Abstract
Субретинальной инъекции были успешно использованы в обоих людей и грызунов для доставки терапевтических вмешательств белков, вирусные агенты и клетки к interphotoreceptor / субретинальном отсек, который имеет прямой контакт с фоторецепторов и пигментного эпителия сетчатки (RPE). Субретинальной инъекции плазминогена, а также недавние доклинические и клинические испытания продемонстрировали безопасность и / или эффективность доставки вирусных векторов и стволовых клеток для лиц с прогрессирующим заболеванием сетчатки глаза. Мышиные модели заболевания сетчатки, особенно наследственной дистрофии сетчатки глаза, имеют важное значение для тестирования этих методов лечения. Наиболее распространенной процедурой инъекции у грызунов является использование небольшой транскорнеальной или склеру надрезы с передним подходом к сетчатке. При таком подходе, инъекционная игла проникает в нейросенсорной сетчатки, срывающее лежащую в основе ПЭС и при вставке может легко ник объектив, в результате чего объектив помутнение и ухудшение неинвазивной томографовнг. Доступ к субретинальной пространство через склеру, задний подход позволяет избежать этих проблем: игла пересекает склеры примерно 0,5 мм от зрительного нерва, без проникновения сетчатки и позволяет избежать разрушения стекловидного. Сопутствующий ущерб ограничен, что связано с фокальной склеротомия и последствия переходного процесса, серозной отслойки сетчатки. Простота метода минимизирует глазное травмы, обеспечивает быстрое воссоединении и восстановление сетчатки глаза, и имеет низкий процент отказов. Минимальное повреждение сетчатки и ПЭС позволяет четкой оценки эффективности и непосредственного воздействия самих терапевтических агентов. Эта рукопись описывает новый субретинальной технику инъекции, которая может быть использована для целевых вирусных векторов, фармакологические препараты, стволовые клетки или индуцированных плюрипотентных стволовых (ИПС) клетки в субретинальной пространство у мышей с высокой эффективностью, минимальным повреждением, и быстрое восстановление.
Introduction
Субретинальной инъекции являются основным средством доставки клеточных и вирусных агентов в сетчатке мышей , чтобы изучить их влияние на фоторецепторы и лежащей в основе ПЭС 1,2. Большинство субретинальном протоколов инъекций у мышей используют транскорнеальной или склеру месте инъекции кпереди от экватора (рис 1). Такой подход может привести к присущего сопутствующий ущерб , который включает зазубрин и результирующая помутнение хрусталика, нарушение целостности стекловидное, проникновение нейросенсорной сетчатки и радужной оболочки глаза, кровоизлияние в сетчатку глаза, значительные отслоения сетчатки и прочного субретинальном отека 3-9. Экспериментальные манипуляции должны преодолеть эти эффекты, чтобы оценить эффект терапевтических вмешательств 3,7,10,11. Данное исследование содержит подробное описание и проверку на задней склеру инъекционным методом, который позволяет избежать этих осложнений, сводит к минимуму травмы и имеет высокий уровень успеха таргетинга субпространство сетчатки глаза.
Инъекции таргетингом субретинальной пространство у мышей часто очень трудно выполнить , и большинство исследователей сталкиваются с высокой частотой неудачных попыток , в которых вектор доставляется на неверное место или где существует значительный ущерб сетчатки, например , в полной отслойке сетчатки 6. Число глаз исключены из анализа из-за инъекций осложнений, как правило, не сообщается в исследованиях на мышах, но в нашем собственном опыте и в дискуссии с другими исследователями, число неудачных инъекций может достигать 50% и варьируются в зависимости от опыта и возможности исследователя, выполняющего инъекции. Успех инъекции , как правило , оценивается путем непосредственного глазного визуализации и / или оптической когерентной томографии (OCT) 7,9. Легко освоен метод с высокими показателями успеха для субретинальной инъекций у мышей может ускорить экспериментирование и снизить стоимость доклинических исследований Треatments для заболеваний сетчатки, которые являются основными причинами слепоты в Соединенных Штатах.
Задняя, склеру техника субретинальной инъекции , описанный здесь является адаптацией из клинических и доклинических протоколов 9,12. Неинвазивной диагностики оценки, выполненные в мышах демонстрируют инжектированных мягкий и очень локализованное повреждение и отсутствие дополнительного залога объектива, сетчатки и RPE травмы. Кроме того, при относительно небольшой практики, экспериментатор может достичь этих результатов с высокой вероятностью успеха (80 - 90% или выше), тем самым снижая затраты, связанные с такими исследованиями. Эта процедура может быть использована для доставки сотовых, вирусные или фармакологические терапевтические вмешательства в фоторецепторов и / или ПЭС в доклинических исследованиях и легко оценить экспериментальные вмешательства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Животные: дикого типа C57BL / 6J мышей разводят в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе (UCLA). Все животные были в возрасте от 11 - 17 недель, а также включены мужские и женские мышей. Все мыши были размещены-группы, поддерживали в 12:12 цикле свет / темнота с пищей и водой вволю. Все эксперименты проводились в соответствии с ведомственным руководящим принципам Калифорнийского университета и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии Заявление по использованию животных в офтальмологических и Vision Research.
Примечание: Все препараты и инъекционные агенты Фармакопеи США (USP) класса.
1. Хирургическая подготовка
- Обезболить мышь с внутрибрюшинного введения 100 мг / кг кетамина и 8 мг / кг ксилазина в солевом смеси. Администрирование анестезии на глубину таким образом, что мышь не имеет ног щепотку или роговичных сенсорные рефлексы.
- Поддержание температуры тела при 37,0 ° C с циркулирующей водой площадку.
- Разбавить учеников с 2,5% фенилэфрина глаз дROPS и отделка усов для облегчения визуализации. Нитевидные кристаллы обеспечивают существенную сенсорную информацию для мыши, поэтому, нитевидные кристаллы обрезки следует удалить только ту часть, которая блокирует свободного доступа к глазу, а не к основанию усов. В нашем опыте, мышей показывают нормальное восстановление после этой процедуры. Применение метилцеллюлозы глазные капли для предотвращения сухости и свести к минимуму обезболивающий индуцированные переходных катаракту 13.
- Стерилизовать инструменты перед операцией (т.е. бетадин и этанола или горячих шариков).
- Готовят разбавленный флуоресцеин (0,01% с использованием 0,9% солевой раствор) в стерильной среде (то есть, шкаф биологической безопасности) , если визуализация будет выполнена (см раздел 3 ниже).
2. Инъекции Подготовка сайта
- Подготовьте шприц (например, 5 мкл шприц) с соответствующим объемом впрыска (например, от 0,3 до 1,0 мкл).
- Поместите мышь так глаз вверх и хорошо видны в диssecting микроскоп.
- Осторожно зажать временную конъюнктиву с тонкими щипцами с наконечниками. Делают окружную надрез приблизительно 90 градусов, используя изогнутые ножницы Vannas.
- Повторите шаг 2.3 с капсулой, лежащих в основе теноново.
- Резекцию окружающую соединительную ткань с тонкими щипцами с наконечниками, вращая глобус интраназально. Работа в направлении места инъекции приблизительно 0,5 мм височной зрительного нерва. Используйте большую осторожность, чтобы избежать нарушения ретро-орбитальной пазухи.
3. склеротомия и субретинальном Инъекции
Примечание: Рекомендуется, чтобы инъекция 0,01% флуоресцеина в 0,9% солевой раствор можно использовать для оказания помощи визуализации во время обучения этой процедуры. Топографическая распределение флуоресцеина может быть эффективно документирован с фундус томографии (смотри раздел 4 ниже).
- Сделайте небольшой надрез склеры в месте инъекции, осторожно царапая окуляр с 22,5 градусов офтальмологической лезвия. Разрез ShouЛД быть только достаточно большим, чтобы позволить кончик иглы, чтобы пройти через склеру.
- Вставьте скошенную 33 G иглу (угловая 5 -. 10 ° в склеротомия с скос лицом и под углом параллельно сетчатке Вводят желаемого объема (например, от 0,3 до 1,0 мкл 0,01% флуоресцеина для целей обучения).
Примечание: сохранения стерильности шприца путем тщательной очистки с последовательными промывками подходящего растворителя и деионизированной водой перед каждой инъекцией. - Выжмите поршень медленно (в течение ~ 3 сек) без перемещения иглы и с равномерным давлением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда игла находится в субретинальной пространстве, небольшое сопротивление будет ощущаться во время нажатия на поршень. не Там будет не к минимальным сопротивлением, если игла протыкает сетчатку, и высокое сопротивление, если игла не проникает через склеру или ППД. - Подождите несколько секунд до снятия иглы, чтобы минимизировать обратный поток.
- Промыть глаза стерильным солевым буфером и обеспечить зрительный часпри вращении назад в нормальное положение.
4. Оценка Отслойка ОКТ и Fundus изображений
- Выполните визуализацию OCT сразу после инъекции, чтобы оценить качество инъекции и в соответствующее время указывает после инъекции по мере необходимости для оценки структуры сетчатки глаза.
Примечание: Примеры использования ОКТ в аналогичных исследованиях было описано ранее 7,14.- Настройка и выравнивания изображения ОКТ целевой сайт инъекции. Место инъекции должно быть по средней линии и 0,5 мм височной к головке зрительного нерва. Повторите по мере необходимости, если отряд находится вне кадра или не оптимально по центру.
- Визуализируйте отслоение сетчатки и красителя инъекции площадь с ванной лица фундус визуализации 7,14.
Примечание: Если система формирования изображения ОКТ отсутствует, инъекция небольшого количества флуоресцеина с вектором для практики позволит визуализации с любой фундус-камеры, которая выполняет флуоресцеина ангиографии с использованием тех же длинах волн возбуждения и задерживающие фильтры. Локализованные участки гипер-флюоресценции появится под сосудистую и сосудистую сеть будет иметь острые и четкие границы, если субретинальной пространство правильно ориентированы. Край пузырьке из нагнетательной будет разграничена переходом от гипер- к гипо- флуоресценции. Несколько приборов обеспечивают эту возможность для мыши; измерительные приборы используются здесь описано в другом месте 14.
5. Послеоперационный уход
- Нанесите толстый слой тройного антибиотика офтальмологической крема на поверхности роговицы, закачиваемой глаза.
- Место мышей в чистых одиночных клеток для восстановления. Не совмещайте мышей, которые подверглись операции, пока они не будут полностью восстановлены.
- Монитор дыхания и температуры во время наркоза. Монитор животных, пока они не могут поддерживать грудины лежачее.
- Выполните соответствующие дополнительные послеоперационный мониторинги лечение, в том числе подкожной инъекции карпрофена (5 мг / кг) для послеоперационной боли.
6. Оценка Ретинального функции по электроретинография (ЭРГ)
- Выполнить анализ ERG предварительного впрыска и в соответствующие моменты времени после инъекции по мере необходимости для оценки функции сетчатки глаза. Если инъекция была сделана в субретинальной пространстве, отслойка сетчатки должны решить в течение 72 часов.
- С помощью стандартных методов ЭРГ для оценки функции сетчатки глаза до и после инъекции , как описано выше 14,15.
7. Реконструкция и 3D пузырьке Том Количественное
Примечание: сканирование с октября высококонтрастный охватывающий весь отряд в кадре зрения являются оптимальными для использования. ImageJ / Фиджи 17,18 и Imaris были использованы, но другое программное обеспечение может быть использовано.
- Экспорт-скан интерес, импорт в ImageJ / Фиджи и культур (Изображение> Crop) в части SC ОКТАн быть смоделированы с помощью прямоугольного выбора инструмента.
- Регулировка контрастности (Image> Adjust> Brightness / Contrast) и разграничить недостающие границы путем соединения двух секций с линией.
- Нарисуйте прямую линию с линией инструмента (холдинг сдвига), который охватывает ППД к фоторецепторов слоя. Мера (Анализ> Мера) длина линии, чтобы получить размер максимального отрыва на этапе 7.8.
- Импорт обрезанные кадры в программное обеспечение 3D-реконструкции (см Таблицу материалов) с помощью "RGB к серому" плагин и MATLAB Compiler время выполнения.
- Установить размер воксела (под Свойства изображения), используя параметры калибровки из сканирования ОКТ (х, у, г).
- Выполнить "RGB к серому" плагин (в разделе Свойства изображения), с равным взвешиванием для каждого канала, чтобы создать четвертый канал. Удалить оригинальный красный-зеленый-синий каналы.
- Обратить серый канал с помощью изменения контрастности. Хранить изображение.
- Нажмите кнопку "добавьтеРЭБ поверхность "Кнопка на вкладке 3D-View, и начать руководствоваться 4 шага процесса создания поверхности.
- Установите детали на уровне поверхности (шаг 1 из 4).
Примечание: В нашем опыте 8.0 до 12.0 был наиболее эффективный диапазон. - Установите максимальный размер сферы (под выбора фона) чуть-чуть меньше, чем максимальный размер отряда, измеренной в 7.1.2. Создайте поверхность и отвернуть серого канала инверсии (шаг 2 из 4).
- Установите порог до максимального значения, так что поверхность отрицательного пространства за пределами сетчатки и отслойки не вступают в контакт (шаг 3 из 4).
- Установите тип фильтра к числу вокселов и изолировать отрицательное пространство в отряде месте по размеру. Закончите поверхность (шаг 4 из 4).
Примечание: Объем отряда поверхности находится под объем на вкладке статистики.
- Установите детали на уровне поверхности (шаг 1 из 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Подход склеру кзади субретинальной инъекции проводили на 31 здоровых глаз от 16 мышей дикого типа с инъекциями 0,3 мкл (n = 18), 0,5 мкл (n = 8) и 1,0 мкл (n = 5) 0,01% флуоресцеина. Один глаз был исключен из инъекции из-за уже существующей помутнение роговицы, которая препятствовала структурно-функционального анализа. Каждый впрыскивается глаз включены в этот отчет. Нет непреднамеренные отслойки сетчатки, проколы нейросенсорной сетчатки, или утечки в стекловидное тело не было обнаружено и не было никаких доказательств линз перекреста, воспалительных реакций, увеит, или после хирургических инфекций в любых глазах наблюдаемых.
Сетчатки структура была оценена предварительного впрыска, 10 мин после инъекции и через 4 недели после инъекции с использованием ОКТ изображений (рисунки 2 и 3). 9-точечной сетке, с центральной точкой, покрывающей центр максимального отрыва, был помещен на 10-минутнымипосле инъекции фас сканирования (рис 2B). Используя сосудистые ориентиры, предварительный впрыск и 4-недельного сканирования после инъекции были повернуты, чтобы быть в регистрации с 10-минутной после инъекции сканирования. Это позволило идентифицировать одних и тех же местах , в пред- и пост- сканирования сетчатки глаза для инъекций (рис 2A, C).
Субретинальной инъекции привело к образованию пузырьке , который был в центре от места инъекции , где игла вошла в субретинальной пространство (рис 2B стрелка), и были либо плоскими (рис 3А) с мелкой отслойка простирающийся над расширенной зоной или куполообразные (Рисунок 3B - D) с глубоким отслойки в сконструированной области (таблица 1). Куполообразная волдырь был определен как любой отряд, который превысил 50 мкм, ортогональные к ПЭС. Нет розетки, волнистый узор получают путем растяжения наружных слоев сетчатки не наблюдалось. ЭксПалатка осаждения инжекционного визуализировали с фас ОКТ (рис 2D, прерывистая линия), флуоресцеина фундус томографии (рис 2E) и ОКТ B-сканов (рисунок 3). Большинство пузырьков (29 из 31) выходит за пределы поля зрения сканирования, ОКТ, которые охватывают около 10% сетчатки мыши. Там не было никакого контроля над пузырьке форме, кроме повышенной частоты купольных пузырьков с большими объемами впрыска (таблица 1). Все везикулы, разрешаемые 2-х недель (данные не показаны).
Общая толщина сетчатки глаза (мембраны Бруха к слою нервных волокон) количественно оценивали через 4 недели после инъекции по 0,3 мкл (фиг.3А), 0,5 мкл (Фиг.3В) и 1,0 мкл (рис 3C) объем вводимого препарата в каждой точке на сетке , присутствующей в соответствующие б-сканов (таблица 1). Разница в процентном отношении (% Δ) ша рассчитывается как разница по отношению к измерениям предварительного впрыска для обоих структурных и функциональных показателей. Не во всех сеансов визуализации во всех точках сетки были приобретены. Например, 3 глаза имели 1 или 2 очка, 4 глаза имели 3 или 4 очка, а 23 глаз имели от 5 до 9 баллов во всех сканов. Купольные и плоские везикулы, и инъекционные объемы рухнули , так как общая толщина сетчатки существенно не отличалась для пред- и пост-инъекций, хотя общая тенденция к истончению сетчатки наблюдалось для обоих (таблица 2).
Дальнейший анализ показал небольшое , но статистически значимое истончение 6,5% ± 1,9 в целом (до = 196 ± 1, п = 31; пост = 183 ± 4, п = 31, Т 60 = 3,4, р = 0,001) (таблица 3). Для того, чтобы определить, где произошла истончение сетчатки глаза, подмножеством 10 глаз, которые содержали измерения толщины для всех 9 точек сетки анализировалась. Подобный анализ для всех глаз,подмножество глаз также показали небольшое , но существенное общее истончение сетчатки (10,3% ± 3,5, до = 199 ± 1, п = 10; пост = 179 ± 8, п = 10, T 18 = 2,4, р = 0,02). Нет истончение сетчатки глаза не наблюдалось на участках дистальнее места инъекции (7,2% ± 4,0, до = 199 ± 2, п = 10; пост = 185 ± 8, п = 10, T 18 = 1,7, р = 11). Сетчатки истончение наблюдалась на участке максимального отслойки сетчатки (11,2% ± 5,0, до = 201 ± 2, п = 10; пост = 179 ± 10, п = 10, Т 18 = 2,1, р = 0,04), место инъекции без ущерба (13,8 ± 6,0, до = 201 ± 1, п = 4; пост = 173 ± 10, п = 4, Т 6 = 2,8, р = 0,03), инъекционные участки с заточения сетчатке , когда небольшой участок сетчатки протягивают через склеры после вывода иглы (14,1% ± 1,0, до = 199 ± 1, п = 3; пост = 171 ± 3, п = 3, Т 4 = 8,9, р = 0,001) и нагнетательных участки с рубцеванием (26.5% ± 1,6, до = 200 ± 3, п = 3; позт = 147 ± 10, п = 3, Т 4 = 5,1, р = 0,007). В общей сложности, заключений под стражу имело место у 14 из 31 инъекций, 3 из которых приводит к образованию рубцов хориоидеи с потерей до половины наружных слоев сетчатки (рис 3e). В каждом случае, однако, они были сильно локализованы эффекты.
Полное поле электроретинография проводили перед инъекцией и повторяется через 4 недели после инъекции с относительными изменениями оцениваемых по отдельности для каждого глаза , чтобы оценить функциональные изменения (таблица 1). Только адаптируются к темноте и стержневые опосредованной реакции были зафиксированы. Функции отклика интенсивности были оснащены уравнений Михаэлиса-Ментен для получения Vmax для обоих фоторецепторов (а) -волн и средней сетчатки (б) -волн. Ответы не были затронуты форме пузырьке и , следовательно , были разрушилась (таблица 4). Был небольшой, но статистически значимое снижение на Vmax-волн (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013) , но не б -волн (F (1, 28) = 4,0, р = 0,055) после инъекции (таблица 4). Типичные формы сигналов для до и после инъекции 0,3 мкл, 0,5 мкл и 1,0 мкл показаны (рисунок 4). Был эффект объема впрыска топлива на обоих а - и б -волн (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 и F (2, 28) = 8,8, p = 0,001, соответственно).
И, наконец, 3D-моделирование используется для визуализации структуры обоих куполами и плоских пузырьков. Примером куполообразным пузырьке (рис 5А) показывает куполообразную отряду заполненный жидкостью , содержащемся в области сканирования. Примеры из плоских пузырьков (рис 5B, C) показывают мелкие заполненные жидкостью области , которые выходят за пределы области сканирования. Когда происходит ущемление сетчатки глаза, небольшое отверстие в реконструкции видно (рис 5в). Искусственные границы показаны на краю т сканированияо позволяют реконструкции (5С). Расчет объемов пузырьке из этих образцов показали, что инъекции минимум 0,15 мкл и 0,01 мкл успешно направлены на субретинальной пространство для инъекций 0,3 мкл в результате куполами и плоских пузырьков, соответственно. Рассчитанный объем инъекции, вероятно, недооценивает фактический объем из-за разрешения изображений и реконструкции, рассасывание жидкости во время процедуры, как это происходит в субретинальной инъекций человека, а также для плоских или куполообразные пузырьков особенно, если весь отряд не был представлен в сканирований ОКТ.
Таблица 1. Функциональные и структурные эффекты субретинальной Инъекции на глаз. Метрики отдельных глаз и их результаты от субретинальной инъекций. Сетчатки реакции на свет (средний сетчатка б -волн и фоторецептор с -Волноваяы) и толщина сетчатки измерения (мембраны Бруха к нервным волокнистого слоя) приведены. Примечания:
BT = пузырьке Тип, квартира (F) или Куполообразное (D)
б #GP = количество точек сетки измеряется
* Глаза, используемые для восстановления объема впрыска топлива.
** Только 1 точка сетки для измерения на рубец.
# Глаза с образованием рубцов.
| Время | Выпуклый пузырьке | Плоский пузырьке | 0,3 мкл | 0,5 мкл | 1,0 мкл | |
| (мкм) | (мкм) | (мкм) | (мкм) | (мкм) | ||
| Предварительный впрыск 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Пост-инъекции | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Таблица 2. Влияние субретинальном Инъекции на Total Ретинального толщины. Анализ формы пузырьке и объемом впрыска от толщины сетчатки глаза.
| Толщина (мкм) | |||||
| сайт | п (глаза) | до | 4 WK | Δ | % Δ |
| Сетчатка (все согласные баллов) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina со всеми 9 точек сетки * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Дистальнее инъекций * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4,0 |
| Максимальный Отрыв * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Инъекция без повреждения * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Лишение свободы в месте инъекции * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Рубец в месте инъекции * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Таблица 3. Влияние повреждений на сетчатке глаза структуры. Анализ истончение сетчатки сайта-зависимой. Сноски: * Анализ из 10 мышей с данными из всех 9 точек сетки.
| Vmax (мкВ) | Выпуклый (п = 12) | Плоские (п = 6) | 0,3 мкл (п = 18) | 0,5 мкл (n = 8) | 1,0 мкл (n = 5) |
| а -волн | |||||
| Предварительный впрыск | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Пост-инъекции | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| б -волн | |||||
| Предварительный впрыск | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Пост-инъекции | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
в-странице = "1"> T в состоянии 4. Влияние субретинальном Инъекции на скотопическими Rod-опосредованное - и б -волн. Анализ формы пузырьке и объема впрыска на ответах сетчатки глаза к свету (средний сетчатки глаза б -волн и фоторецептор а -волн).
Рисунок 1. Схематическое изображение субретинальной инъекции. Сверху вниз схематическое изображение глаза мыши в гнезде показывает подход традиционные субретинальной инъекции, используя транскорнеальной (стрелка А) или склеру (стрелка б) место инъекции вблизи Plana Парс. Этот метод использует подход склеру у заднего полюса (стрелка с), что достигается за счет вращения глаз интраназально выставить заднего полюса.ле / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Регистрация ОКТ изображений позволяет идентифицировать ретиналя сайты для толщины анализа. AC, анфас ОКТ изображением мыши 1OS в исходной ориентации. A) Изображение сетчатки глаза предварительного впрыска с расплавленным регистрации сеткой. Б) Изображение сетчатка 10 мин после инъекции. 9-точечная сетка А была расположена с центральной точкой на месте максимального отслойки сетчатки. Инъекции сайта видна (стрелка). C) Изображение сетчатке 4 недели после инъекции с расплавленным регистрации сеткой. DE, изображения мыши 9OS. D) фас ОКТ изображение сетчатки глаза 4 -х недель после инъекции , показывающий продлить субретинальной отряда. Е)Накладка фундус (зеленый) и анфас ОКТ изображений сетчатки глаза 10 мин после инъекции. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. субретинальном Инъекции Причина Временный Сетчатки отрядах с минимальным Ретинального Сухих. Представительные ОКТ B-сканов в месте максимального отслойки сетчатки показаны для предварительного впрыска, 10 мин после инъекции и через 4 недели после инъекции. А) Формирование и разрешение плоского пузырьке с инъекцией 0,3 мкл. Б) Формирование и разрешение куполообразным пузырьке от инъекции 0,5 мкл. C) Формирование и разрешение куполообразным пузырьке от инъекции 1,0 мкл. D) Пример тяжелой чотороидального рубцевание и истончение сетчатки в месте инъекции. Шкала бар = 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Сетчатки Сохранение нормальной функции После того, как волдырь Разрешение. Волновые формы для скотопическими палочковидных опосредованные ответы приведены для предварительного впрыска (черная линия) и через 4 недели после инъекции (красная пунктирная линия) для а) 0,3 мкл, В) 0,5 мкл и C) 1,0 мкл инъекции на 9 освещенностей в пределах от 4,37 х 10 -6 до 0,51 кд / м 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. 3D - реконструкция пузырьков. A) Программное обеспечение сгенерированных 3D реконструкций репрезентативной A) выпукло и B, C) плоские везикулы от 0,3 мкл инъекций. Оребрением является артефактом программного обеспечения восстановления. Искусственные границы были помещены в C, чтобы позволить реконструкцию. Шкала бар = 150 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Субретинальной инъекции являются методом выбора для доставки вирусных векторов и стволовых клеток, полученных терапии для манипулирования фоторецепторов и ПЭС в обоих фундаментальных исследований и клинического лечения. У пациентов, субретинальной инъекции, как правило, осуществляется с передней склеротомия на Парс Plana, а задняя ядро витрэктомии и проникновение сетчатки иглой с прямой визуализации. Как и в большинстве процедур витрэктомии, он является общим для образование катаракты, происходит преждевременно, если глаз не является уже псевдофакичные. У мышей, субретинальной инъекции традиционно делается с склеротомия передней сетчатки, метод часто ассоциируется с обоими перекреста объектива, который занимает большую часть задней полости глаза, и transretinal проникновения, которые могут привести к стекловидного защемления и полный отслойки сетчатки. Используя метод задне-подход у мышей уменьшает эти нежелательные последствия, а также улучшает способность к интерпретации Е.Ф.фекты от предполагаемого манипулирования.
Преимущества субретинальной техники инъекции , описанные здесь , включают в себя минимальные структурные или функциональные эффекты и снижение побочного ущерба (например, помутнение хрусталика от перекреста, стекловидное течи или воспаление) , что позволяет легче оценить экспериментальных результатов и более быстрое время восстановления. Этот метод требует больших манипуляций глаза, чтобы достичь заднего полюса, но может быть завершена приблизительно 10 - 15 мин на глаз с высокой вероятностью успеха, поскольку никакие глаза не были отклонены из анализа. В большинстве инъекций, наблюдалась нормальная структура и функции сетчатки глаза в течение 4-х недель. Для сравнения, предыдущие исследования показывают , 5 - 8 недель для восстановления структуры и функции или не сообщают о времени восстановления 6,7. Следовательно, эксперименты могут быть завершены за меньшее время, с меньшим количеством животных.
Осложнения этого субретинальном техники инъекции включали образование рубцов и потерифоторецепторы в примерно 10% от инъекций, причем только в трех случаях значительных структурных и функциональных дефицитов. Сетчатка сохранили нормальные реакции на свет с только самый большой рубец убывающая функция до 80% от реакции фоторецептора и 77% внутренней реакции сетчатки глаза по сравнению с предварительной инъекцией. Сетчатки заключений под стражу может быть сокращен с использованием новой иглы для каждой инъекции, хотя это и не была оценена в настоящем исследовании. В качестве альтернативы, они могут возникать из-за отрицательного давления, и, таким образом, быть неизбежным. Сроками заключения очень распространены в субретинальной инъекции человека, тем не менее, из-за большого размера глаза, заключений под стражу представляют меньший вред от общей сетчатки. Следовательно, если терапевтический агент был введен, 90% инжектированных глаза будут доступны для оценки последствий такого вмешательства.
Изменчивость измерений толщины сетчатки глаза до и после инъекции субретинальном отражает воспроизводимости тон Октябре инструмент на мышах, точность выравнивания местоположения в сетчатке через изображений, а также изменения к сетчатке глаза от инъекции физиологического раствора с низкой дозой флуоресцеина красителя. Эти измерения могут служить ориентиром для исследователей в расчетах мощности для числа глаз и местах сетчатки глаза, необходимых для выявления статистически достоверных изменений в результате субретинальной инъекции или нет присутствует терапевтическое средство. В 10 случаях, для которых было 9 точек сетки во всех сканирований сетчатки, изменчивость толщины сетчатки глаза за пределы места инъекции (5 - 8 очков за глаза) составила 7,2% ± 4,0%, даже при отсутствии токсического или терапевтический агент или дистрофия наследственное ретиналь. Такая изменчивость является фактором для установления критериев для сравнения клинических результатов с использованием мышиных моделей для субретинальной лечения, а также настоятельно рекомендует соответствующие меры контроля включают субретинальной инъекции транспортного средства , а не неинъецированных глаз 3. И наконец, мы рекомендуем Investigторы сделать многочисленные ОКТ сканирования нескольких областей сетчатки перед инъекцией для улучшения охвата в месте инъекции во всех сканов.
Терапевтическая эффективность, вероятно, будет достигнута, когда экспериментальные агенты доставляются к большему гладь сетчатки. В этих случаях большие объемы идеальны, но не может быть необходимым, как 0,3 мкл инъекции часто образуются плоские волдыри, которые покрывали большую площадь поверхности сетчатки глаза. Форма волдырь не управляема, хотя большие объемы впрыска произведено более куполообразные волдыри. До 1 мкл могут быть введены без негативных последствий, тем не менее, не исключено, что куполообразные везикулы стали настолько расширены, что сетчатка штрихи и прилипает к задней капсуле хрусталика, особенно у молодых мышей с низким стекловидных объемами. Несмотря на объем поставляемого из шприца, фактический объем нацелен на субретинальной пространства вычисляется менее. Это может отражать объем, который не усваивается в сканирований ОКТ, в частности, для куполообразной или FLAT везикулы, или артефакт сканирования ОСТ и последующей реконструкции, но может отражать потерю объема от обратного потока при извлечении иглы.
Таким образом, используя задний подход для субретинальной инъекций имеет меньше осложнений и улучшения восстановления, что приводит к высокой вероятностью успеха адресности и низкой скорости исключения. Этот метод идеально подходит для вирусных, фармакологических и клеточных манипуляций грызунах сетчатке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
