de injecção anterior transcleral ao equador (Figura 1). Esta abordagem pode resultar em danos colaterais inerente que inclui nicking e turvação resultante da lente, perturbação da integridade do vítreo, a penetração da retina neurosensorial e íris, hemorragia da retina, descolamento da retina e o edema substanciais sub-retiniano duradoura 3-9. Manipulações experimentais devem superar estes efeitos, a fim de avaliar os efeitos de intervenções terapêuticas 3,7,10,11. Este estudo fornece uma descrição detalhada e validação de um método de injeção transcleral posterior que evita estas complicações, minimiza o trauma e tem uma elevada taxa de sucesso de alvejar o subespaço da retina.
Injeções orientadas para o espaço sub-retiniano em ratos são muitas vezes muito difícil de realizar e a maioria dos investigadores encontram uma elevada frequência de tentativas falhadas em que o vector é entregue a um local incorreto ou se houver danos na retina significativo, por exemplo, em um descolamento de retina completa 6. O número de olhos excluídas da análise por causa de complicações de injeção normalmente não consta em estudos com ratos, mas em nossa própria experiência e em discussão com outros investigadores, o número de injeções falhou pode ser tão alta quanto 50% e variam dependendo da experiência e capacidades do investigador que está realizando as injeções. O êxito da injecção é tipicamente avaliada por imagiologia fundus directa e / ou tomografia de coerência óptica (OCT) 7,9. Um método facilmente dominado com altas taxas de sucesso para injecções sub-retinianas em ratos pode acelerar a experimentação e reduzir o custo dos estudos pré-clínicos de treatments para doenças da retina que são as principais causas de cegueira nos Estados Unidos.
O posterior, técnica de injeção sub-retiniana transcleral aqui descrito é uma adaptação de protocolos clínicos e pré-clínicos 9,12. Os diagnósticos não invasivos realizados em camundongos injetados demonstrar danos leves e altamente localizada e falta de lentes de garantia adicional, lesão da retina e EPR. Além disso, com relativamente pouco prática, um experimentador pode conseguir esses resultados com uma taxa de sucesso alta (80 - 90% ou mais), reduzindo assim os custos associados a esses estudos. Este procedimento pode ser usado para entregar intervenções terapêuticas celulares, virais, ou farmacológicos para fotorreceptores e / ou RPE em estudos pré-clínicos e facilmente avaliar intervenções experimentais.
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Protocol
Animais: tipo selvagem camundongos C57BL / 6J criados na Universidade da Califórnia em Los Angeles (UCLA). Todos os animais tinham entre 11-17 semanas de idade, e incluiu ratos machos e fêmeas. Todos os ratos foram alojados em grupo, mantidos em um ciclo de luz 12:12 / escuro com comida e água ad libitum. Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações institucionais da UCLA e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research.
NOTA: Todas as drogas e agentes injetáveis são United States Pharmacopeia grau (USP).
1. Preparação cirúrgica
- Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e de 8 mg / kg de xilazina em uma mistura de solução salina. Administrar anestesia a uma profundidade tal que o rato não tem qualquer aperto do dedo do pé ou reflexos de toque da córnea.
- Manter a temperatura corporal a 37,0 ° C com uma almofada de água circulante.
- Dilatar os alunos com 2,5% de fenilefrina olho dROPS e aparar bigodes para facilitar a visualização. Suiças fornecer entrada sensorial significativa para o rato, por conseguinte, suiça aparar só deve remover a porção que bloqueia o acesso desobstruído para o olho, e não para a base da caixa de bigodes. Em nossa experiência, os ratos mostram recuperação normal após este procedimento. Aplicar olho metilcelulose cai para prevenir o ressecamento e minimizar anestésicos induzidas catarata transitória 13.
- Esterilizar instrumentos antes da cirurgia (ou seja, betadine e etanol ou esferas de ferro).
- Prepare fluoresceína diluído (0,01% utilizando solução salina 0,9%) em um ambiente estéril (isto é, cabine de segurança biológica), se a visualização será realizada (ver secção 3 abaixo).
2. Injeção Preparação do Site
- Prepara-se uma seringa (por exemplo, seringa de 5 mL) com o volume adequado de injecção (por exemplo, 0,3 a 1,0 mL).
- Posicione o mouse para que o olho é voltado para cima e claramente visível no dissecting microscópio.
- Aperte suavemente a conjuntiva temporal com uma pinça de ponta fina. Faça uma incisão circular de aproximadamente 90 graus usando curvas tesouras Vannas.
- Repita o passo 2.3 com a cápsula de Tenon subjacente.
- Ressecção do tecido conjuntivo circundante com uma pinça de ponta fina enquanto gira o globo por via nasal. Trabalhar para o local de injecção de aproximadamente 0,5 milímetros temporal com o nervo óptico. Use muito cuidado para evitar a interrupção do seio retro-orbital.
3. esclerotomias e sub-retiniana Injection
NOTA: Recomenda-se que a injecção de 0,01% de fluoresceína em 0,9% de solução salina ser utilizados para auxiliar na visualização enquanto aprende este procedimento. A distribuição topográfica da fluoresceína pode ser efetivamente documentada com imagens de fundo de olho (ver secção 4).
- Fazer uma pequena incisão da esclerótica no local da injecção por raspagem suave a ocular com uma lâmina oftálmica 22,5 graus. Este shou incisãoúnica ld ser grande o suficiente para permitir que a ponta da agulha passe através da esclerótica.
- Insira o chanfrada 33 agulha G (dobrado. 5 - 10 ° para o esclerotomia com o bisel voltado e paralela angular para a retina Injectar volume desejado (por exemplo, 0,3 a 1,0 l de 0,01% Fluoresceína para fins de aprendizagem).
NOTA: manter a esterilidade da seringa através da limpeza cuidadosamente com lavagens sucessivas de um solvente adequado e água desionizada antes de cada injecção. - Empurrar o êmbolo devagar (mais de ~ 3 seg), sem mover a agulha e, mesmo com pressão.
NOTA: Quando a agulha está no espaço sub-retiniano, uma ligeira resistência será sentida enquanto pressiona o êmbolo. Não haverá a resistência mínima, se a agulha perfura a retina, e alta resistência, se a agulha não penetra a esclera ou EPR. - Aguarde alguns segundos antes de retirar a agulha para minimizar o refluxo.
- Lavar os olhos com solução salina tamponada estéril e garantir o olho hcomo rodado de volta à sua posição normal.
4. Avaliação da Retinal Detachment por PTU e Fundus Imagiologia
- Realizar imagem outubro imediatamente após a injecção para avaliar a qualidade da injecção e no tempo adequado aponta pós-injecção conforme necessário, para avaliar a estrutura retiniana.
NOTA: Os exemplos da utilização de outubro em estudos semelhantes foi anteriormente descrito 7,14.- Ajustar e alinhar a imagem OCT para atingir o local de injecção. O local de injecção deve ser linha média e 0,5 milímetros temporal com a cabeça do nervo óptico. Repita conforme necessário, se o destacamento está fora do quadro ou não otimamente centrado.
- Visualize descolamento da retina e tingir área de injeção com en-face fundus imaging 7,14.
NOTA: Se um sistema de imagem outubro não está disponível, a injeção de uma pequena quantidade de fluoresceína com um vector para a prática irá permitir a visualização em qualquer câmara de fundo que realiza fluoresceína angiografia usando os mesmos comprimentos de onda de excitação e de filtros de bloqueio. áreas localizadas de hiper-fluorescência aparece debaixo da vasculatura e da vasculatura terá fronteiras nítidas e distintas se o espaço sub-retiniano é direcionado corretamente. O bordo da bolha a partir da injecção será delimitada pela transição da hiper- a fluorescência hipo. Vários instrumentos fornecem esse recurso para o rato; a instrumentação utilizada aqui é descrito noutro local 14.
Cuidados 5. Pós-operatório
- Aplique uma camada grossa de creme oftálmica antibiótico triplo para a superfície da córnea do olho injetado.
- Coloque os ratos em gaiolas solitários limpas para recuperação. Não combine ratos que foram submetidos a cirurgia até que sejam totalmente recuperado.
- Monitorar a respiração e temperatura durante a recuperação da anestesia. Monitorar os animais até que eles possam manter decúbito esternal.
- Realizar o monitoramento pós-operatória complementar adequadoe tratamento, incluindo uma injecção sub-cutânea de carprofeno (5 mg / kg) para pós-cirúrgica a gestão da dor.
6. Avaliação da função da retina por Eletrorretinografia (ERG)
- Realizar análise ERG pré-injecção e em momentos adequados após a injecção, conforme necessário para avaliar a função da retina. Se a injecção foi feita para o espaço sub-retiniano, o descolamento da retina devem resolver dentro de 72 h.
- Use técnicas ERG padrão para avaliar a função da retina, antes e após a injeção, como descrito anteriormente 14,15.
7. Reconstrução 3D e quantificação da bolha Volume
NOTA: OCT exames com contraste elevado englobando todo o destacamento dentro do quadro de vista são ideais para uso. ImageJ / Fiji 17,18 e Imaris foram usadas, mas outro software pode ser utilizado.
- Exportar o b-scan de interesse, importação para ImageJ / Fiji e cultura (Imagem> Cortar) a parte do sc outubroum a ser modelado usando a ferramenta de seleção retangular.
- Ajustar o contraste (Image> Adjust> Brightness / Contrast) e delimitar quaisquer limites em falta, ligando duas seções com uma linha.
- Desenhar uma linha reta com o (shift holding) ferramenta de linha que atravessa o RPE para a camada de fotorreceptores. Medida (Analisar> Medida) o comprimento da linha para obter o tamanho de máximo afastamento para o passo 7.8.
- Import cortada quadros para o software 3D-reconstrução (Ver Tabela de Materiais), utilizando o "RGB para cinza" plugin e MATLAB Compiler Runtime.
- Defina o tamanho do voxel (em Propriedades de imagem) usando os parâmetros de calibração da verificação outubro (x, y, z).
- Execute o "RGB para Gray" plug-in (em Propriedades de imagem), com igual ponderação para cada canal, para criar um quarto canal. Excluir canais vermelho-verde-azul original.
- Inverter o canal cinza usando mudança de contraste. Image Store.
- Clique no botão "adicionar umsuperfície ew "botão na guia 3D-View, e começar o guiada 4 passo processo de criação da superfície.
- Definir o nível de detalhe de superfície (etapa 1 de 4).
NOTA: Em nossa experiência 8,0-12,0 era a gama mais eficaz. - Defina o tamanho da esfera máximo (em Seleção de fundo) para um pouco menos que o tamanho máximo desprendimento medido no ponto 7.1.2. Criar a superfície e desfazer cinza inversão de canal (passo 2 de 4).
- Definir o limite para o valor máximo para a superfície dos espaços negativos fora da retina e o desprendimento não entram em contacto (passo 3 de 4).
- Definir o tipo de filtro para o número de voxeis e isolar o espaço negativa no local de descolamento por tamanho. Terminar a superfície (passo 4 de 4).
NOTA: O volume da superfície de desprendimento está localizado sob o volume na guia estatísticas.
- Definir o nível de detalhe de superfície (etapa 1 de 4).
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Representative Results
Abordagem posterior transcleral injecções sub-retinianas foram realizadas a 31 olhos saudáveis de 16 ratinhos de tipo selvagem com injecções de 0,3 mL (n = 18), 0,5 mL (n = 8) e 1,0 uL (n = 5) de 0,01% de fluoresceína. Um olho foi excluído da injecção devido a uma opacidade da córnea pré-existente que impediu uma análise estrutural e funcional. Todos os olhos injetados está incluído neste relatório. Não há descolamento de retina não intencionais, punções da retina neurossensorial, ou fuga para o vítreo foram detectados nem houve qualquer evidência de nicking lente, respostas inflamatórias, uveíte, ou infecções pós-cirúrgicas em quaisquer olhos observados.
Estrutura da retina foi avaliada de pré-injecção, 10 min pós-injecção e pós-injecção, utilizando imagiologia outubro 4 semanas (Figuras 2 e 3). Uma grade de 9 pontos, com o ponto central que se sobrepõe ao centro de distanciamento máximo, foi colocado sobre a 10-minpós-injeção en varredura face (Figura 2B). Usando marcos vasculares, pré-injecção e 4-semana scans após a injecção foram rodados para estar em registro junto à 10 minutos de varredura pós-injeção. Isto permitiu a identificação de exatamente os mesmos locais em injeção de exames de retina pré e pós-(Figura 2A, C).
Injecções sub-retiniana resultou na formação de vesícula que foi centrado longe do local de injecção, onde a agulha entrou no espaço sub-retiniano (Figura 2B seta), e foram, quer plana (Figura 3A) com um distanciamento superficial que se estende por uma área extensa ou abobadada (Figura 3B - D) com profundidade descolamento numa área restrita (Tabela 1). A bolha cúpula foi definida como qualquer distanciamento que ultrapassou os 50 mm ortogonais à RPE. Sem rosetas, um padrão ondulado produzido por alongamento das camadas exteriores da retina, foram observadas. O extenda de deposição de injecção foi visualizado com en face outubro (Figura 2D, linha tracejada), imagiologia fundus fluoresceína (Figura 2E) e PTU B-scans (Figura 3). A maioria de bolhas (29 de 31) estendido para além do campo de visão dos exames PTU, que compreendem cerca de 10% da retina do rato. Não havia nenhum controle sobre a forma de bolha diferente do aumento da frequência de bolhas de cúpula com maiores volumes de injecção (Tabela 1). Todas as bolhas resolvidos por 2 semanas (dados não apresentados).
Espessura da retina (membrana de Bruch com a camada de fibras nervosas) total foi quantitativamente avaliada 4 semanas após a injecção para 0,3 ul (Figura 3A), 0,5 ul (Figura 3B) e 1,0 ul (Figura 3C) Os volumes de injecção em cada ponto da grelha presente em b-Scans correspondente (Tabela 1). A diferença de percentagem (% Δ) Wtal como calculado como a diferença em relação às medições de pré-injecção para ambas as métricas estruturais e funcionais. Nem todos os pontos da grade foram adquiridos durante todas as sessões de imagem. Por exemplo, 3 olhos tinham 1 ou 2 pontos, 4 olhos tinha 3 ou 4 pontos, e 23 olhos tinham de 5 a 9 pontos em todas as varreduras. Volumes abobadadas e bolhas planas, e de injecção foram entrou em colapso desde a espessura da retina total não foi significativamente diferente para pré e pós-injeções, embora tenha sido observado uma tendência geral de afinamento da retina para ambos (Tabela 2).
Outras análises mostraram pequena, mas estatisticamente significativo adelgaçamento de 6,5% ± 1,9 geral (pré = 196 ± 1, n = 31; pós = 183 ± 4, n = 31, 60 t = 3,4, p = 0,001) (Tabela 3). Para determinar onde afinamento da retina ocorreu, foi analisado um subconjunto de 10 olhos que continha medidas de espessura para todos os 9 pontos de grade. Semelhante à análise de todos os olhos, osubconjunto dos olhos também mostrou pequeno mas significativo adelgaçamento da retina geral (10,3% ± 3,5, pré = 199 ± 1, n = 10; pós = 179 ± 8, N = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). Nenhuma adelgaçamento da retina foi observada em locais distais ao local de injecção (7,2 ± 4,0%, pré = 199 ± 2, n = 10; pós = 185 ± 8, N = 10, T = 18, 1,7, p = 11). Adelgaçamento da retina foi observada no local de descolamento da retina máxima (11,2% ± 5,0, pré = 201 ± 2, n = 10; pós = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), o local de injecção sem danos (13,8 ± 6,0, pré = 201 ± 1, n = 4; pós = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), locais de injecção com encarceramento retinal quando uma pequena região da retina é puxada através da esclera após a retirada da agulha (14,1% ± 1,0, pré = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) e de injeção de sites com cicatrizes (26,5% ± 1,6, pré = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, 4 t = 5,1, p = 0,007). No total, prisões ocorreu em 14 dos 31 injecções, três dos quais resultaram na formação de cicatriz da coróide com perda de até metade das camadas exteriores da retina (Figura 3E). Em cada caso, no entanto, estes efeitos eram altamente localizada.
-Campo cheio eletrorretinografia foi realizada antes da injecção e repetido 4 semanas após a injecção com mudanças relativas avaliados individualmente para cada olho para avaliar alterações funcionais (Tabela 1). Apenas escuro adaptados e respostas mediadas de bastonete foram registados. Funções de resposta de intensidade foram equipados com equações de Michaelis-Menten para derivar Vmax para ambos os fotorreceptores (a -waves) e a retina central (b -waves). As respostas não foram afetados pela forma de bolha e, portanto, foram entrou em colapso (Tabela 4). Houve uma pequena, mas estatisticamente significativa queda na Vmax sobreum -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013), mas não B -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) após a injecção (Tabela 4). Formas de onda representativos para pré- e pós-injecção de 0,3 mL, 0,5 uL e 1,0 uL estão apresentados (Figura 4). Havia um efeito de volume de injecção, tanto a - e b -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 e F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, respectivamente).
Por último, modelagem 3D foi usada para visualizar a estrutura de ambas as bolhas de cúpula e planas. Um exemplo de uma bolha com cúpula (Figura 5A) mostra um destacamento cheio de líquido contido dentro de cúpula a área de leitura. Exemplos de bolhas planas (Figura 5B, C) mostram áreas cheias de líquido rasas que se estendem para além da região da digitalização. Quando o encarceramento da retina ocorre, um pequeno buraco na reconstrução é visto (Figura 5C). fronteiras artificiais são mostrados na borda de um varrimento de to permitir a reconstrução (Figura 5C). Cálculo de volumes de bolha de estas injecções de amostra indicou que um mínimo de 0,15 mL e 0,01 ul foi visado com sucesso para o espaço sub-retiniano por 0,3 ul injecções resultando em bolhas abobadadas e planas, respectivamente. O volume calculado injetado provavelmente subestima o volume real devido à resolução de imagem e reconstrução, a reabsorção de líquidos durante o procedimento como ocorre em injecções sub-retinianas humanos, e por bolhas planas ou em cúpula particularmente, se todo o descolamento não estava representada nas varreduras PTU.
Tabela 1. Efeitos funcional e estrutural de sub-retiniana Injeções por Eye. Métricas de olhos individuais e os seus resultados de injeções sub-retinianas. Respostas da retina à luz (b -waves meio retina e fotoreceptoras um -waves) e da espessura da retina medições (membrana de Bruch a camada de fibras nervosas) são dadas. notas de rodapé:
um tipo BT = Bleb, Flat (F) ou abobadada (D)
b #gp = número de pontos de grade medido
* Olhos utilizados para reconstrução do volume de injeção.
** Apenas um ponto da grade disponível para leituras no cicatriz.
# Olhos com a formação de cicatrizes.
| Tempo | abobadado da bolha | da bolha plana | 0,3 ul | 0,5 ul | 1.0 ul | |
| (mm) | (mm) | (mm) | (mm) | (mm) | ||
| Pré-injecção 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Pós-injecção | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabela 2. Efeito da sub-retiniana Injeções no total da retina espessura. Análise da forma de bolha e o volume de injecção da espessura da retina.
| Espessura (mm) | |||||
| Local | n (olhos) | Pré | 4 semanas | Δ | % Δ |
| Retina (todos os pontos concordantes) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina com todos os pontos da grelha 9 * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10.3 ± 3.5 |
| Distal para Injecção * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| Maximal Destacamento * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5.0 |
| Injeção sem Dano * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6.0 |
| O encarceramento de injecção * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1.0 |
| Cicatriz na injecção * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1.6 |
Tabela 3. Efeito de danos na estrutura da retina. Análise do local-dependente adelgaçamento da retina. Notas de rodapé: * Análise dos 10 ratos com os dados de todos os 9 pontos de grade.
| Vmax (mV) | Abobadado (n = 12) | Plana (n = 6) | 0,3 ul (n = 18) | 0,5 ul (n = 8) | 1,0 ul (n = 5) |
| um -waves | |||||
| Pré-injecção | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Pós-injecção | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Pré-injecção | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Pós-injecção | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
dentro-page = "1"> T capazes 4. Efeito da sub-retiniana Injeções na Scotopic Rod mediada por um - e B -waves. Análise da forma de bolha e volume de injeção nas respostas da retina à luz (b -waves meio retina e fotoreceptoras um -waves).
Figura 1. Representação esquemática do sub-retiniana Injection. Um esquema de cima para baixo de um olho do rato no soquete mostra a abordagem em injecções sub-retinianas tradicionais, usando um transcorneano (seta a) ou transcleral (seta b) no local da injecção, perto da pars plana. Este método utiliza uma abordagem transcleral próximo do pólo posterior (seta C), obtida por rotação do olho por via nasal para expor o pólo posterior.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Registro da OCT Imagens permite a identificação de Sites da retina para Análise de espessura. AC, cara imagem outubro de rato 1os na orientação original en. A) Imagem da retina pré-injecção com grade de registro fundidos. B) Imagem da retina 10 min após a injecção. Uma grelha de nove pontos foi posicionada com o ponto central no local de descolamento da retina máxima. local da injecção é visível (seta). C) A imagem de retina 4 semanas após a injecção com grade de registro fundidos. DE, imagens de rato 9OS. D) imagem do rosto outubro de retina 4 semanas após a injecção mostrando estender de descolamento sub-retiniana En. E)Sobreposição de fundo de olho (verde) e en face imagens PTU de retina 10 min após a injecção. Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. sub-retiniana injeções causam Retinal Destacamentos temporários com afinamento da retina Minimal. Representativos PTU B-scans no local de descolamento da retina máxima são mostradas para pré-injecção, 10 min pós-injecção e 4 semanas pós-injecção. A) Formação e resolução de uma bolha plana de uma injecção de 0,3 mL. B) Formação e resolução de uma bolha de cúpula de uma injecção de 0,5 mL. C) Formação e resolução de uma bolha de cúpula de uma injecção de 1,0 mL. D) Exemplo de cho gravecicatrizes roidal e afinamento da retina no local da injeção. Barra de escala = 100 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. retinas reter a função normal após a resolução da bolha. Formas de onda para respostas mediadas por bastonetes são mostrados para a pré-injecção (linha preta) e 4 semanas após a injecção (linha tracejada vermelha) para A) 0,3 mL, B) de 0,5 ul e C) injeções de 1,0 ul em 9 intensidades de iluminação que vão desde 4,37 x 10 -6 0,51 cd / m 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. reconstrução 3D de bolhas. A) Software gerado reconstruções 3D de um representante) abobadado e B, C) bolhas planas de injeções de 0,3 mL. Ribbing é um artefato de software de reconstrução. fronteiras artificiais foram colocados em C para permitir a reconstrução. Barra de escala = 150 pm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
injecções sub-retiniano são o método de escolha para a entrega de vectores virais e terapia derivada de células para a manipulação de fotorreceptores e RPE em investigação básica e clínica de tratamento. Em pacientes, injecções sub-retinianas são tipicamente feitas com uma esclerotomia anterior na pars plana, uma vitrectomia de núcleo e posterior penetração da retina pela agulha com visualização directa. Tal como acontece com a maioria dos procedimentos de vitrectomia, que é comum para a formação de cataratas ocorra prematuramente a menos que o olho já é pseudofácico. Em ratinhos, injecções sub-retinianas são tradicionalmente feitas com o anterior esclerotomia para a retina, um método frequentemente associado com ambos nicking da lente, que ocupa a maior parte da cavidade posterior do olho, e a penetração transretinal que pode levar ao aprisionamento vítreo e completa descolamento de retina. Usando uma técnica posterior-abordagem em ratinhos reduz essas consequências indesejadas e melhora a capacidade de interpretar effects do manipulações pretendidas.
Benefícios da técnica de injeção sub-retiniana aqui relatados incluem efeitos estruturais ou funcionais mínimas e danos colaterais reduzidos (por exemplo, nublando a partir nicking lente, vazamento vítreo ou inflamação), que permite a avaliação mais fácil de resultados experimentais e os tempos de recuperação mais rápidos. Esta técnica requer uma maior manipulação do olho para alcançar o pólo posterior, mas pode ser concluído em cerca de 10-15 minutos por olho com uma elevada taxa de sucesso como sem olhos foram rejeitados da análise. Na maioria das injecções, observou-se a estrutura da retina normal e função dentro de 4 semanas. Em comparação, estudos anteriores relatam 5 - 8 semanas para a recuperação da estrutura e função ou não relatam um tempo de recuperação 6,7. Consequentemente, as experiências pode ser concluída em menos tempo com menos animais.
Complicações desta técnica de injeção sub-retiniana incluiu a formação de cicatrizes e perda defotorreceptores em aproximadamente 10% das injeções, com apenas três casos de défices estruturais e funcionais significativas. A retina retido respostas normais de luz com apenas o maior cicatriz a diminuição da função de resposta de 80% dos fotorreceptores e 77% de resposta da retina interna em relação ao pré-injecção. encarceramento da retina pode ser reduzida com a utilização de uma agulha nova para cada injecção, embora esta não foi avaliada no estudo corrente. Alternativamente, eles podem ocorrer devido à pressão negativa e, assim, ser inevitável. Encarceramentos são muito comuns em humanos subretinal injecções, no entanto, devido ao grande tamanho do olho, incarcerations representam menos danos na retina total. Por conseguinte, se um agente terapêutico ter sido injectado, 90% dos olhos injetados estariam disponíveis para a avaliação dos efeitos de que a intervenção.
A variabilidade na medida da espessura da retina, antes e após a injeção sub-retiniana reflete a reprodutibilidade de tele outubro instrumento em ratinhos, a precisão do alinhamento locais da retina entre imagens, e alterações na retina de injecção de soro fisiológico com uma dose baixa de corante de fluoresceína. Essas medições podem servir para guiar investigadores em cálculos de energia para o número de olhos e localizações da retina necessárias para detectar alterações estatisticamente válido como um resultado de injecções sub-retinianas com ou sem um agente terapêutico está presente. Nos 10 casos em que houve 9 pontos da grelha em todas as imagens da retina, a variabilidade da espessura da retina fora do local de injecção (5 - 8 pontos por olho) era de 7,2% ± 4,0%, mesmo na ausência de um tóxico ou agente terapêutico ou uma distrofia retinal hereditária. Tal variabilidade é uma consideração para a definição de critérios para a comparação dos resultados clínicos usando modelos de rato para tratamentos sub-retinianas, e sugere fortemente que os controles apropriados incluem injeção sub-retiniana de veículo, em vez de um olho não injectados 3. Por fim, sugerimos que Investigadores para fazer numerosos exames PTU de várias regiões da retina, antes da injecção para melhorar a cobertura do local de injecção em todas as análises.
O efeito terapêutico irá provavelmente ser alcançada quando os agentes experimentais são entregues a uma maior extensão da retina. Nestes casos, os volumes maiores são ideais, mas pode não ser necessário quanto 0,3 injeções ul frequentemente formadas bolhas planas que cobriram uma grande área de superfície retiniana. A forma de bolha não era controlável, embora os volumes de injecção maiores produzem bolhas mais abobadadas. Até 1 ml pode ser injetado sem resultados negativos, no entanto, é possível que bolhas de cúpula se tornam tão estendida que os toques de retina e adere à cápsula posterior do cristalino, particularmente em ratos jovens com volumes vítreas baixos. Apesar de o volume entregue a partir da seringa, o volume real voltado para o espaço sub-retiniano é calculado para ser menor. Isso pode refletir volume que não é adquirido nos scans PTU, particularmente para cúpula ou fbolhas lat, ou um artefato da digitalização outubro e posterior reconstrução, mas pode refletir a perda de volume de refluxo após a retirada da agulha.
Em resumo, usando uma abordagem posterior para injectáveis sub-retinianas tem menos complicações e melhor recuperação, resultando em uma alta taxa de sucesso de segmentação e baixa taxa de exclusão. Esta técnica é ideal para manipulações virais, farmacológicas, e celulares da retina de roedores.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
