Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54808

Abstract

inyecciones subretinales han utilizado con éxito en seres humanos y roedores para realizar intervenciones terapéuticas de proteínas, agentes virales, y las células a la interfotorreceptor compartimento / subretinal que tiene la exposición directa a los fotorreceptores y el epitelio pigmentario de la retina (RPE). inyecciones subretinales de plasminógeno, así como los últimos ensayos preclínicos y clínicos han demostrado la seguridad y / o eficacia de la entrega de vectores virales y células madre de individuos con enfermedad de la retina avanzada. Los modelos de ratón de la enfermedad de la retina, distrofias retinianas hereditarias en particular, son esenciales para probar estas terapias. El procedimiento de inyección más común en los roedores es el uso de pequeñas incisiones o transcorneal transescleral con un enfoque anterior a la retina. Con este enfoque, la aguja de inyección penetra en la retina neurosensorial interrumpir el RPE subyacente y en la inserción puede fácilmente nick la lente, haciendo que la opacificación de la lente y el deterioro de Imagi no invasivang. Acceder al espacio subretiniano a través de un transescleral, abordaje posterior evita estos problemas: la aguja atraviesa la esclerótica de aproximadamente 0,5 mm desde el nervio óptico, sin penetración de la retina y evita interrumpir el vítreo. El daño colateral se limita a la asociada con el sclerotomy focal y los efectos de un transitorio, desprendimiento seroso de la retina. La simplicidad del método minimiza la lesión ocular, asegura una rápida reinserción y recuperación de la retina, y tiene una baja tasa de fracaso. El mínimo daño a la retina y RPE permite una clara evaluación de la eficacia y los efectos directos de los propios agentes terapéuticos. Este manuscrito describe una nueva técnica de inyección subretinal que se puede utilizar para dirigir los vectores virales, agentes farmacológicos, las células madre o células madre pluripotentes inducidas (iPS) al espacio subretiniano en ratones con una alta eficacia, un daño mínimo, y una recuperación rápida.

Introduction

Inyecciones subretinales son el medio principal de suministro de agentes celulares y virales para las retinas de ratones para estudiar sus efectos en los fotorreceptores y RPE subyacente 1,2. La mayoría de los protocolos de inyección subretiniana en ratones utilizan una transcorneal o un sitio de inyección transescleral anterior al ecuador (Figura 1). Este enfoque puede resultar en daño colateral inherente que incluye mellar y turbidez resultante de la lente, la alteración de la integridad del vítreo, la penetración de la retina neurosensorial y el iris, hemorragia retiniana, desprendimientos de retina sustanciales y edema subretinal duradera 3-9. Las manipulaciones experimentales deben superar estos efectos con el fin de evaluar los efectos de las intervenciones terapéuticas 3,7,10,11. Este estudio proporciona una descripción detallada y validación de un método de inyección transescleral posterior que evita estas complicaciones, minimiza el trauma y tiene una alta tasa de éxito de la focalización del subespacio de la retina.

Las inyecciones dirigidas al espacio subretiniano en ratones son a menudo muy difícil de realizar y la mayoría de los investigadores se encuentran con una alta frecuencia de intentos fallidos en el que el vector se entrega a una ubicación incorrecta o hay un daño significativo de la retina, por ejemplo, en un desprendimiento de retina completa 6. El número de ojos excluidos del análisis debido a complicaciones de inyección normalmente no se informó en los estudios del ratón, pero en nuestra propia experiencia y en colaboración con otros investigadores, el número de inyecciones fallidas puede ser tan alta como 50% y variar en función de la experiencia y capacidades del investigador que está llevando a cabo las inyecciones. El éxito de la inyección se suele evaluar mediante imágenes de fondo de ojo directa y / o la tomografía de coherencia óptica (OCT) 7,9. Un método fácil de dominar con altas tasas de éxito para inyecciones subretiniana en ratones puede acelerar la experimentación y reducir el costo de los estudios preclínicos de treatments para enfermedades de la retina que son las principales causas de ceguera en los Estados Unidos.

La posterior, técnica de inyección subretiniana transescleral descrito aquí es una adaptación de los protocolos clínicos y preclínicos 9,12. Las evaluaciones de diagnóstico no invasivas realizadas en ratones inyectados demuestran daños leves y muy localizada y carecen de lente de garantías adicionales, lesión de la retina y RPE. Por otra parte, con relativamente poca práctica, un experimentador puede lograr estos resultados con una alta tasa de éxito (80 - 90% o más), lo que reduce los costos asociados con este tipo de estudios. Este procedimiento se puede usar para realizar intervenciones terapéuticas celulares, virales, o farmacológicos a los fotorreceptores y / o RPE en estudios preclínicos y evaluar fácilmente intervenciones experimentales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animales: tipo salvaje C57BL / 6J ratones criados en la Universidad de California en Los Angeles (UCLA). Todos los animales eran de entre 11 - 17 semanas de edad, y se incluyen ratones machos y hembras. Todos los ratones fueron alojados en grupo, mantenido en un 12:12 ciclo luz / oscuridad con comida y agua ad libitum. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales de la UCLA y la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y Visión.

NOTA: Todos los fármacos y agentes inyectables son Farmacopea de Estados Unidos grado (USP).

1. Preparación quirúrgica

  1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y 8 mg / kg de xilazina en una mezcla de solución salina. Administrar la anestesia a una profundidad tal que el ratón no tiene pizca dedo del pie o los reflejos corneales táctiles.
  2. Mantener la temperatura corporal a 37,0 ° C con un relleno aislante de agua circulante.
  3. Dilatar los alumnos con un 2,5% de ojo d fenilefrinaROPS y recortar los bigotes para facilitar la visualización. Whiskers proporcionan la entrada sensorial significativa al ratón, por lo tanto, barba recorte debería eliminar sólo la parte que bloquea el acceso claro a la vista, y no a la base de la barba. En nuestra experiencia, los ratones muestran una recuperación normal después de este procedimiento. Aplicar ojo metilcelulosa gotas para evitar la sequedad y minimizar los anestésicos cataratas inducidas transitorias 13.
  4. Esterilizar los instrumentos antes de la cirugía (es decir, betadine y etanol o perlas calientes).
  5. Preparar fluoresceína diluida (0,01% usando 0,9% de solución salina) en un ambiente estéril (es decir, cabina de bioseguridad) si se llevará a cabo la visualización (véase la sección 3).

2. Preparación del lugar de inyección

  1. Preparar una jeringa (por ejemplo, la jeringa 5 l) con el volumen apropiado de inyección (por ejemplo, 0,3 a 1,0 l).
  2. Coloque el puntero del ratón por lo que el ojo está mirando hacia arriba y claramente visible en el dissecting microscopio.
  3. pellizcar suavemente la conjuntiva temporal con unas pinzas de punta fina. Hacer una incisión circunferencial de aproximadamente 90 grados con unas tijeras curvadas Vannas.
  4. Repita el paso 2.3 con la cápsula de Tenon subyacente.
  5. Resecar el tejido conectivo que rodea con unas pinzas de punta fina mientras gira el mundo por vía nasal. El trabajo hacia el lugar de la inyección de aproximadamente 0,5 mm temporal en el nervio óptico. Tenga mucho cuidado para no perturbar el seno retro-orbital.

3. sclerotomy y Subretiniana Inyección

NOTA: Se recomienda que la inyección de 0,01% de fluoresceína en 0,9% de solución salina se utiliza para ayudar en la visualización, mientras que el aprendizaje de este procedimiento. La distribución topográfica de la fluoresceína puede ser efectivamente documentado con imágenes de fondo de ojo (ver sección 4).

  1. Hacer una pequeña incisión escleral en el lugar de la inyección por rascarse suavemente la copa ocular con una cuchilla oftálmica 22,5 grados. Esta incisión shousolamente ld ser lo suficientemente grande para permitir que la punta de la aguja pase a través de la esclerótica.
  2. Inserte la aguja de 33 G biselado (ángulo. 5 - 10 ° en el sclerotomy con el bisel hacia y en ángulo paralelo a la retina Inyectar el volumen deseado (por ejemplo, 0,3 a 1,0 l de 0,01% con fluoresceína para fines de aprendizaje).
    NOTA: mantener la esterilidad de la jeringa mediante la limpieza a fondo con lavados sucesivos de un disolvente adecuado y agua DI antes de cada inyección.
  3. Presione el émbolo lentamente (durante ~ 3 seg) sin mover la aguja y con una presión uniforme.
    NOTA: Cuando la aguja está en el espacio subretiniano, una ligera resistencia se hará sentir mientras oprime el émbolo. No habrá una resistencia mínima a si la aguja perfora la retina, y una alta resistencia si la aguja no penetra la esclerótica o RPE.
  4. Espere unos segundos antes de retirar la aguja para minimizar el reflujo.
  5. Enjuague el ojo con solución salina tamponada estéril y garantizar el ojo hcomo girar de nuevo a su posición normal.

4. Evaluación de desprendimiento de retina mediante OCT y el fondo de ojo Imaging

  1. Realizar PTU de imágenes inmediatamente después de la inyección para evaluar la calidad de la inyección y en el momento apropiado puntos después de la inyección, según sea necesario para evaluar la estructura de la retina.
    NOTA: Los ejemplos de la utilización de octubre en estudios similares se han descrito previamente 7,14.
    1. Ajustar y alinear la imagen de OCT para dirigirse al sitio de la inyección. El sitio de inyección debería ser la línea media y 0,5 mm temporal a la cabeza del nervio óptico. Repita según sea necesario si el desprendimiento está fuera del marco o no está centrada de forma óptima.
  2. Visualizar el desprendimiento de retina y teñir el área de inyección con cara de fondo de ojo en las imágenes 7,14.
    NOTA: Si un sistema de imágenes PTU no está disponible, la inyección de una pequeña cantidad de fluoresceína con un vector para la práctica va a permitir la visualización con cualquier cámara de fondo que realiza la angiografía con fluoresceínagraphy utilizando las mismas longitudes de onda de excitación y filtros de bloqueo. áreas localizadas de hiper-fluorescencia aparecerán debajo de la vasculatura y la vasculatura tendrán límites claros y distintos si el espacio subretiniano está dirigido correctamente. El borde de la ampolla de la inyección será demarcada por la transición de la hipertensión a la fluorescencia hipo. Varios instrumentos proporcionan esta capacidad para el ratón; la instrumentación usada aquí se describe en otro 14.

5. Cuidado post-operatorio

  1. Aplicar una capa gruesa de crema de triple antibiótico oftálmico a la superficie de la córnea del ojo inyectado.
  2. Coloque los ratones en jaulas solitarias limpias para la recuperación. No combine ratones que han sido sometidos a cirugía hasta que estén completamente recuperados.
  3. Monitor de la respiración y la temperatura durante la recuperación de la anestesia. Observar a los animales hasta que puedan mantener decúbito esternal.
  4. Realizar el seguimiento post-operatorio adicional apropiaday tratamiento, incluyendo una inyección subcutánea de carprofeno (5 mg / kg) para el tratamiento del dolor post-quirúrgico.

6. Evaluación de la función de la retina por Electrorretinografía (ERG)

  1. Realizar análisis ERG pre-inyección y en el momento apropiado después de la inyección, según sea necesario para evaluar la función de la retina. Si la inyección se hizo en el espacio subretiniano, el desprendimiento de retina debe resolver dentro de 72 horas.
    1. Utilizar técnicas estándar ERG para evaluar la función de la retina antes y después de la inyección como se ha descrito previamente 14,15.

Reconstrucción 3D 7. La cuantificación y la ampolla de volumen

NOTA: OCT exploraciones con alto contraste que abarca la totalidad del desprendimiento dentro del marco de vista son óptimas para su uso. ImageJ / Fiji 17,18 y Imaris se utilizaron, pero otro software puede ser utilizado.

  1. Exportar el B-scan de interés, la importación de ImageJ / Fiji y cultivos (Imagen> Recortar) la parte de la sc octubrean a ser modelado utilizando la herramienta de selección rectangular.
    1. Ajuste de contraste (Imagen> Ajustar> Brillo / Contraste) y deben especificar los límites que faltan mediante la conexión de dos secciones con una línea.
    2. Dibujar una línea recta con el (cambio de la celebración) herramienta de línea que se extiende por el EPR a la capa de fotorreceptores. Medida (Analizar> medida) la longitud de la línea para obtener el tamaño máximo de desprendimiento para el paso 7.8.
  2. Importación cosechado tramas al software de reconstrucción 3D (Ver Tabla de Materiales) utilizando el "RGB a gris" plugin y MATLAB Compiler Runtime.
  3. Ajuste el tamaño de vóxel (bajo Propiedades de la imagen) usando los parámetros de calibración a partir de las imágenes de OCT (x, y, z).
  4. Ejecutar el plug-in "RGB a Gray" (bajo Propiedades de la imagen), con igual ponderación a cada canal, para crear un cuarto canal. Borrar los canales rojo, verde y azul originales.
  5. Invertir el canal gris utilizando el cambio de contraste. Image Store.
  6. Haga clic en el "añadir unasuperficie ew "botón en la pestaña 3D-View, y comenzar el proceso de guiado 4 pasos para crear la superficie.
    1. Ajuste el nivel de detalle de la superficie (paso 1 de 4).
      NOTA: En nuestra experiencia 8,0-12,0 era el rango más eficaz.
    2. Ajuste el tamaño de la esfera máximo (en Selección de fondo) a ligeramente menor que el tamaño máximo de desprendimiento se mide en el punto 7.1.2. Crear la superficie y deshacer la inversión de canal gris (paso 2 de 4).
    3. Establecer el umbral para el valor máximo por lo que la superficie de los espacios negativos fuera de la retina y el desprendimiento no entre en contacto (paso 3 de 4).
    4. Ajuste el tipo de filtro para el número de voxels y aislar el espacio negativo en el sitio de desprendimiento por tamaño. Acabar la superficie (paso 4 de 4).
      NOTA: El volumen de la superficie de desprendimiento se encuentra bajo volumen en la pestaña de estadísticas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Posterior de aproximación inyecciones subretinianas transescleral se realizaron en 31 ojos sanos de 16 ratones de tipo salvaje con inyecciones de 0,3 l (n = 18), 0,5 l (n = 8) y 1,0 l (n = 5) de 0,01% fluoresceína. Un ojo fue excluido de la inyección debido a la opacidad corneal preexistente que impedía el análisis estructural y funcional. Todos los ojos inyectados se incluye en este informe. No hay desprendimientos de retina no deseados, se detectaron los pinchazos de la retina neurosensorial, o una fuga en el humor vítreo ni hubo evidencia de formación de muescas lente, respuestas inflamatorias, uveítis, o infecciones post-quirúrgicas en cualquier ojos observados.

Estructura de la retina se evaluó pre-inyección, 10 min después de la inyección y 4 semanas después de la inyección utilizando imágenes de OCT (Figuras 2 y 3). Una rejilla de 9 puntos, con el punto central que cubre el centro de la separación máxima, fue colocado en la 10-mindespués de la inyección en la cara de exploración (Figura 2B). El uso de puntos de referencia vasculares, pre-inyección y post-inyección de exploraciones de 4 semanas se hace girar para estar en registro con la exploración después de la inyección de 10 minutos. Esto permitió la identificación de exactamente los mismos lugares de inyección escáner de retina previas y posteriores (Figura 2 A, C).

Inyecciones subretinales como resultado la formación de vesículas que se centra de distancia del sitio de inyección, donde la aguja penetra en el espacio subretinal (Figura 2B flecha), y eran o plana (Figura 3A) con un desprendimiento de poca profundidad que se extiende sobre un área extendida o en forma de cúpula (Figura 3B - D) con profunda desprendimiento en una zona restringida (Tabla 1). Una ampolla en forma de cúpula se definió como cualquier desprendimiento que supera 50 micras ortogonal a la RPE. No hay rosetas, un patrón ondulado producido por el estiramiento de las capas externas de la retina, se observaron. La extienda de campaña de la deposición de la inyección se visualizó con la cara en OCT (Figura 2D, línea discontinua), imágenes de fondo de ojo con fluoresceína (Figura 2E) y PTU B-Scans (Figura 3). La mayoría de las ampollas (29 de 31) extendido más allá del campo de visión de las exploraciones de OCT, que abarcan aproximadamente el 10% de la retina del ratón. No había ningún control sobre la forma de la ampolla distintos del aumento de la frecuencia de vesículas en forma de cúpula con mayores volúmenes de inyección (Tabla 1). Todas las blebs resueltos por 2 semanas (datos no mostrados).

Espesor total de la retina (la membrana de Bruch a la capa de fibras nerviosas) se evaluó cuantitativamente 4 semanas después de la inyección de 0,3 l (Figura 3A), 0,5 l (Figura 3B) y 1,0 l (Figura 3C) volúmenes de inyección en cada punto de la red presente en b-Scans correspondiente (Tabla 1). La diferencia de porcentaje (% Δ) wcomo se calcula como la diferencia con respecto a las mediciones de pre-inyección para ambas métricas estructurales y funcionales. No se adquirieron todos los puntos de la rejilla durante todas las sesiones de formación de imágenes. Por ejemplo, 3 ojos tenían 1 ó 2 puntos, 4 ojos tenían 3 o 4 puntos, y 23 ojos tenían entre 5 y 9 puntos en todos los análisis. Volúmenes en forma de cúpula y blebs planas, y de inyección se derrumbó ya que el grosor total de la retina no fue significativamente diferente para pre-y post-inyecciones, aunque se observó una tendencia general hacia el adelgazamiento de la retina de ambos (Tabla 2).

Un análisis posterior mostró adelgazamiento pequeño pero estadísticamente significativo de 6,5% ± 1,9 general (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (Tabla 3). Para determinar dónde se produjo el adelgazamiento de la retina, se analizó un subgrupo de 10 ojos que contenía mediciones de espesor para los 9 puntos de la cuadrícula. Al igual que en el análisis de todos los ojos, lasubconjunto de los ojos también mostró adelgazamiento de la retina en general pequeña, pero significativa (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). No se observó adelgazamiento de la retina en los sitios distales al sitio de inyección (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11). Se observó adelgazamiento de la retina en el sitio de desprendimiento de retina máxima (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), el sitio de inyección sin daño (13,8 ± 6,0, pre = 201 ± 1, n = 4; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), los sitios de inyección con el encarcelamiento de la retina cuando una pequeña región de la retina es tirado a través de la esclerótica con la retirada de la aguja (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) y de inyección de sitios con cicatrices (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). En total, encarcelamientos ocurrieron en 14 de las 31 inyecciones, 3 de los cuales dieron lugar a la formación de cicatrices de la coroides con la pérdida de hasta la mitad de las capas externas de la retina (Figura 3E). En cada caso, sin embargo, estos eran los efectos altamente localizadas.

Electrorretinograma de campo completo se realizó antes de la inyección y repite 4 semanas después de la inyección con cambios relativos evaluados de forma individual para cada ojo para evaluar alteraciones funcionales (Tabla 1). Sólo adaptados a la oscuridad y se registraron las respuestas mediadas por varillas. Funciones de respuesta de intensidad fueron equipados con ecuaciones de Michaelis-Menten para derivar Vmax para ambos fotorreceptores (a -waves) y la retina medio (B -waves). Las respuestas no fueron afectados por la forma de la ampolla y por lo tanto se derrumbó (Tabla 4). Había una pequeña pero estadísticamente significativa disminución en el Vmaxun -waves (F (1, 28) = 7.1, p = 0,013), pero no b -waves (F (1, 28) = 4.0, p = 0,055) después de la inyección (Tabla 4). Formas de onda representativas para antes y después de la inyección de 0,3 l, 0,5 ly 1,0 l se muestran (Figura 4). Hubo un efecto de volumen de inyección en ambos a - b y -waves (F (2, 28) = 6.2, p = 0.006 y F (2, 28) = 8.8, p = 0,001, respectivamente).

Por último, el modelado 3D se utiliza para visualizar la estructura de ambas ampollas en forma de cúpula y planas. Un ejemplo de una ampolla en forma de cúpula (Figura 5A) muestra un desprendimiento lleno de líquido en forma de cúpula contenida dentro del área de escaneo. Ejemplos de vesículas planas (Figura 5 B, C) muestran áreas llenas de líquido poco profundas que se extienden más allá de la región de la exploración. Cuando se produce el encarcelamiento de retina, se observa un pequeño agujero en la reconstrucción (Figura 5C). fronteras artificiales se muestran en el borde de una camiseta de exploracióno permitir la reconstrucción (Figura 5C). Cálculo de los volúmenes de ampolla de estas inyecciones de muestra indica que un mínimo de 0,15 l y 0,01 l fue atacado con éxito al espacio subretiniano durante 0,3 inyecciones mu l que resulta en ampollas de cúpula y planas, respectivamente. El volumen calculado inyectada probablemente subestima el volumen real debido a la resolución de la imagen y la reconstrucción, la reabsorción de líquido durante el procedimiento tal y como ocurre en las inyecciones subretiniana humanos, y de las ampollas de planos o en forma de cúpula sobre todo, si todo el desprendimiento no estaba representada en los escáneres de TCO.

tabla 1
Tabla 1. Efectos funcionales y estructurales de subretinales inyecciones por los ojos. Métricas de ojos individuales y sus resultados de las inyecciones de subretiniana. Las respuestas de la retina a la luz (b -waves retina y medio fotorreceptor una onda *se dan s) y el espesor de la retina mediciones (la membrana de Bruch con capa de fibras nerviosas). Notas al pie:
un tipo BT = ampolla, plana (F) o de metal con tapa (D)
b #GP = número de puntos de la rejilla mide
* Ojos utilizados para la reconstrucción del volumen de inyección.
** Sólo 1 punto de la cuadrícula disponible para la medición en la cicatriz.
# Los ojos con la formación de cicatrices.

Hora en forma de cúpula de la ampolla ampolla plana 0,3 l 0,5 l 1.0 l
(m) (m) (m) (m) (m)
Pre-inyección 194 ± 2 197 ± 3 195 ± 1 197 ± 1 197 ± 3
Post-inyección 176 ± 8 188 ± 3 180 ± 6 184 ± 5 192 ± 5

Tabla 2. Efecto de subretinales inyecciones en total de retina de espesor. Análisis de la forma de la ampolla y el volumen de inyección en el espesor de la retina.

Espesor (m)
Sitio n (ojos) Pre 4 sem Δ Δ%
Retina (todos los puntos concordantes) 31 196 ± 1 183 ± 4 -13 ± 4 -6.5 ± 1.9
Retina con los 9 puntos de la rejilla * 10 199 ± 1 179 ± 8 -20 ± 7 -10.3 ± 3.5
Distal a la inyección * 10 199 ± 2 185 ± 8 -14 ± 7 -7.2 ± 4.0
El desprendimiento máxima * 10 201 ± 2 179 ± 10 -22 ± 9 -11,2 ± 5,0
Inyección sin Daño * 4 201 ± 1 173 ± 10 -28 ± 12 -13.8 ± 6.0
Reclusión en la inyección * 3 199 ± 1 171 ± 3 -28 ± 2 -14.1 ± 1.0
Cicatriz en Inyección * 3 201 ± 3 147 ± 10 -53 ± 10 -26.5 ± 1.6

Tabla 3. Efecto de los daños en la estructura de la retina. Análisis de adelgazamiento retinal dependiente del sitio. Notas al pie: * Análisis de 10 ratones con los datos de los 9 puntos de la cuadrícula.

Vmax (mV) En forma de cúpula (n = 12) Plana (n = 6) 0,3 l (n = 18) 0,5 l (n = 8) 1.0 l (n = 5)
un -waves
Pre-inyección -338 ± 13 -351 ± 13 -347 ± 9 -334 ± 16 -425 ± 15
Post-inyección -311 ± 8 -321 ± 16 -318 ± 11 -318 ± 18 -355 ± 29
b -waves
Pre-inyección 604 ± 30 578 ± 11 595 ± 20 542 ± 26 708 ± 21
Post-inyección 537 ± 35 551 ± 15 542 ± 24 538 ± 31 612 ± 45

dentro-page = "1"> T abla 4. Efecto de Subretiniana inyecciones en Escotópica Rod-mediada a - b y -waves. Análisis de la forma de la ampolla y el volumen de inyección en las respuestas a la luz de la retina (b -waves retina media y un fotorreceptor -waves).

Figura 1
Figura 1. Representación esquemática de Subretinal inyección. Un esquema de arriba hacia abajo de un ojo del ratón en la toma de muestra en el enfoque inyecciones tradicionales subretiniana, utilizando un transcorneal (flecha A) o transescleral (flecha b) lugar de la inyección, cerca de la pars plana. Este método utiliza un enfoque transescleral cerca del polo posterior (flecha c), logrado mediante la rotación del ojo por vía nasal para exponer el polo posterior.Les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Registro de Imágenes OCT permite la identificación de la retina Sitios para Análisis de espesor. AC, cara imagen de OCT de ratón 1os en la orientación origina. A) Imagen de pre-inyección de retina con cuadrícula de registro fusionado. B) Imagen de 10 minutos después de la inyección de retina. Una rejilla de 9 puntos se posicionó con el punto central en el sitio de desprendimiento máxima de la retina. sitio de la inyección es visible (flecha). C) Imagen de la retina 4 semanas después de la inyección con la cuadrícula de registro fusionado. DE, imágenes de ratón 9OS. D) la cara imagen de OCT de la retina 4 semanas después de la inyección que muestra extienden de desprendimiento subretiniana con baño. E)Superposición de fondo de ojo (verde) y en face imágenes de OCT de 10 minutos después de la inyección de retina. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Las inyecciones subretinales provocar una retención temporal de la retina destacamentos con un mínimo de retina adelgazamiento. Representativos de OCT B-Scans en el sitio de desprendimiento máxima de la retina se muestran para la pre-inyección, 10 min después de la inyección y 4 semanas después de la inyección. A) La formación y la resolución de una ampolla plana de una inyección de 0,3 l. B) Formación y resolución de una ampolla en forma de cúpula de una inyección de 0,5 l. C) La formación y la resolución de una ampolla en forma de cúpula de una inyección de 1,0 l. D) Ejemplo de cho severaRoidal cicatrización y el adelgazamiento de la retina en el sitio de la inyección. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Las retinas a conservar el funcionamiento normal después de la resolución de la ampolla. Las formas de onda para las respuestas de varilla mediada escotópicas se muestran para pre-inyección (línea de color negro) y 4 semanas después de la inyección (línea roja punteada) para A) 0,3 l, B) 0,5 l y C) inyecciones de 1,0 l en 9 intensidades de iluminación que van desde 4,37 x 10 -6 a 0,51 cd / m 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 5. reconstrucción 3D de ampollas. A) generada por software reconstrucciones en 3D de un representante) en forma de cúpula y B, C) vesículas planas de las inyecciones de 0,3 l. Nervaduras es un artefacto del software de reconstrucción. fronteras artificiales fueron colocados en C para permitir la reconstrucción. Barra de escala = 150 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

inyecciones subretinales son el método de elección para la administración de vectores virales y el tallo terapia derivada de células para la manipulación de fotorreceptores y RPE en la investigación básica y el tratamiento clínico. En los pacientes, las inyecciones subretinal se hacen típicamente con un sclerotomy anterior en la pars plana, una vitrectomía del núcleo posterior y la penetración de la retina por la aguja con visualización directa. Como con la mayoría de procedimientos de vitrectomía, es común para la formación de cataratas que se produzca prematuramente a menos que el ojo ya está pseudofáquicos. En ratones, las inyecciones de subretinal se hace tradicionalmente con el anterior sclerotomy a la retina, un método frecuentemente asociado tanto con nicking de la lente, que ocupa la mayor parte de la cavidad posterior del ojo, y la penetración Transretinal que puede conducir al atrapamiento vítreo y completa desprendimientos de retina. Usando una técnica posterior-enfoque en ratones reduce estas consecuencias no deseadas y mejora la capacidad de interpretar efdefectos de la manipulación previsto.

Ventajas de la técnica de inyección subretinal informado aquí incluyen efectos estructurales o funcionales mínimas y la reducción de daños colaterales (por ejemplo, enturbiamiento de nicking lente, fugas vítreo o inflamación) que permite la evaluación más fácil de los resultados experimentales y los tiempos de recuperación más rápidos. Esta técnica requiere una mayor manipulación del ojo para alcanzar el polo posterior, pero se puede completar en aproximadamente el 10 - 15 min por ojo con una alta tasa de éxito como sin ojos fueron rechazados del análisis. En la mayoría de las inyecciones, se observó la estructura de la retina normal y la función dentro de las 4 semanas. En comparación, los estudios previos reportan 5 - 8 semanas para que la recuperación de la estructura y función, o no informan de un tiempo de recuperación 6,7. En consecuencia, los experimentos se pueden completar en menos tiempo con menos animales.

Las complicaciones de esta técnica de inyección subretiniana incluyen la formación de cicatrices y pérdida defotorreceptores en aproximadamente el 10% de las inyecciones, con sólo tres casos de déficits estructurales y funcionales importantes. La retina retiene las respuestas normales a la luz con sólo el mayor cicatriz función decreciente a 80% de la respuesta de los fotorreceptores y 77% de la respuesta retiniana interna en comparación con pre-inyección. encarcelamientos retina podrían reducirse con el uso de una aguja nueva para cada inyección, aunque esto no se evaluó en el estudio actual. Alternativamente, pueden ocurrir debido a la presión negativa y por lo tanto ser inevitable. Encarcelamientos son muy comunes en inyecciones subretinianas humanos, sin embargo, debido al gran tamaño del ojo, encarcelamientos representan menos daño a la retina total. En consecuencia, si se ha inyectado un agente terapéutico, 90% de los ojos inyectados estaría disponible para la evaluación de los efectos de que la intervención.

La variabilidad en las mediciones del espesor de la retina antes y después de la inyección subretiniana refleja la reproducibilidad de tél octubre instrumento en ratones, la precisión de la alineación de los lugares de la retina a través de imágenes y cambios en la retina a partir de la inyección de solución salina fisiológica con colorante de fluoresceína de dosis baja. Estas medidas pueden servir para guiar los investigadores en los cálculos de potencia para el número de ojos y los lugares de la retina necesarios para detectar cambios estadísticamente válidas como resultado de las inyecciones subretinianas si o no un agente terapéutico está presente. En los 10 casos en los que había 9 puntos de la cuadrícula en todas las exploraciones de retina, la variabilidad del espesor de la retina fuera de la zona de inyección (5 - 8 puntos por ojo) era 7,2% ± 4,0%, incluso en ausencia de un tóxico o agente terapéutico o una distrofia de la retina hereditaria. Esta variabilidad es una consideración para la fijación de criterios para la comparación de los resultados clínicos usando modelos de ratón para los tratamientos subretinal, y sugiere fuertemente que los controles apropiados incluyen la inyección subretinal de vehículo en lugar de un ojo no inyectada 3. Por último, animamos Investigdores que se pueden hacer numerosas OCT scans de varias regiones de la retina antes de la inyección para mejorar la cobertura de la zona de inyección en todos los análisis.

es probable que se consigue eficacia terapéutica cuando los agentes experimentales se entregan a una mayor extensión de la retina. En estos casos, los volúmenes más grandes son ideales, pero pueden no ser necesarios como 0,3 inyecciones mu l menudo se forman vesículas planas que cubrían una gran zona de superficie de la retina. La forma de la ampolla no era controlable, aunque los volúmenes de inyección más grandes producen ampollas más en forma de cúpula. Hasta 1 l se puede inyectar sin resultados negativos, sin embargo, es posible que las ampollas en forma de cúpula se vuelven tan extendida que los toques de retina y se adhiere a la cápsula posterior del cristalino, particularmente en ratones jóvenes con bajos volúmenes vítreo. A pesar de que el volumen liberado de la jeringa, el volumen real dirigido al espacio subretiniano se calcula a ser menos. Esto puede reflejar el volumen que no se adquiere en los escáneres de TCO, en particular para abovedada o Flat ampollas, o un artefacto de las imágenes de OCT y la posterior reconstrucción, pero siempre son representativas de la pérdida de volumen de flujo de retorno a la retirada de la aguja.

En resumen, el uso de un abordaje posterior para inyecciones subretiniana tiene menos complicaciones y una recuperación mejorada, dando como resultado una alta tasa de éxito de la focalización y la baja tasa de exclusión. Esta técnica es ideal para manipulaciones virales, farmacológicos, y celulares de retinas de roedores.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hamilton Model 62 RN SYR Hamilton 87942 Syringe x 1
Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) Hamilton 7803-05 Needles x 6
Vannas Curved Scissors Ted Pella, INC. 1347 5 mm Blade
22.5 Degree Microsurgery Knife Wilson Ophthalmic Corp. 91204
Ketaject  Phoenix NDC 57319-609-02 Ketamine
Anased Lloyd Laboratories NDC 61311-482-10 Xylazine
Fluorescein 10% AK-Fluor Akorn NDC 17478-253-10 100 mg/ml
0.9% Saline USP Hospira NDC 0409-4888-50 0.9% NaCl
Antibiotic Ointment Akorn NDC 17478-235-35 Ophthalmic
Water Circulating Pump Gaymar TP-500 T/Pump  P/N 07999-000
sd-OCT Bioptigen R-Series Commercial
Fundus Camera Phoenix Research Laboratories MICRON III
Tweezers Type 3 Ted Pella, INC. 5385-3SU
2.5% Phenylephrine Paragon BioTeck NDC 42702-102-15 Ophthalmic
IMARIS8 Bitplane Version 8.1.2
ImageJ NIH V1.8.0_77
Hypromellose 2.5% Goniovisc AX0401 Methylcellulose
Eye Drops (Rinse) Bausch & Lomb Saline Solution
Microscope Zeiss Stemi 2000 Microscope
Light source Fostec P/N 20520 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
  2. Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
  3. Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
  4. Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
  5. Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
  6. Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
  7. Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
  8. Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
  9. Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
  10. Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
  11. Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
  12. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  13. Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
  14. Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
  15. Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).

Tags

Neurociencia No. 118 inyección subretiniana terapia transescleral desprendimiento de retina la terapia génica la terapia con células iPS terapia de células madre ERG OCT espesor de la retina
Un método alternativo de inyección y validado para acceder al espacio subretiniano<i&gt; vía</i&gt; Un enfoque posterior transescleral
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Parikh, S., Le, A., Davenport, J.,More

Parikh, S., Le, A., Davenport, J., Gorin, M. B., Nusinowitz, S., Matynia, A. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. J. Vis. Exp. (118), e54808, doi:10.3791/54808 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter