Abstract
Subretinal enjeksiyonları başarıyla doğrudan fotoreseptör maruz kalma ve retina pigment epitel (RPE) sahiptir interfotoreseptör / subretinal bölmeye proteinlerin terapötik girişimlerin viral ajanlar, ve hücreleri sunmak için insanlar ve kemirgenler hem de kullanılmıştır. plazminojen subretinal enjeksiyonları yanı sıra son klinik öncesi ve klinik çalışmalarda ileri retina hastalığı olan bireylerin viral vektörlerin ve kök hücreleri sunma güvenliğini ve / veya etkinliğini göstermiştir. retina hastalıkları, özellikle de kalıtsal retinal distrofilerin fare modelleri, bu tedavilerin test etmek için gereklidir. Kemirgenlerde en yaygın enjeksiyonundan retinaya bir anterior küçük transkorneal ya transkleral kesiler kullanmaktır. Bu yaklaşımla, enjeksiyon iğnesi altında yatan RPE ve yerleştirilmesine bozarak nörosensöriyel retina nüfuz kolayca nick lens, lens kesafeti ve non-invaziv IMAGI bozulmasını nedenng. Bir transkleral yoluyla subretinal alan erişme, posterior yaklaşım bu sorunları önler: iğne retina penetrasyon olmadan, optik sinir yaklaşık 0.5 mm sklerasına geçer ve vitrözü kesintiye önler. Tali hasar odak sklerotomili ve geçici, seröz retina dekolmanı etkileri ile bağlantılı olduğu sınırlıdır. yöntemin basitliği, göz yaralanması en aza indirir hızlı retina yatıştırıldı ve iyileşme sağlar ve düşük başarısızlık oranı vardır. retina ve RPE minimal hasar etkinliğinin net değerlendirme ve terapötik ajanların kendilerini doğrudan etkileri için izin verir. Bu yazıda, viral vektörler, farmakolojik ajanlar hedef yüksek etkinlik, en az hasar ve hızlı bir iyileşme ile farelerde retina altı alana hücreleri ya da uyarılmış pluripotent kök (IPS) kök hücreler için kullanılabilecek yeni bir retina altı enjeksiyon tekniği tarif etmektedir.
Introduction
Subretinal enjeksiyonları fotoreseptör ve altta yatan RPE 1,2 üzerindeki etkilerini incelemek için farelerin retina hücresel ve viral ajanlar sunan birincil yolu vardır. Farelerde en subretinal enjeksiyon protokolleri transkorneal veya ekvatora bir transkleral enjeksiyon sitesi anterior (Şekil 1) kullanın. Bu yaklaşım nicklemek ve lens bileşke bulanıklığı, retinada ve iris, retina kanaması, önemli retina dekolmanı ve kalıcı subretinal ödem 3-9 camsı, penetrasyon bütünlüğünün bozulması içeren doğal kollateral hasara neden olabilir. Deneysel manipülasyonlar terapötik girişimlerin 3,7,10,11 etkilerini değerlendirmek amacıyla bu etkileri aşmak gerekir. Bu çalışma, bu komplikasyonları önler posterior transkleral enjeksiyon yöntemi ayrıntılı bir açıklamasını ve doğrulama sağlayan travmayı en aza indirir ve alt hedefleme yüksek bir başarı oranına sahiptirretina alanı.
Farelerde subretinal alan hedefleme Enjeksiyonlar genellikle gerçekleştirmek çok zordur ve çoğu araştırmacı vektör yanlış bir konuma teslim edilir veya önemli retina hasarı tam retina dekolmanı 6 örneğin, var olduğu başarısız girişimleri yüksek frekanslı karşılaşıyoruz. Çünkü enjeksiyon komplikasyonlar analize dahil gözlerin sayısı genellikle fare çalışmalarında rapor değil, ama bizim kendi deneyim ve diğer araştırmacılar ile tartışmaya başarısız enjeksiyon sayısı% 50 kadar yüksek olabilir ve deneyime bağlı olarak değişebilir ve enjeksiyonları gerçekleştiren araştırmacının yetenekleri. Enjeksiyon başarısı genellikle direkt fundus görüntüleme ve / veya optik koherens tomografi (OKT) 7,9 değerlendirilir. Farelerde subretinal enjeksiyon için yüksek başarı oranları ile kolayca hakim yöntem deneme hızlandırmak ve tre klinik öncesi çalışmalarda maliyetini düşürebilirABD'de körlüğün başlıca nedenleridir retina hastalıkları için atments.
Arka, burada açıklanan transkleral subretinal enjeksiyon tekniği klinik ve klinik öncesi protokoller 9,12 bir uyarlamasıdır. enjekte edilen farelerde yapılan girişimsel olmayan tanı değerlendirmeler hafif ve son derece lokalize hasara göstermek ve ek teminat objektif, retina ve RPE hasarı yoksundur. böylece bu çalışmalarla ilgili maliyetlerin azaltılması, - (% 90 ya da daha iyi 80) Ayrıca, nispeten daha az uygulama ile, bir deneyci yüksek başarı oranı ile bu sonuçlar elde edebilirsiniz. Bu prosedür klinik öncesi çalışmalarda fotoreseptör ve / veya RPE, hücresel viral veya farmakolojik tedavi edici girişimler sunmak için ve kolayca deneysel müdahaleleri değerlendirmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar: Los Angeles, California Üniversitesi (UCLA) yetiştirilen Yabani tip C57Bl / 6J fareler. 17 haftalık ve erkek ve dişi fareler dahil - Bütün hayvanlar 11 arasında idi. Tüm fareler grubu yerleştirilmiştir, yiyecek ve su ad libitum 12:12 aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu. Bütün deneyler Oftalmik ve Vision Research Hayvanların Kullanım UCLA ve Vizyon Araştırma Derneği ve Oftalmoloji Tablosu kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı.
NOT: Tüm ilaçlar ve enjekte ajanlar Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) notu bulunmaktadır.
1. Cerrahi Hazırlık
- tuzlu karışımı 100 mg / kg ketamin ve 8 mg / kg ksilazin ve intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi. Fare hiçbir ayak tutam veya kornea dokunmatik refleksleri böyle bir derinliğe anestezi uygulayınız.
- Bir dolaşan su pedi ile 37.0 ° C vücut ısısını korumak.
- % 2.5 fenilefrin göz d öğrencileri dilateROPS ve trim bıyık görselleştirme kolaylaştırmak için. Bıyık nedenle, bıyık o gözle bloklar açık erişim, değil bıyık tabanına sadece bir bölümünü kaldırmak gerekir kırparak, fare önemli duyusal girdi sağlamaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, fareler bu işlemden sonra normale iyileşme göstermektedir. Metilselüloz göz uygulayın kuruluğunu önlemek ve anestezi kaynaklı geçici katarakt 13 en aza indirmek için düşer.
- Cerrahi (yani, betadin ve etanol veya sıcak boncuk) öncesinde aletleri sterilize.
- Görselleştirme yapılacaksa, steril bir ortamda seyreltilmiş fluoresein (% 0.01,% 0.9 tuz kullanılarak) hazırlayın (örneğin, biyo-güvenlik kabini) (aşağıdaki bölüm 3).
2. Enjeksiyon Sitesi Hazırlama
- Uygun enjeksiyon hacmi (örneğin, 0,3-1,0 ul) ile bir şırınga (örneğin, 5 ul şırınga) hazırlayın.
- Göz di açıkça görülebilir yukarı bakacak ve böylece fare yerleştirinmikroskop ssecting.
- Yavaşça ince uçlu forseps ile zamansal konjonktivayı tutam. kavisli Vannas makas kullanılarak yaklaşık 90 derecelik bir çember boyunca bir kesi olun.
- altta yatan Tenon kapsülü ile adımı yineleyin 2.3.
- burundan dünya dönerken ince uçlu forseps ile çevreleyen bağ dokusu rezeke. optik sinir yaklaşık 0,5 mm zamansal enjeksiyon yerinde doğru çalışın. retro-orbital sinüs bozmamak için büyük özen kullanın.
3. Sklerotomi ve Subretinal Enjeksiyon
NOT: Bu prosedür öğrenme sırasında% 0.9 Saline% 0.01 floresein enjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için kullanılması tavsiye edilir. floresein topografik dağılımı etkili bir fundus görüntüleme (aşağıda bölüm 4'e bakınız) ile belgelenebilir.
- yavaşça 22.5 derecelik oftalmik bıçak ile Göz yuvası çizilerek enjeksiyon yerinde küçük bir skleral kesi yapmak. Bu kesi shouSadece iğne ucu sklera geçmesine izin verecek kadar büyük olması ld.
- 5 açılı eğimli 33 G iğne (takın -. Konik bakan ve retinaya açılı paralel olan sklerotomili içine 10 ° (istenilen hacim enjekte örneğin, öğrenme amaçlı% 0.01 Floresein 0.3 1.0 ul).
Not: iyice her enjeksiyondan önce müsait bir çözücü ve DI suyla art arda yıkama ile temizlenerek şırınga sterilliğini korumak. - İğneyi hareket ettirmeden ve hatta basınçla pistonu yavaşça (over ~ 3 saniye) basın.
NOT: İğne subretinal alan olduğunda Medyumu ederken, hafif bir direnç hissedilecektir. İğne sklera veya RPE nüfuz etmediği takdirde iğne retina ve yüksek direnç deler eğer minimum dirençle hiçbir olacaktır. - geri akışı en aza indirmek için iğne çekilerek önce birkaç saniye bekleyin.
- Steril tamponlu tuzlu su ile göz durulayın ve göz h sağlamakgeri normal pozisyonuna döndürülmüş olarak.
OCT ve Fundus Görüntüleme tarafından Retina Dekolmanı 4. Değerlendirme
- enjeksiyondan hemen kalitesini değerlendirmek için enjeksiyondan sonra ve uygun zamanda Ekim görüntüleme gerçekleştirmek retinal yapıyı değerlendirmek için gerekli post-enjeksiyon işaret ediyor.
Not: Benzer çalışmalarda OKT kullanımına örnekler, daha önce 7,14 tarif edilmiştir.- Ayarlayın ve enjeksiyon siteyi hedef Ekim görüntüyü aynı hizaya getirin. enjeksiyon yeri orta hat ve optik sinir başı temporal 0,5 mm olmalıdır. optimal merkezli dekolmanı çerçevesinin dışında ise gerekli ya da değil tekrarlayın.
- Retina dekolmanı görselleştirmek ve en-yüz fundus görüntüleme 7,14 ile enjeksiyon alanını boya.
Not:, OCT görüntüleme sistemi mevcut değilse, uygulama için bir vektör ile floresan bir miktar enjeksiyon floresein anjiyo gerçekleştiren bir fundus kamera ile görselleştirme sağlayacakAynı uyarma dalga boyları kullanarak ve filtreler engelleme grafisi. hiper-floresan lokalize alanlar damarsal altında görünecek ve subretinal alan doğru hedeflenmiş ise damarsal keskin ve belirgin sınırları olacaktır. enjeksiyondan bleb kenarı hipo floresan hiper geçiş ile sınırları çizilmiş olacaktır. Çeşitli enstrümanlar fare için bu yeteneği sağlar; Burada kullanılan enstrümantasyon başka yerde 14 tarif edilmiştir.
5. Post-operatif Bakım
- Enjekte gözün kornea yüzeyine üçlü antibiyotik göz krem kalın bir kat uygulayın.
- kurtarma için temiz yalnız kafeslerde fareler yerleştirin. Onlar tamamen iyileşti kadar ameliyat geçiren fareler bir araya etmeyin.
- Anestezi kurtarma sırasında solunum ve sıcaklığını izlemek. Onlar sternum yatma koruyabilirsiniz kadar hayvan izleyin.
- Ek uygun post-operatif izleme gerçekleştirmekve ameliyat sonrası ağrı tedavisi için karprofen bir deri altı enjeksiyon (5 mg / kg) de dahil olmak üzere tedavi.
Elektroretinografi tarafından Retina Fonksiyonun 6. Değerlendirmesi (ERG)
- ERG analiz ön enjeksiyon gerçekleştirmek ve uygun zamanlarda retina fonksiyonlarını değerlendirmek için gerektiği gibi enjeksiyon sonrası. Enjeksiyon subretinal boşluğa yapılmış ise, retina dekolmanı 72 saat içinde çözmelidir.
- Daha önce 14,15 açıklandığı gibi önce ve enjeksiyondan sonra retina fonksiyonlarını değerlendirmek için standart ERG tekniklerini kullanın.
7. 3D İmar ve Bleb Hacim Ölçümü
NOT: yüksek kontrast görüş çerçevesinde tüm dekolmanı kapsayan birlikte Ekim taramaları kullanım için optimum olan. ImageJ / Fiji 17,18 ve Imaris kullanıldı, ancak diğer yazılım kullanılabilir.
- ilgi b-tarama İhracat, ImageJ / Fiji ve kırpma (Görüntü> Kırpma) Ekim sc bölümü ithalatBir dikdörtgen seçim aracı kullanılarak modellenmiştir edilecek.
- Kontrast ayarlayın (Görüntü>> Parlaklık / Kontrast ayarlama) ve bir çizgi ile iki bölüm bağlayarak herhangi bir eksik sınırları betimlemek.
- fotoreseptör tabakası RPE yayılan çizgi aracı (tutma vardiya) ile düz bir çizgi çizin. Tedbir (Ölçü> Analiz) çizgisinin uzunluğu adımı 7.8 için maksimum dekolmanı boyutu elde etmek için.
- İthalat "Gray RGB" eklentisi ve MATLAB Compiler Runtime kullanılarak (Malzeme Tablo bakınız) 3D-rekonstrüksiyon yazılımı çerçeveleri kırpılmış.
- Ekim tarama (x, y, z) kalibrasyon parametrelerini kullanarak (Görüntü Özellikleri altında) voksel boyutunu ayarlayın.
- dördüncü kanal oluşturmak için, her kanala eşit ağırlık ile (Görüntü Özellikleri altında) "RGB Gray" eklentisi, yürütün. Orijinal Kırmızı-Yeşil-Mavi kanalları silin.
- kontrast değişikliği kullanarak gri kanal ters çevirin. Mağaza Görüntü.
- "Bir Ekle'yi tıklayınew yüzeyi "3D-Görünüm sekmesinde düğme ve yüzey yaratma güdümlü 4 adım süreci başlar.
- Yüzey seviye detay (adım 4 1) ayarlayın.
NOT: Bizim tecrübelerimize göre 12,0 8.0 en etkili menzili oldu. - (Arka plan seçimi altında) maksimum küre boyutunu 7.1.2 ölçülen maksimum dekolmanı boyutu biraz daha az olarak ayarlayın. gri kanal inversiyon (adım 4 2) yüzey oluşturmak ve geri.
- retinanın dış olumsuz alanlarda ve dekolmanı yüzey teması (4 adım 3) gelmiyor bu yüzden maksimum değere eşik ayarlayın.
- Voksellerden sayısına filtre tipini ayarlayın ve büyüklüğüne göre dekolmanı sitede negatif boşluk izole. yüzeyi (adım 4 4) bitirin.
NOT: sıyrılma yüzeyinin hacmi istatistikleri sekmesinde hacim altında bulunur.
- Yüzey seviye detay (adım 4 1) ayarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
yaklaşım transkleral subretinal enjeksiyonları 0.3 ul (n = 18), 0.5 ul (n = 8) ve% 0.01 fluoresein 1.0 ul (n = 5) enjekte 16 vahşi tip farelerden 31 sağlıklı gözler üzerinde gerçekleştirilmiştir posterior. Bir göz nedeniyle yapısal ve fonksiyonel analiz engelleyen önceden varolan korneal opasite enjeksiyon çıkarılmıştır. Her enjekte göz bu raporda yer almaktadır. Hiçbir istenmeyen retina dekolmanı, vitreus içine retinada veya sızıntı delikler tespit edildi ne de gözlenen herhangi gözlerde lens nickleme, inflamatuar yanıtlar, üveit veya ameliyat sonrası enfeksiyonların herhangi bir kanıt oldu.
Retina yapısı ön enjeksiyon, 10 dakika sonrası enjeksiyon ve Ekim görüntüleme kullanarak 4 hafta enjeksiyon sonrası (Şekil 2 ve 3) değerlendirildi. A 9-noktalı ızgara, maksimal dekolmanı merkezini örten merkez noktası ile, 10-min yerleştirildiYüz tarama (Şekil 2B) tr enjeksiyon sonrası. vasküler yerler, ön enjeksiyon ve 4 haftalık enjeksiyon sonrası taramaları kullanarak 10 dakikalık enjeksiyon sonrası tarama ile kayıt olmak döndürüldü. Bu öncesi ve sonrası enjeksiyon retina tarama (Şekil 2A, C), tam olarak aynı yerle belirlenmesini sağladı.
Subretinal enjeksiyonları uzakta iğne subretinal alan (Şekil 2B ok) girilen enjeksiyon yerinden merkezli olduğu kabarcık oluşmasına neden ve sığ dekolmanı Şekil 3B uzun bir alana uzanan ya da (kubbeli ile ya düz (Şekil 3A) vardı - bir kısıtlı bir alanda derin dekolmanı (Tablo 1) ile D). Bir kubbeli bleb RPE dik 50 mikron aştı herhangi dekolmanı olarak tanımlandı. Hiçbir rozet, dış retina katmanlarının germe tarafından üretilen bir dalgalı desen, gözlendi. EskiEnjeksiyon birikimi çadır yüzü Ekim (Şekil 2B, kesikli çizgi), flöresein fundus görüntüleme (Şekil 2E) ve Ekim B-tarar (Şekil 3) tr görüntülendi. Fare retinanın yaklaşık% 10'unu kapsayacak Ekim taramaları, görüş alanı ötesine kabarcıkların çoğunluğu (31 29). Büyük enjeksiyon hacimleri (Tablo 1) ile kubbeli kabarcıkların sıklığı dışındaki bleb şekli üzerinde hiçbir kontrolü yoktu. 2 hafta tarafından çözüldü tüm kabarcıklar (veriler gösterilmemiştir).
Toplam retina kalınlığı (sinir lifi tabakası Bruch membranı) kantitatif olarak ızgara mevcut her noktada en 0.3 ul (Şekil 3A), 0.5 ul (Şekil 3B) ve 1.0 ul (Şekil 3C) enjeksiyon hacimleri için 4 hafta enjeksiyondan sonra değerlendirildi B tarama karşılık gelen (Tablo 1). yüzde fark (% Δ w)yapısal ve işlevsel metrikler hem de enjeksiyon öncesi ölçümlerine fark göreceli olarak hesaplanan. Tüm ızgara noktaları tüm görüntüleme oturumları sırasında elde edildi değil. Örneğin, 3 gözü 4 gözü 3 ya da 4 puanda kaldı, 1 ya da 2 puanda kaldı ve 23 gözü her taramalarında 5 ila 9 puanda kaldı. Total retina kalınlığı öncesi ve sonrası enjeksiyon için önemli ölçüde farklı değildi çünkü retina incelme yönünde genel bir eğilim hem (Tablo 2) için gözlenmiş olmasına rağmen Kubbeli ve düz blebleri ve enjeksiyon hacimleri, yıkılmıştır.
Daha fazla analiz ±% 6.5 küçük ancak istatistiksel olarak anlamlı incelme gösterdi 1.9 genel (pre = 196 ± 1, n = 31; sonrası = 183 ± 4, n = 31, T 60 = 3.4, p = 0.001) (Tablo 3). Retina incelme oluştuğu belirlemek için, her 9 ızgara noktaları için kalınlık ölçümleri içeren 10 gözlerin bir alt kümesi analiz edildi. Tüm gözler için analize benzer,gözlerin alt kümesi de (3.5 ±% 10.3 öncesi = 199 ± 1, n = 10; sonrası = 179 ± 8, n = 10, T 18 = 2.4, p = 0.02) küçük ama anlamlı genel retina incelme gösterdi. Hiçbir retina incelme enjeksiyon yerinde uzak sitelerde gözlenmiştir (4.0 ± 7.2%, ön = 199 ± 2, n = 10; sonrası = ± 8, n = 10 185 = 1.7 T 18, p = 11). , Enjeksiyon yeri, retinal incelme (post = 179 ± 10, n = 10, T 18 = 2.1, p = 0.04 öncesi = 201 ± 2, n = 10,% 11,2 5.0 ±) maksimal retina dekolmanı yerinde gözlendi zarar vermeden (13.8 ± 6.0, ön 201 1, n = 4 ± = = 173 10, n = 4, T 6 = 2.8, p = 0.03 mesaj ±), retina hapsetme ile enjeksiyon siteleri retinanın küçük bir bölge olduğunda yara izi ile ve enjeksiyon siteleri (% 26.5; iğne çekilmesi üzerine sklera çekilir (post = 171 ± 3, n = 3, T 4 = 8.9, p = 0.001% 14.1 1.0, ön = 199 ± 1, n = 3 ±) 1.6 ± öncesi = 200 ± 3, n = 3; POST = 147 ± 10, n = 3 olduğunda, T4 = 5.1, p = 0.007). Toplamda, inkarserasyonu dış retina katmanlarının (Şekil 3E) yarısı kadar kaybı ile koroid skar oluşumu ile sonuçlandı 3 tanesi 14 31 üzerinden enjeksiyonları, meydana geldi. Her durumda, bununla birlikte, bu son derece lokalize etkilerdi.
Tam alan Elektroretinografi enjeksiyondan önce gerçekleştirilir ve 4 hafta işlevsel değişiklikler (Tablo 1) değerlendirmek için her bir göz için ayrı ayrı değerlendirilmiş göre değişiklikler ile enjeksiyondan sonra tekrar edilmiştir. Sadece koyu adapte ve çubuk aracılı yanıtları kaydedildi. Yoğunluk tepki fonksiyonları hem fotoreseptör (a -waves) ve orta retina (b -waves) için Vmax türetmek için Michaelis-Menten denklemleri takıldı. Yanıtlar kabarcık şeklinde etkilenmemiştir ve bu nedenle (Tablo 4) yıkılmıştır. Vmax küçük ama istatistiksel olarak anlamlı bir azalma üzerinde vardıBir -waves (F (1, 28) = 7.1, p = 0.013), ancak B -waves (F (1, 28) = 4.0, p = 0.055), enjeksiyondan sonra (Tablo 4). Öncesi ve 0.3 ul, 0.5 ul ve 1.0 ul enjeksiyon sonrası için temsili dalga (Şekil 4) gösterilmektedir. B -waves (F (2, 28) = 6.2, p = 0.006 ve F (2, 28) = 8.8, p = 0.001), - her ikisi de, bir enjeksiyon hacminin bir etkisi yoktu.
Son olarak, 3D modelleme hem kubbeli ve düz kabarcıkların yapısını görselleştirmek için kullanıldı. Kubbeli bleb (Şekil 5A) bir örneği, tarama alanının içinde bulunan kubbeli sıvı dolu ayrılmasını göstermektedir. Düz bleb (Şekil 5B, C) örnekler tarama bölgenin ötesine sığ sıvı dolu alanları göstermektedir. Retina hapsetme oluştuğunda, yeniden küçük bir delik (Şekil 5C) görülür. Yapay sınırlar bir tarama t kenarında gösteriliro rekonstrüksiyon (Şekil 5C) izin verir. Bu örnek enjeksiyonları kabarcık miktarlarının hesaplanması, 0.15 ul ve 0.01 ul en az başarılı ise, kubbe ve düz kabarcıkların neden 0.3 ul enjeksiyon için subretinal alan hedeflenen olduğunu göstermiştir. muhtemelen enjekte hesaplanan hacim insan subretinal enjeksiyonları meydana itibariyle vadesi işlem sırasında görüntüleme ve yeniden yapılanma, sıvının emilimi çözünürlüğüne gerçek hacim hafife ve düz ya da kubbeli kabarcıkların özellikle, tüm dekolmanı Ekim taramaları temsil eğer.
Tablo Eye Subretinal Enjeksiyonlar 1. Fonksiyonel ve Yapısal Etkileri. Bireysel gözlerin Metrik ve subretinal enjeksiyonları kendi sonuçları. Retina ışığa tepkiler (orta retina B -waves ve -Wave fotoseptörler) ve retina kalınlık ölçümleri (sinir lifi tabakası Bruch membranı) verilir. Dipnotlar:
Bir BT = Blep Tipi Daire (F) veya Kubbeli (D)
b #gp = ızgara noktalarının sayısı ölçülen
* Enjeksiyon hacminin yeniden inşası için kullanılan Gözler.
** Skar de ölçümü için kullanılabilir sadece 1 ızgara noktası.
skar oluşumu ile # Gözler.
| Zaman | kubbeli Bleb | düz Bleb | 0.3 ul | 0.5 ul | 1.0 ul | |
| (um) | (um) | (um) | (um) | (um) | ||
| Ön püskürtme 194 ± 2 | 197 ± 3 | 195 ± 1 | 197 ± 1 | 197 ± 3 | ||
| Enjeksiyon sonrası | 176 ± 8 | 188 ± 3 | 180 ± 6 | 184 ± 5 | 192 ± 5 |
Toplam Retina Kalınlığına Subretinal Enjeksiyonların Tablo 2. etkisi. bleb şekil ve retina kalınlığı üzerinde enjeksiyon hacmi analizi.
| Kalınlığı (um) | |||||
| yer | n (gözler) | ön | 4 hafta | Δ | % Δ |
| Retina (bütün uyumlu puan) | 31 | 196 ± 1 | 183 ± 4 | -13 ± 4 | -6.5 ± 1.9 |
| 9 ızgara noktaları ile retina * | 10 | 199 ± 1 | 179 ± 8 | -20 ± 7 | -10,3 ± 3.5 |
| Enjeksiyon distalinde * | 10 | 199 ± 2 | 185 ± 8 | -14 ± 7 | -7.2 ± 4.0 |
| Maksimum Dekolmanı * | 10 | 201 ± 2 | 179 ± 10 | -22 ± 9 | -11,2 ± 5,0 |
| Hasar olmadan enjeksiyon * | 4 | 201 ± 1 | 173 ± 10 | -28 ± 12 | -13,8 ± 6,0 |
| Enjeksiyon de İnkarserasyon * | 3 | 199 ± 1 | 171 ± 3 | -28 ± 2 | -14,1 ± 1,0 |
| Enjeksiyon de Scar * | 3 | 201 ± 3 | 147 ± 10 | -53 ± 10 | -26,5 ± 1.6 |
Tablo Retina Yapısına Hasar 3. Etkisi. Site bağımlı retina incelme analizi. Dipnotlar: * 9 ızgara noktaları veri ile 10 farelerin analizi.
| Vmax (mV) | Kubbeli (n = 12) | Daire (n = 6) | 0.3 ul (n = 18) | 0.5 ul (n = 8) | 1.0 ul (n = 5) |
| bir -waves | |||||
| Ön püskürtme | -338 ± 13 | -351 ± 13 | -347 ± 9 | -334 ± 16 | -425 ± 15 |
| Enjeksiyon sonrası | -311 ± 8 | -321 ± 16 | -318 ± 11 | -318 ± 18 | -355 ± 29 |
| b -waves | |||||
| Ön püskürtme | 604 ± 30 | 578 ± 11 | 595 ± 20 | 542 ± 26 | 708 ± 21 |
| Enjeksiyon sonrası | 537 ± 35 | 551 ± 15 | 542 ± 24 | 538 ± 31 | 612 ± 45 |
b -waves - içinde sayfa = "1"> T Skotopik üzerinde Subretinal Enjeksiyonu mümkün 4. Etkisi Rod aracılı. Bleb şekil ve ışık retina tepkiler üzerine enjeksiyon hacmi (orta retina b -waves fotoreseptör bir -waves) analizi.
Subretinal Enjeksiyon Şekil 1. şematik gösterimi. sokete bir fare gözün yukarıdan aşağıya şematik bir yaklaşım gösterir Geleneksel subretinal enjeksiyonları, bir transkorneal kullanarak pars plana yakın veya transkleral (ok b) enjeksiyon yerinde (bir ok). Bu yöntem, arka kutup maruz burundan göz çevirerek elde edilen arka kutup (ok c) yakın bir transkleral yaklaşım kullanır.les / ftp_upload / 54808 / 54808fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ekim Görüntüleri Şekil 2. Kayıt Kalınlığı Analizi Retina Siteleri tanımlanması izin verir. AC, özgün yönlendirmede fare 1OS yüzü Ekim görüntüsünün tr. Kaynaştırılmış kayıt ızgara ile retina ön enjeksiyon A) Görüntü. Retina 10 dakika sonrası enjeksiyon B) Görüntü. A 9-noktalı ızgara maksimal retina dekolmanı yerinde merkez noktası ile yerleştirildi. Enjeksiyon yeri görünür (ok). Retina 4 hafta erimiş kayıt ızgara ile enjeksiyon sonrası C) Görüntü. DE, fare 9OS görüntüleri. Subretinal dekolmanı uzatmak gösteren enjeksiyon sonrası retina 4 hafta yüz Ekim görüntü En D). E)Fundus (yeşil) ve retina 10 dakika sonrası enjeksiyon yüzü Ekim görüntülerinin tr Yerleşimi. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Subretinal Enjeksiyonlar Minimal Retina İnceltme ile Geçici retina dekolmanı Neden. maksimal retina dekolmanı yerinde Temsilcisi Ekim B-tarar ön enjeksiyon, 10 dakika sonrası enjeksiyon ve 4 hafta enjeksiyon sonrası için gösterilmiştir. A) oluşumu ve 0.3 ul enjeksiyon düz bir kabarcığın çözünürlük. B) oluşumu ve 0.5 ul enjeksiyon kubbeli bleb çözünürlük. 1.0 ul enjeksiyon C) Oluşumu ve kubbeli bleb çözünürlük. Şiddetli cho D) Örnekroidal skar ve enjeksiyon yerinde retina incelme. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Retinalar Blep Çözünürlük sonra normal Fonksiyonu saklayın. Scotopic çubuk aracılı yanıtlar için dalga formları ön enjeksiyon (siyah çizgi) ve A için 4 hafta enjeksiyon sonrası (kırmızı kesikli çizgi)) 0.3 ul, B) 0.5 ul ve C) arasında değişen 9 aydınlatma şiddetlerinde 1.0 ul enjeksiyonları için gösterilir 4.37 x 10 -6 0.51 cd / m 2. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. kabarcıkların 3D rekonstrüksiyon. A) Yazılım oluşturulan temsili A 3D rekonstrüksiyon) kubbeli ve 0.3 ul enjeksiyonları B, C) düz kabarcıklar. Azarlama yeniden yazılımının bir eserdir. Yapay sınırlar yeniden sağlamak için C yerleştirilmiştir. Ölçek çubuğu = 150 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal enjeksiyonları viral vektörlerin teslimat için tercih edilen yöntem ve fotoreseptör ve temel araştırma ve klinik tedavisinde hem de RPE işlemek için hücre kökenli tedavisi kaynaklanıyor. hastalarda, subretinal enjeksiyonları genellikle doğrudan görselleştirme ile iğne ile, pars plana bir ön sklerotomili retinanın bir arka çekirdek vitrektomi ve penetrasyon yapılır. Göz Psödofakik zaten olmadıkça katarakt oluşumu erken gerçekleşmesi için en vitrektomi prosedürleri gibi, yaygındır. Farelerde, retina altı enjeksiyonları geleneksel camsı sıkışması ve tam olarak yol açabilir sklerotomi retinaya ön, sıklıkla, gözün arka boşluğun bir kısmını kaplıyor olabilir lens, her ikisi de çentme ile ilgili bir yöntem ve Transretinal penetrasyon ile yapılır retina dekolmanı. Farelerde posterior-yaklaşım tekniği bu istenmeyen sonuçları azaltır ve ef yorumlama yeteneğini geliştirir kullanmaamaçlanan manipülasyon bozukluğunun.
Burada bildirilen subretinal enjeksiyon tekniği Faydaları minimal yapısal ya da işlevsel etkileri ve düşük teminat hasar dahil (örneğin, objektif nickleme, vitreus sızıntı veya iltihaplanma itibaren bulutlanma) Deneysel sonuçlar ve hızlı iyileşme süreleri daha kolay değerlendirmesini sağlar. Bu teknik arka kutup ulaşmak için gözün daha manipülasyonu gerektirir ama yaklaşık 10 içinde tamamlanabilir - hiçbir gözler analizinden reddedildi gibi yüksek bir başarı oranı ile göz başına 15 dakika. enjeksiyonlar çoğunda, normal retinal yapısı ve fonksiyonu 4 hafta içinde gözlenmiştir. Yapısı ve fonksiyonu kurtarma için 8 hafta veya bir iyileşme süresi 6,7 rapor yok - Buna karşılık, daha önceki çalışmalar 5 bildirmektedir. Sonuç olarak, deneyler daha az hayvan ile daha kısa sürede tamamlanabilir.
Bu subretinal enjeksiyon tekniği komplikasyonlar skar oluşumu ve kaybı dahilönemli yapısal ve fonksiyonel açıkları sadece üç olgu ile enjeksiyonlar yaklaşık% 10'unda fotoreseptör. Retina sadece büyük yara öncesi enjeksiyon ile karşılaştırıldığında fotoreseptör yanıt% 80 ve iç retina yanıt% 77 fonksiyonu azalan ışığa normal tepkiler korudu. Bu, mevcut çalışmada değerlendirilmemiş olmasına rağmen Retina inkarserasyonu, her enjeksiyon için yeni bir iğne kullanımı ile azaltılabilir. Alternatif olarak, onlar yüzünden negatif basınç meydana gelebilir ve bu nedenle kaçınılmaz. Gözün büyük boyutlu, inkarserasyonu toplam retinaya daha az hasar temsil çünkü inkarserasyonu Bununla birlikte, insan subretinal enjeksiyonları çok yaygındır. Bir terapötik madde, enjekte edilmiş Sonuç olarak, eğer enjekte gözlerin% 90 bir müdahale etkilerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir olacaktır.
öncesi ve subretinal enjeksiyondan sonra retina kalınlık ölçümleri değişkenlik t tekrarlanabilirlik yansıtırO Ekim fareler üzerinde enstrüman, resim arasında retina yerleri hizalama hassasiyeti ve düşük doz floresein boya ile serum fizyolojik enjeksiyonu retina değişir. Bu ölçümler, bir terapötik madde, bu olup olmadığını retina altı enjeksiyonları sonucu istatistiksel olarak geçerli değişiklikleri tespit etmek için gerekli olan gözler ve retina yerle sayısı için güç hesaplamalarında araştırmacılar yardımcı olma görevi görebilir. 10 olguda olduğu için 9 ızgara noktaları tüm retina taramaları vardı, enjeksiyon yerinde dışında retina kalınlığı değişkenliği (5 - Göz başına 8 puan) bile toksik yokluğunda, 4.0% ± 7.2% olarak veya terapötik ajan veya kalıtsal retinal distrofi. Böyle bir değişkenlik subretinal tedaviler için fare modelleri kullanarak klinik sonuçların karşılaştırılması için ölçütlerin belirlenmesi için bir husustur ve şiddetle uygun kontrollerin aracın subretinal enjeksiyon ziyade uninjected göz 3 içeren önerir. Son olarak, biz Investig teşvikators tüm taramalarda enjeksiyon yerinde kapsamını iyileştirmek için enjeksiyondan önce birden retina bölgelerinde çok sayıda Ekim taramaları yapmak.
Deney maddeleri retinanın daha büyük bir genişlik teslim edildiğinde Terapötik etkinlik olasılığı elde edilecektir. Bu gibi durumlarda, daha büyük hacimler idealdir, ancak 0.3 ul enjeksiyonları, çoğu zaman geniş bir retina yüzey alanına sahiptir, düz kabarcıkları meydana gerekli olmayabilir. Daha büyük enjeksiyon hacimleri daha kubbeli kabarcıklar üretilen rağmen kabarcık şekli, kontrol değildi. 1 ul kadar ancak kubbeli kabarcıklar böylece retina dokunur genişletilebilir ve özellikle düşük camsı hacim genç farelerde, lensin arka kapsül yapışır hale mümkündür negatif sonuçları olmadan enjekte edilebilir. şırınga teslim hacmine rağmen, subretinal alan hedeflenen gerçek hacim daha az olduğu hesaplanmıştır. Bu durum, özellikle kubbeli ya da f Ekim taramaları elde edilmez hacmi, yansıtabilirlat blebleri veya Ekim tarama ve sonraki yeniden yapılanma bir dışlayıcı, ancak iğnenin geri çekilmesi üzerine backflow gelen hacim kaybını yansıtabilir.
Özetle, subretinal enjeksiyon için posterior yaklaşım kullanarak hedefleme ve dışlanma oranı düşük bir yüksek başarı oranı ile sonuçlanan, daha az komplikasyon ve gelişmiş kurtarma vardır. Bu teknik, kemirgen retina viral farmakolojik ve hücresel manipülasyonlar için idealdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton Model 62 RN SYR | Hamilton | 87942 | Syringe x 1 |
| Hamilton Needle 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (304 stainless steel) | Hamilton | 7803-05 | Needles x 6 |
| Vannas Curved Scissors | Ted Pella, INC. | 1347 | 5 mm Blade |
| 22.5 Degree Microsurgery Knife | Wilson Ophthalmic Corp. | 91204 | |
| Ketaject | Phoenix | NDC 57319-609-02 | Ketamine |
| Anased | Lloyd Laboratories | NDC 61311-482-10 | Xylazine |
| Fluorescein 10% AK-Fluor | Akorn | NDC 17478-253-10 | 100 mg/ml |
| 0.9% Saline USP | Hospira | NDC 0409-4888-50 | 0.9% NaCl |
| Antibiotic Ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | Ophthalmic |
| Water Circulating Pump | Gaymar | TP-500 T/Pump | P/N 07999-000 |
| sd-OCT | Bioptigen | R-Series | Commercial |
| Fundus Camera | Phoenix Research Laboratories | MICRON III | |
| Tweezers Type 3 | Ted Pella, INC. | 5385-3SU | |
| 2.5% Phenylephrine | Paragon BioTeck | NDC 42702-102-15 | Ophthalmic |
| IMARIS8 | Bitplane | Version 8.1.2 | |
| ImageJ | NIH | V1.8.0_77 | |
| Hypromellose 2.5% | Goniovisc | AX0401 | Methylcellulose |
| Eye Drops (Rinse) | Bausch & Lomb | Saline Solution | |
| Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | Microscope |
| Light source | Fostec | P/N 20520 | Light source |
References
- Garoon, R. B., Stout, J. T. Update on ocular gene therapy and advances in treatment of inherited retinal diseases and exudative macular degeneration. Curr Opin Ophthalmol. 27 (3), 268-273 (2016).
- Pierce, E. A., Bennett, J. The Status of RPE65 Gene Therapy Trials: Safety and Efficacy. Cold Spring Harb Perspect Med. 5 (9), a017285 (2015).
- Tolmachova, T., et al. Functional expression of Rab escort protein 1 following AAV2-mediated gene delivery in the retina of choroideremia mice and human cells ex vivo. J Mol Med (Berl). 91 (7), 825-837 (2013).
- Nork, T. M., et al. Functional and anatomic consequences of subretinal dosing in the cynomolgus macaque. Arch Ophthalmol. 130 (1), 65-75 (2012).
- Ye, G. J., et al. Safety and Biodistribution Evaluation in Cynomolgus Macaques of rAAV2tYF-PR1.7-hCNGB3, a Recombinant AAV Vector for Treatment of Achromatopsia. Hum Gene Ther Clin Dev. , (2016).
- Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLoS One. 10 (8), e0136523 (2015).
- Engelhardt, M., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of retinal pigment epithelium cells. Vis Neurosci. 29 (2), 83-93 (2012).
- Lambert, N. G., et al. Subretinal AAV2.COMP-Ang1 suppresses choroidal neovascularization and vascular endothelial growth factor in a murine model of age-related macular degeneration. Exp Eye Res. 145, 248-257 (2016).
- Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garcia Garrido, M., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized technique for subretinal injections in mice. Methods Mol Biol. 935, 343-349 (2013).
- Nusinowitz, S., et al. Cortical visual function in the rd12 mouse model of Leber Congenital Amarousis (LCA) after gene replacement therapy to restore retinal function. Vision Res. 46 (22), 3926-3934 (2006).
- Huang, R., et al. Functional and morphological analysis of the subretinal injection of human retinal progenitor cells under Cyclosporin A treatment. Mol Vis. 20, 1271-1280 (2014).
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Ridder, W. 3rd, Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Experimental Eye Research. 75 (3), 365-370 (2002).
- Ridder, W. H. 3rd, Nusinowitz, S. The visual evoked potential in the mouse--origins and response characteristics. Vision Res. 46 (6-7), 902-913 (2006).
- Matynia, A., et al. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are the primary but not exclusive circuit for light aversion. Experimental Eye Research. 105, 60-69 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
