Abstract
Subretinal injektioner har använts med framgång i både människor och gnagare för att leverera terapeutiska ingrepp av proteiner, virala medel och celler till interphotoreceptor / subretinal fack som har direkt exponering mot fotoreceptorer och näthinnans pigmentepitel (RPE). Subretinal injektioner av plasminogen samt senaste prekliniska och kliniska prövningar har visat säkerhet och / eller effektivitet att leverera virala vektorer och stamceller till individer med avancerad retinal sjukdom. Musmodeller av näthinnesjukdom, särskilt ärftlig näthinnedystrofier, är avgörande för att testa dessa behandlingar. Det vanligaste injektionsproceduren hos gnagare är att använda små transcorneal eller transcleral snitt med en främre syn på näthinnan. Med denna metod, penetrerar injektionsnålen i neuro näthinnan störa den underliggande RPE och införande kan lätt nick linsen, vilket lins grumling och nedskrivning av icke-invasiv imaging. Åtkomst till subretinal utrymmet via en transcleral undviker posterior strategi dessa problem: nålen passerar sklera ca 0,5 mm från synnerven, utan retinal penetration och undviker att störa glaskroppen. Ytterligare skador är begränsad till den som är associerad med bränn sclerotomy och effekterna av en övergående, serös näthinneavlossning. Enkelheten i metoden minimerar ögonskada, säkerställer snabb retinal återfastsättning och återhämtning, och har en låg felfrekvens. Den minimala skador på näthinnan och RPE möjliggör tydlig bedömning av effektiviteten och direkta effekter av de terapeutiska medlen själva. Detta manuskript beskriver en ny subretinal injektionsteknik som kan användas för att målsöka virala vektorer, farmakologiska medel, stamceller eller inducerade pluripotent stem (iPS) celler till subretinalområdet i möss med hög effektivitet, minimal skada, och snabb återhämtning.
Introduction
Subretinal injektioner är det primära sättet att leverera cellulära och virala medel till näthinnor hos möss för att studera deras effekter på fotoreceptorer och underliggande RPE 1,2. De flesta subretinal injektion protokoll i möss använder en transcorneal eller en transcleral injektionsstället anterior till ekvatorn (Figur 1). Detta tillvägagångssätt kan leda till inneboende säkerhet skador som inkluderar nicking och resulterande grumling av linsen, störningar av integriteten av glaskroppen, penetration av neuro näthinnan och iris, retinal blödning, omfattande näthinneavlossning och varaktig subretinal ödem 3-9. Experimentella manipulationer måste övervinna dessa effekter för att utvärdera effekterna av terapeutiska ingrepp 3,7,10,11. Denna studie ger en detaljerad beskrivning och validering av en bakre transcleral injektionsmetod som undviker dessa komplikationer, minimerar trauma och har ett bra resultat att rikta subretinal utrymme.
Injektioner med inriktning på subretinal utrymmet i möss är ofta mycket svåra att utföra och de flesta forskare möter en hög frekvens av misslyckade försök i vilka vektorn levereras till en felaktig plats eller det finns betydande skada på näthinnan, till exempel i en komplett näthinneavlossning 6. Antalet ögon uteslutna från analys på grund av injektions komplikationer vanligen inte i mus studier, men i vår egen erfarenhet och i samarbete med andra forskare, kan antalet misslyckade injektioner vara så hög som 50% och varierar beroende på erfarenhet och kapaciteten hos den utredare som utför de injektioner. Framgången för insprutningen normalt bedöms genom direkt fundus avbildning och / eller optisk koherens tomografi (OCT) 7,9. En lätt behärskar metod med hög träffsäkerhet för subretinal injektioner i möss kan påskynda experiment och minska kostnaderna för prekliniska studier av treatments för retinala sjukdomar som är främsta orsakerna till blindhet i USA.
Den bakre är transcleral subretinal injektionsteknik som beskrivs här en anpassning från kliniska och prekliniska protokoll 9,12. De icke-invasiva diagnostiska bedömningar som görs i injicerade möss visar mild och mycket lokal skada och saknar ytterligare säkerheter lins, retinal och RPE skada. Dessutom med relativt lite övning, kan en försöks uppnå dessa resultat med ett bra resultat (80-90% eller bättre), och därigenom minska kostnaderna i samband med sådana studier. Detta förfarande kan användas för att leverera cellulära, virala, eller farmakologiska terapeutiska ingrepp på fotoreceptorer och / eller RPE i prekliniska studier och enkelt utvärdera experimentella åtgärder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur: Wild typ C57Bl / 6J möss uppfödda vid University of California i Los Angeles (UCLA). Alla djur var mellan 11 till 17 veckor gamla, och inkluderade manliga och kvinnliga möss. Alla möss hålls i grupp, underhållas i en 12:12 ljus mörker-cykel / med mat och vatten efter behag. Alla experiment utfördes i enlighet med de institutionella riktlinjerna för UCLA och Föreningen för forskning i Vision och Ögon uttalande för användning av djur i ögon och Vision Research.
OBS: Alla läkemedel och injicerbara medel är United States Pharmacopeia (USP) kvalitet.
1. Kirurgisk förberedelse
- Söva musen med en intraperitoneal injektion av 100 mg / kg ketamin och 8 mg / kg xylazin i en saltlösning mix. Administrera anestesi till ett djup så att musen har ingen tå nypa eller hornhinnan berörings reflexer.
- Bibehålla kroppstemperaturen vid 37,0 ° C med en cirkulerande vatten pad.
- Vidga elever med 2,5% fenylefrin ögon dROPS och trimma morrhår för att underlätta visualisering. Whiskers ge betydande sinnesintryck till musen, därför, morrhår trimning bör ta bort endast den del som blockerar klar tillgång för ögat, och inte till basen av morrhår. I vår erfarenhet, möss visar normal återhämtning efter detta förfarande. Applicera metylcellulosa ögondroppar för att förhindra torrhet och minimera anestesi inducerade transienta grå starr 13.
- Sterilisera instrument före kirurgi (dvs Betadine och etanol eller varma pärlor).
- Förbered utspädd fluorescein (0,01% med 0,9% saltlösning) i en steril miljö (dvs, biosäkerhet skåp) om visualisering kommer att utföras (se avsnitt 3 nedan).
2. Injektion Förberedelser på plats
- Förbered en spruta (t.ex. spruta 5 | il) med lämplig injektionsvolym (t.ex., från 0,3 till 1,0 | j, l).
- Placera musen så ögat är vänd uppåt och tydligt synlig i dissecting mikroskop.
- nypa försiktigt tidsbindhinnan med fin spets pincett. Gör en omkrets snitt på cirka 90 grader med hjälp böjd Vannas sax.
- Upprepa steg 2,3 med den underliggande Tenons kapsel.
- Resekera den omgivande bindväven med fin spets pincett under rotation av världen nasalt. Arbetet mot injektionsstället cirka 0,5 mm tids på synnerven. Använd stor försiktighet för att undvika att störa retroorbital sinus.
3. Sclerotomy och subretinal Injektion
OBS: Det rekommenderas att injektionen av 0,01% fluorescein i 0,9% koksaltlösning kan användas för att hjälpa till med visualisering samtidigt lära detta förfarande. Den topografiska fördelningen av fluorescein effektivt kan dokumenteras med fundus imaging (se avsnitt 4 nedan).
- Gör en liten skleral snitt vid injektionsstället genom att försiktigt skrapa ögonmusslan med en 22,5 graders ögon blad. Detta snitt should endast vara tillräckligt stor för att tillåta spetsen av nålen att passera genom sklera.
- Sätt den avfasade 33 G nål (vinklad 5 -. 10 ° i sclerotomy med koniska vänd och vinklade parallellt med näthinnan Injicera önskad volym (t.ex. 0,3 till 1,0 pl 0,01% Fluorescein för utbildningsändamål).
OBS: Underhåll sprutans sterilitet genom grundlig rengöring med successiva tvättar av ett lämpligt lösningsmedel och DI vatten före varje injektion. - Tryck kolven långsamt (över ~ 3 sekunder) utan att flytta nålen och med jämnt tryck.
OBS: När nålen är i subretinalområdet kommer ett svagt motstånd känns samtidigt trycka på kolven. Det blir ingen till minimalt motstånd om nålen punkterar näthinnan, och hög motståndskraft om nålen inte penetrerar sklera eller RPE. - Vänta några sekunder innan nålen dras ut för att minimera återflöde.
- Skölj ögat med steril saltlösning och säkerställa ögat hsom vrids tillbaka till sitt normalläge.
4. Bedömning av Näthinneavlossning av oktober och Fundus Imaging
- Utför oktober avbildning omedelbart efter injektion för att utvärdera kvaliteten på injektionen och vid lämplig tidpunkter efter injektion som behövs för att utvärdera retinal struktur.
OBS: Exempel på användning av oktober i liknande studier har tidigare beskrivits 7,14.- Justera och anpassa oktober bilden att rikta injektionsstället. Injektionsstället bör vara mittlinjen och 0,5 mm tids till papillen. Upprepa efter behov om avskiljandet är ur ramen eller inte optimalt centrerad.
- Visualisera näthinneavlossning och färga injektionsstället med en ansikte fundus avbildning 7,14.
OBS: Om ett oktober bildsystem inte är tillgängligt, injektion av en liten mängd av fluorescein med en vektor för praktiken kommer att möjliggöra visualisering med någon ögonbottenkamera som utför fluorescein angiography med användning av samma exciteringsvåglängder och blockering filter. Lokaliserade områden av hyper-fluorescens visas under kärl och kärlsystemet har skarpa och tydliga gränser om subretinalområdet riktas korrekt. Kanten på bubblan från injektionen kommer att avgränsas av övergången från hyper till hypo- fluorescens. Flera instrument ger denna möjlighet för musen; instrumente som används här beskrivs på annat håll 14.
5. Postoperativ vård
- Applicera ett tjockt lager av triple antibiotikum ögonkräm på hornhinnans yta av den injicerade ögat.
- Placera möss i rena ensamma burar för återhämtning. Kombinera inte möss som har genomgått kirurgi tills de är helt återställd.
- Övervaka andning och temperatur under anestesi återhämtning. Övervaka djur tills de kan behålla sternala VILA.
- Utför ytterligare lämplig postoperativ övervakningoch behandling, inklusive en sub-kutan injektion av karprofen (5 mg / kg) för postoperativ smärthantering.
6. Bedömning av Retinal funktion genom Elektroretinografi (ERG)
- Utför ERG analys före injektionen och vid lämpliga tidpunkter efter injektion som behövs för att utvärdera retinal funktion. Om injektionen gjordes i subretinal utrymme, bör näthinneavlossning lösa inom 72 timmar.
- Använd standard ERG tekniker för att utvärdera retinal funktion före och efter injektion som tidigare beskrivits 14,15.
7. 3D-rekonstruktion och Bleb Volym Kvantifiering
OBS: oktober avsökningar med hög kontrast som omfattar hela lösgör inom ramen för vyn är optimala för användning. ImageJ / Fiji 17,18 och Imaris användes, men andra program kan användas.
- Exportera b-scan av intresse, import till ImageJ / Fiji och grödor (Bild> Beskär) den del av oktober scen som ska modelleras med den rektangulära markeringsverktyget.
- Justera kontrasten (Bild> Justera> Ljusstyrka / Kontrast) och avgränsa saknade gränser genom att ansluta två sektioner med en linje.
- Rita en rak linje med linjeverktyget (håller skift) som spänner över RPE till fotoreceptorskiktet. Mät (Analysera> mått) längden på linjen för att få storleken på maximal avskildhet för steg 7,8.
- Import beskärs ramar till 3D-rekonstruktion programvara (se tabell of Materials) med "RGB till grå" plugin och MATLAB Compiler Runtime.
- Ställ in voxelstorleken (under Bildegenskaper) med hjälp av kalibreringsparametrar från oktober scan (x, y, z).
- Kör "RGB Gray" plugin (under Bildegenskaper), med lika viktning för varje kanal, för att skapa en fjärde kanal. Radera ursprungliga röd-grön-blå kanalen.
- Vänd grå kanal med kontrast förändring. Store Bild.
- Klicka på "lägga till enew yta "-knappen på fliken 3D-View och börja den guidade fyra steg för att skapa ytan.
- Ställ detalj ytnivå (steg 1 av 4).
OBS: Enligt vår erfarenhet 8,0-12,0 var det mest effektiva området. - Ställa in maximal sfär storlek (under Bakgrund Val) till något mindre än den maximala lossnar storlek mätt i 7.1.2. Skapa ytan och ångra grå kanal inversion (steg 2 av 4).
- Ställ in tröskelvärdet till maximivärdet så att ytan av de negativa utrymmen utanför av näthinnan och avskiljandet inte kommer i kontakt (steg 3 av 4).
- Ställ in filtertyp till antalet voxlar och isolera den negativa utrymmet i lösgör plats efter storlek. Avsluta ytan (steg 4 av 4).
OBSERVERA: Volymen på lösgör ytan är belägen under volym på fliken statistik.
- Ställ detalj ytnivå (steg 1 av 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bakre snitt transcleral subretinal injektioner utfördes på 31 friska ögon från 16 möss av vildtyp med injektioner av 0,3 | j, l (n = 18), 0,5 | il (n = 8) och 1,0 | j, l (n = 5) av 0,01% fluorescein. Ett öga uteslöts från injektion på grund av ett tidigare existerande korneal opacitet som förhindrade strukturell och funktionell analys. Varje injicerade ögat ingår i denna rapport. Inga oavsiktliga näthinneavlossning, punkteringar av neuro näthinnan, eller läckage in i glaskroppen detekterades inte heller några bevis för linsnick, inflammatoriska svar, uveit, eller postoperativa infektioner i några ögon observeras.
Retinal struktur bedömdes före injektion, 10 min efter injektion och 4 veckor efter injektion med användning av oktober avbildning (figurerna 2 och 3). En 9-punkts rutnät, med mittpunkten ligger över centrum av maximal avskildhet, placerades på 10-minefter injektionen en face scan (Figur 2B). Använda kärllandmärken, före injektion och fyra veckor efter injektion skannar roterades att vara i register med 10 minuter efter injektionen scan. Detta möjliggjorde identifiering av exakt samma platser i före och efter injektion retinal skannar (Figur 2A, C).
Subretinal injektioner ledde Bleb formation som centrerades bort från injektionsstället där nålen in i subretinal utrymmet (figur 2B pil), och var antingen platt (figur 3A) med en ytlig avskildhet som sträcker sig över ett utökat område eller välvd (Figur 3B - D) med djup lösgöring i en begränsad area (tabell 1). En välvd blåsa definierades som någon avskildhet som översteg 50 um ortogonala till RPE. Inga rosetter, en vågmönster som produceras genom sträckning av de yttre retinaskikt, observerades. extält injektions nedfall visualiserades med en face oktober (figur 2D, streckad linje), fluorescein fundus avbildning (Figur 2E) och OCT B-Skannar (Figur 3). Majoriteten av blåsor (29 av 31) förlängas utöver den synfält ULT skannar, som omfattar cirka 10% av musen näthinnan. Det fanns ingen kontroll över Bleb form annan än ökad frekvens av kupolformade blåsor med injektions större volymer (tabell 1). Alla blåsor lösas genom 2 veckor (data ej visade).
Total retinal tjocklek (Bruchs membran till nervfiberskiktet) kvantitativt utvärderas 4 veckor efter injektion för 0,3 | j, l (figur 3A), 0,5 | il (figur 3B) och 1,0 | j, l (figur 3C) injektionsvolymer i varje punkt på gallret närvarande i motsvarande b-skannar (tabell 1). Den procentuella skillnaden (% Δ) wsom beräknas som skillnaden i förhållande till pre-injektionsmätningar för både strukturella och funktionella mätvärden. Inte alla rutnätspunkter förvärvades under alla avbildning sessioner. Till exempel, 3 ögon hade 1 eller 2 poäng, 4 ögon hade 3 eller 4 poäng, och 23 ögon hade fem till nio poäng i alla scanningar. Kupolformade och platta blåsor, och injektionsvolymerna kollapsade sedan total retinal tjocklek var inte signifikant olika för för- och efter injektioner, även om en allmän trend mot retinal gallring observerades för båda (tabell 2).
Ytterligare analyser visade liten men statistiskt signifikant uttunning av 6,5% ± 1,9 övergripande (pre = 196 ± 1, n = 31; post = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3,4, p = 0,001) (tabell 3). Att avgöra var retinal gallring skett, var en delmängd av 10 ögon som innehöll tjockleksmätning för alla 9 rutnätspunkter analyseras. I likhet med analysen av alla ögon,delmängd av ögon visade också liten men signifikant övergripande retinal gallring (10,3% ± 3,5, pre = 199 ± 1, n = 10; post = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2,4, p = 0,02). Ingen retinal gallring observerades vid ställen distalt om injektionsstället (7,2% ± 4,0, pre = 199 ± 2, n = 10; post = 185 ± 8, n = 10, T 18 = 1,7, p = 11). Retinal gallring observerades vid stället för maximal näthinneavlossning (11,2% ± 5,0, pre = 201 ± 2, n = 10; post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2,1, p = 0,04), injektionsstället utan skador (13,8 ± 6,0, = 201 ± 1, n = 4 pre; post = 173 ± 10, n = 4, T 6 = 2,8, p = 0,03), injektionsställen med retinal fängslande när en liten region av näthinnan är dras genom sklera vid nålens tillbakadragande (14,1% ± 1,0, pre = 199 ± 1, n = 3; post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8,9, p = 0,001) och injektionsställe för ärrbildning (26,5% ± 1,6, pre = 200 ± 3, n = 3; post = 147 ± 10, n = 3, T 4 = 5,1, p = 0,007). Totalt incarcerations inträffade i 14 av 31 injektioner, 3 av vilka resulterade i ärrbildning av åderhinnan med förlust av upp till hälften av de yttre retinaskikt (figur 3E). I varje fall, men dessa var mycket lokaliserade effekter.
Full-fältet Elektroretinografi utfördes före injektion och upprepades 4 veckor efter injektion med relativa förändringar bedöms individuellt för varje öga för att bedöma funktionella förändringar (tabell 1). Endast mörk anpassad och stavförmedlade svar registrerades. Intensitet svarsfunktioner försågs med Michaelis-Menten ekvationer för att härleda Vmax för båda fotoreceptorer (a -waves) och mellan näthinnan (b -waves). Svar påverkades inte av Bleb form och därför kollapsade (tabell 4). Det fanns en liten men statistiskt signifikant minskning av Vmax påen -waves (F (1, 28) = 7,1, p = 0,013), men inte b -waves (F (1, 28) = 4,0, p = 0,055) efter injektion (tabell 4). Representativa vågformer för före och efter injektion av 0,3 l, 0,5 l och 1,0 l visas (Figur 4). Det fanns en effekt av injektionsvolym på både a - och b -waves (F (2, 28) = 6,2, p = 0,006 och F (2, 28) = 8,8, p = 0,001 respektive).
Slutligen var 3D-modellering används för att visualisera strukturen av både kupolformade och platta blåsor. Ett exempel på en välvd blåsa (Figur 5A) visar en välvd vätskefylld lossnar finns inom scanningsområdet. Exempel från platta blåsor (figur 5B, C) visar grunda vätskefyllda områden som sträcker sig utanför området för skanningen. När retinal fängslande inträffar ett litet hål i återuppbyggnaden sett (figur 5C). Artificiella gränser visas vid kanten av en skannings to tillåta rekonstruktionen (figur 5C). Beräkning av Bleb volymerna från dessa provinjektioner indikerade att minst 0,15 l och 0,01 l framgångsrikt riktad till subretinal utrymme för 0,3 il injektioner resulterar i kupolformade och platta blåsor, respektive. Den beräknade volymen injiceras sannolikt underskattar den verkliga volymen på grund av upplösning av avbildning och återuppbyggnad, resorption av vätska under förfarandet som förekommer i mänskliga subretinal injektioner, och för plana eller välvda blåsor i synnerhet, om hela lossnar inte var representerad i de ULT skannar.
Tabell 1. funktionella och strukturella effekterna av subretinal injektioner med ögat. Metrics enskilda ögon och deras resultat från subretinal injektioner. Retinal svar på ljus (mitten näthinnan b -waves och fotoreceptorn en -vågs) och retinal tjockleksmätning (Bruch membran nervfiberskiktet) ges. fotnoter:
BT = Bleb typ, Flat (F) eller Domed (D)
b #gp = antal rutnätspunkter mätt
* Ögon som används för rekonstruktion av injektionsvolym.
** Endast en stödpunkt för mätning på ärr.
# Eyes med ärrbildning.
| Tid | domed bleb | platt bleb | 0,3 | il | 0,5 ^ | 1,0 | il | |
| (| im) | (| im) | (| im) | (| im) | (| im) | ||
| Pre-injektion 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Efter injektion | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Tabell 2. Effekt av subretinal injektioner på Totalt retinal tjocklek. Analys av Bleb form och injektionsvolymen på retinal tjocklek.
| Tjocklek (^ m) | |||||
| Plats | n (ögon) | I förväg | 4 wk | Δ | % Δ |
| Retina (alla överensstämmande punkter) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6,5 ± 1,9 |
| Retina med alla 9 rutnätspunkter * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3,5 |
| Distalt Injection * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7,2 ± 4,0 |
| Maximal Detachment * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Injektion utan Skada * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Inspärrning vid injektions * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Ärr på Injection * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1,6 |
Tabell 3. Effekt av skada på näthinnan struktur. Analys av platsberoende retinal gallring. Fotnoter: * Analys från 10 möss med data från alla 9 rutnätspunkter.
| Vmax (μV) | Kupolformade (n = 12) | Platta (n = 6) | 0,3 | j, l (n = 18) | 0,5 pl (n = 8) | 1,0 l (n = 5) |
| a -waves | |||||
| Pre-injektion | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Efter injektion | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Pre-injektion | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Efter injektion | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
inom-page = "1"> T abell 4. Effekt av subretinal injektioner på scotopic Rod-medierad a - och b -waves. Analys av Bleb form och injektionsvolymen på näthinnan svar på ljus (mitten näthinnan b -waves och fotoreceptorn en -waves).
Figur 1. Schematisk representation av subretinal Injection. En top-down schema över en mus öga i sockeln visar strategi traditionella subretinal injektioner, med användning av en transcorneal (pil a) eller transcleral (pil b) injektionsstället nära pars plana. Denna metod använder en transcleral tillvägagångssätt nära den bakre stolpen (pil c), uppnås genom att rotera ögat nasalt att exponera den bakre stolpen.les / ftp_upload / 54.808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Registrering av ULT bilder medger identifiering av retinal platser på Tjocklek analys. AC, en face oktober bild av mus 1OS i ursprungliga orienteringen. A) Bild av näthinnan före injektion med smält registrerings rutnät. B) Bild av näthinnan 10 min efter injektion. En 9-punkts rutnät placerades med centrumpunkten vid platsen för maximal näthinneavlossning. Injektionsstället är synlig (pil). C) Bild av näthinnan 4 veckor efter injektion med smält registrerings rutnät. DE, bilder av mus 9OS. D) en face oktober bilden av näthinnan 4 veckor efter injektion visar omfattningen av subretinal lossnar. E)Överlagring av ögonbotten (grön) och en face OCT bilder av näthinnan 10 minuter efter injektion. Skalstreck = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. subretinal injektioner orsaka tillfälliga näthinneavlossning med minimal retinal gallring. Representativa ULT B-Skannar vid stället för maximal näthinneavlossning är visade för pre-injektion, 10 min efter injektion och 4 veckor efter injektion. A) Bildning och upplösning av en platt blåsa från en 0,3 l injektion. B) Bildning och upplösning av en välvd blåsa från en 0,5 l injektion. C) Bildning och upplösning av en välvd blåsa från en 1,0 l injektion. D) Exempel på allvarlig choroidal ärrbildning och retinal gallring vid injektionsstället. Skalstreck = 100 | j, m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. näthinnor Behåll Normalt funktion vid bubblan upplösning. Vågformer för scotopic stavförmedlade svar visas för pre-injektion (svart linje) och 4 veckor efter injektion (röd streckad linje) för A) 0,3 l, B) 0,5 l och C) 1,0 il injektioner på 9 belysningsnivåer som sträcker sig från 4,37 x 10 -6 till 0,51 cd / m 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. 3D-rekonstruktion av blåsor. A) Programvara genererade 3D-rekonstruktioner av representativa A) välvd och B, C) platta blåsor från 0,3 il injektioner. Ribbing är en artefakt av återuppbyggnadsprogram. Artificiella gränser placerades i C för att möjliggöra rekonstruktion. Skalstreck = 150 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal injektioner är metoden för leverans av virala vektorer och stamcellshärledda terapi för att manipulera fotoreceptorer och RPE både grundforskning och klinisk behandling. Hos patienter är subretinal injektioner vanligtvis görs med en främre sclerotomy vid pars plana, en bakre kärna vitrektomi och penetration av näthinnan av nålen med direkt visualisering. Som med de flesta vitrectomy förfaranden, är det vanligt att kataraktbildning ske i förtid om ögat är redan pseudoafaki. I möss, är subretinal injektioner traditionellt gjort med sclerotomy anterior till näthinnan, en metod som ofta förknippas med både hackning av linsen, som upptar huvuddelen av den bakre kaviteten av ögat, och Transretinal penetrering som kan leda till glaskroppen infångning och full näthinneavlossning. Med hjälp av en bakre-strategi teknik möss minskar dessa oönskade konsekvenser och förbättrar förmågan att tolka effekter av den avsedda manipulation.
Fördelar med subretinal injektionsteknik rapporteras här inkluderar minimala strukturella eller funktionella effekter och minskad collateral damage (t.ex. grumling från linsnick, glaskroppen läcker eller inflammation) som möjliggör enklare bedömning av experimentella resultat och snabbare återhämtning gånger. Denna teknik kräver större manipulation i ögat för att nå den bakre polen men kan fyllas i cirka 10 - 15 min per öga med ett bra resultat eftersom inga ögon avvisades från analys. I de flesta injektioner normal retinal struktur och funktion inom 4 veckor. Som jämförelse, tidigare studier rapporterar 5 - 8 veckor för återvinning av struktur och funktion eller inte rapporterar en återhämtningstid 6,7. Följaktligen kan experiment genomföras på mindre tid med färre djur.
Komplikationer av denna subretinal injektionsteknik ingår ärrbildning och förlust avfotoreceptorer i cirka 10% av injektioner, med endast tre fall av betydande strukturella och funktionella brister. Näthinnan behöll normala reaktioner på ljus med bara den största ärret avtagande funktion till 80% av fotoreceptor respons och 77% av inner retinal svar jämfört med pre-injektion. Retinala incarcerations kan minskas med hjälp av en ny nål för varje injektion, även om detta inte utvärderades i den aktuella studien. Alternativt kan de uppträda på grund av negativt tryck och sålunda vara oundviklig. Incarcerations är mycket vanliga i humana subretinal injektioner, men på grund av den stora storleken av ögat, representerar mindre skador på den totala näthinnan incarcerations. Följaktligen, om ett terapeutiskt medel hade injicerats, skulle 90% av injicerade ögonen vara tillgängliga för utvärdering av effekterna av denna intervention.
Variationen i näthinnan tjockleksmätning före och efter subretinal injektion speglar reproducerbarhet tHan oktober instrument på möss, precisionen i rikta retinala platser över bilder och retinala förändringar från injektion av fysiologisk saltlösning med låg dos fluoresceinfärgämnet. Dessa mätningar kan användas för att vägleda utredarna i kraft beräkningar för antalet ögon och retinala platser som krävs för att detektera statistiskt giltiga förändringar till följd av subretinal injektioner huruvida ett terapeutiskt medel är närvarande. I de 10 fall för vilka det fanns 9 rutnätspunkter i alla retinal avsökningar, variabiliteten av retinal tjocklek utanför injektionsstället (5 - 8 poäng per öga) var 7,2% ± 4,0%, även i frånvaro av en toxisk eller terapeutiskt medel eller en ärftlig retinal dystrofi. En sådan variation är en ersättning för att fastställa kriterier för jämförelse av kliniska resultat med hjälp av musmodeller för subretinal behandlingar, och föreslår att lämpliga kontroller inkluderar subretinal injicering av fordon snarare än en icke-injicerade öga 3. Slutligen uppmuntrar vi Investigtörer att göra många ULT skanningar av flera näthinnans regioner före injektion för att förbättra täckningen av injektionsstället i alla scanningar.
Terapeutisk effekt kommer sannolikt att uppnås när experimentella medel levereras till en större vidd av näthinnan. I dessa fall, större volymer är idealiska, men kan inte vara nödvändigt eftersom 0,3 il injektioner bildas ofta platta blåsor som täckte en stor retinal yta. Bubblan form var inte kontrollerbar, även om större injektionsvolymer producerat mer välvda blåsor. Upp till 1 l kan injiceras utan negativa resultat, men det är möjligt att kupolformade blåsor blir så utvidgas att näthinnan handen och följer den bakre kapseln av linsen, i synnerhet i unga möss med låga glas volymer. Trots den levererade volymen från sprutan, är den faktiska volymen riktad till subretinalområdet beräknades vara mindre. Detta kan återspegla volym som inte förvärvas i territorierna skannar, särskilt för välvd eller flat blåsor, eller en artefakt av oktober skanning och efterföljande återuppbyggnad, men kan återspegla volymförlust från backflöde vid indragning av nålen.
Sammanfattningsvis, med hjälp av en bakre metod för subretinal injektioner har färre komplikationer och förbättrad återhämtning, vilket resulterar i ett bra resultat av inriktning och låg utslagning. Denna teknik är idealisk för virala, farmakologiska och cellulära manipulationer av gnagare näthinnor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
