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Genetics

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54810
Automatic Translation
1, 1,2
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

Summary

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene.

Introduction

Schermi genetici a termine sono stati ampiamente utilizzati per generare mutanti genetici che perturbano vari processi biologici in organismi modello come il Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Le analisi di questi mutanti portano alla scoperta dei geni funzionalmente importanti e loro vie di segnalazione 1,2. Tradizionalmente, mutagenesi in C. elegans si ottiene utilizzando prodotti chimici mutageni, radiazioni, o trasposoni 2. Sostanze chimiche come metanosolfonato etile (EMS) e N -ethyl- N -nitrosourea (ITA) sono tossici per l'uomo; raggi gamma o raggi ultravioletti (UV) mutagenesi richiede attrezzature speciali; e ceppi trasposoni-attivi, come ad esempio ceppi mutatori 3, possono causare mutazioni inutili durante la manutenzione. Abbiamo sviluppato un approccio semplice per indurre mutazioni ereditarie con un fotosensibilizzante geneticamente codificato 4.

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) possono danneggiare il DNA 5.Il generatore mini ossigeno singoletto (miniSOG) è una proteina fluorescente verde di 106 aminoacidi che è stato progettato dalla LOV (luce, ossigeno, e tensione) del dominio di Arabidopsis phototropin 2 6. Dopo l'esposizione alla luce blu (~ 450 nm), miniSOG genera ROS compreso l'ossigeno singoletto con fl avin mononucleotide come cofattore 6-8, che è presente in tutte le cellule. Abbiamo costruito una proteina di fusione His-mSOG etichettando miniSOG al C-terminale dell'istone-72, un C. elegans variante dell'istone 3. Abbiamo generato una singola copia transgene 9 per esprimere la sua-mSOG nella linea germinale di C. elegans. In condizioni di coltura normali nel buio, i vermi transgenici His-mSOG hanno dimensioni normali covata e durata 4. Al momento l'esposizione alla luce blu del LED, i vermi His-mSOG producono mutazioni ereditarie tra loro progenie 4. Lo spettro di mutazioni indotte include cambiamenti nucleotide, come ad esempio G: C a T: A e G: C a C: G, e piccoli chromosoMi eliminazioni 4. Questa procedura mutagenesi è semplice da eseguire, e richiede l'installazione minima di sicurezza del laboratorio. Qui, descriviamo l'installazione di illuminazione a LED e le procedure per la mutagenesi optogenetic.

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Protocol

1. Costruzione del illuminatore LED

NOTA: L'attrezzatura necessaria a LED è riassunto nella lista dei materiali. L'intera impostazione del LED è piccolo e può essere posizionato in qualsiasi punto in laboratorio, anche se si consiglia di riporla in una stanza buia per controllare la luce l'esposizione di vermi 4.

  1. Collegare il LED ad un controllore con cavi (Figura 1A, D).
  2. Collegare il controller per una funzione generatore / amplificatore digitale con un cavo BNC (Figura 1A, C, D).
  3. Fissare i LED luminosi 10 cm sopra il palco con un supporto personalizzato (Figura 1A).
    NOTA: Abbiamo fatto il supporto con parti metalliche.
  4. Coprire l'installazione di illuminazione a LED in parte, ma evitare accumulo di calore (Figura 1B), il che rende i vermi malati.
    NOTA: Usiamo una copertina rigida in plastica su misura con la parte superiore aperta e in basso (Figura 1A). Il rivestimento non è necessario per la mutagenesi in sé, ma è usato to limitare l'esposizione non necessaria della luce blu per l'ambiente circostante. Si consiglia di non coprire il setup LED completamente (Figura 1B) per evitare il surriscaldamento dei vermi.
  5. Indossare occhiali di protezione laser.
    NOTA: indossare gli occhiali di protezione laser, perché la luce è molto luminoso. Occhiali da sole può funzionare così.
  6. Attivare la leva del regolatore LED di 'Int.' per illuminazione continua (Figura 1D) e impostarlo al 65% della potenza massima (Figura 1C).
  7. Utilizzare un fotometro per misurare l'intensità della luce blu sul palco dove i vermi sono posizionati utilizzando il protocollo del produttore. La configurazione dà 2,0 mW / mm 2 sotto illuminazione continua.

2. Trattamento Light Blue

NOTA: utilizzare il ceppo CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 Il ceppo è disponibile. presso il Caenorhabditis Genetics center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Mantenere il ceppo His-mSOG al buio su terreno di coltura nematode standard (NGM) piatti con E. coli OP50 seguendo un protocollo standard di 10,11.
    NOTA: In luce ambiente, juSi164 ceppi contenenti, non visualizzano un tasso di mutazione di sopra di un tasso di spontanea 4. passaggio ceppo di routine utilizzando un ambito dissezione con una lampada alogena in genere non causare mutazioni pure. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare l'esposizione inutile alla luce, ad esempio, mantenendo i ceppi in un incubatore scuro all'interno di serie, o coprendo i ceppi con un foglio. Si consiglia di congelare aliquote del ceppo dopo averlo ricevuto nel caso in cui le mutazioni inutili si accumulano nel tempo.
  2. Scegliere gravido giovane adulto (circa post-L4 12 h) gli animali con un verme scegliere 11.
    NOTA: gli animali più giovani mostrare effetto mutageno meno 4, mentre gli animali più anziani possono avere dimensioni covata inferiore.
  3. Tagliare un filtro pAPER per adattarsi un piatto 60 millimetri con 25 mm x 25 mm Foro quadrato e posto su una piastra di testa di serie (Figura 1E).
    NOTA: Un pugno quadrato può essere utilizzato, ma le dimensioni del punzone non deve essere preciso.
  4. Goccia 100 ml di 100 mM CuCl 2 sulla carta da filtro in modo uniforme per restringere vermi all'interno del foro quadrato sulla piastra.
  5. Scegliere il numero desiderato di gravide giovani adulti ermafroditi (vedi punto 3 per un esempio) e trasferimento al centro della piastra CuCl 2.
  6. Indossare occhiali di protezione laser.
  7. Accendere il LED e il generatore di funzioni.
  8. Attivare la leva del controller LED a 'Ext.' controllarlo dal generatore di funzione (Figura 1D).
  9. Impostare il controller al 65% della potenza massima e il generatore di funzioni come onda sinusoidale, 4 Hz (Figura 1C).
  10. Posizionare la piastra CuCl 2 dal passo 2.5 senza coperchio sulla scena sotto il LED (Figura 1A </ Strong>).
  11. Illuminare gli animali con luce blu per 30 minuti.
  12. Trasferire i vermi in cerca sani per un piatto testa di serie come P 0.
    NOTA: Il numero desiderato di P 0 dipende dal tipo di schermata. Vedere il punto 3 per un esempio. I P 0 vermi possono sembrare essere scoordinato immediatamente dopo il trattamento della luce e si riprenderà nel corso del tempo.
  13. Mantenere vermi coperti con un foglio in un incubatore o al buio; e seguire la procedura standard per iniziare lo screening fenotipi desiderati tra loro progenie 2,10.

3. Esempio di uno screening genetico di andata

NOTA:. Questo è un esempio della schermata clonale con 120 genomi aploidi per verificare se il LED e la tensione funzionano figura 2 mostra uno schema del procedimento.

  1. [Day1] Dopo il trattamento la luce blu, raccogliere cinque worm cerca sani su un piatto NGM con OP50 come P 0, tenerli in un 20 ° C incubatore, e far loro deporre le uova per 1D (targa '1 ° giorno').
  2. [Day2] Trasferimento P 0 su una nuova piastra di testa di serie (piastra 'Day2').
  3. [Giorno 3] Raccogliere e uccidere P 0 sulla targhetta 'Day2' bruciandoli.
  4. [Day4] Raccogliere 30 gravido giovane adulto F 1 dal piatto del '1 ° giorno' e trasferirli su singoli piatti (30 F 1 Piano per '1 ° giorno').
  5. [5 ° giorno] Ripetere il punto 3.4 per la targa 'Day2' (30 F 1 piastre per 'Day2').
  6. [Day7-9] Controllare le morfologie anormali e / o comportamenti di F 2 vermi rispetto al ceppo WT (Figura 3a) allo stereomicroscopio standard quando diventano adulti.
    NOTA: A ereditarie mutazione mostra circa un quarto di vermi con lo stesso fenotipo tra F 2 quando è recessiva con elevata penetranza. Tuttavia, alcuni mutanti possono crescere lentamente e / o mostrare penetranza parziale. Pertanto, è possibile che meno di un quarto dei mutanti può essere trovato unpiatto.
  7. Raccogliere i vermi con fenotipi visibili individualmente e controllare l'ereditabilità del fenotipo nella prossima generazione.

4. Esempio di integrazione extrachromosomal Transgene

  1. Iniettare il DNA di interesse in CZ20310 juSi164 [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparare i vermi transgenici con un basso tasso di trasmissione (10-30%), a seguito di un protocollo di 12,13 iniezione standard.
    NOTA: In alternativa, gli array extracromosomici stabiliti possono essere attraversate in ceppi juSi164. Per evitare genotipizzazione per juSi164, eterozigoti juSi164 possono essere utilizzati come P 0 malgrado l'efficienza potrebbe essere diminuita. Il metodo di genotipizzazione per juSi164 è descritta nel paragrafo 5.
  2. [Day1] Trattare ~ 20 animali transgenici come P 0 con luce blu come descritto al punto 2.
    NOTA: Più P 0 vermi sono necessarie a seconda del TR tasso asmissione. Transgeni possono essere identificati da fenotipi o pennarello co-iniezione 12,13.
  3. Raccogliere 10 sano P cercando 0 su piatti individuali, tenerli in un incubatore a 20 °, e far loro deporre le uova per un paio di giorni (P 0 piastre)
  4. [Day4] individuare 20 transgenici F 1 vermi da ogni piatto P 0 su piatti individuali e far loro deporre le uova. (20 F 1 x 10 p 0 piastre = 200 f 1 piastre in totale.)
  5. [Day7] Trova F 1 piatti con> 75% F 2 con transgeni.
  6. Scegliere cinque animali transgenici dalla velocità di trasmissione> 75% F 1 piastre (F 2 piastre).
  7. [Giorno10] Tenere F 2 piastre con velocità di trasmissione di 100% come potenziali linee integrate.
  8. Outcross le linee potenziali integrati utilizzando una procedura standard 10 per controllare la segregazione mendeliana e di togliere eventuali mutazioni di fondo.
Le "> 5. genotipizzazione

  1. Lyse 20 outcrossed F 2 vermi in tampone di lisi utilizzando un protocollo standard di 14.
  2. Eseguire PCR utilizzando i primer per l'inserimento MosSCI 9, juSi164, (Tabella 1) con una temperatura di ricottura di 58 ° C seguendo un protocollo standard 14.
    NOTA: Non è necessario genotipo unc-119 (ED3) perché unc-119 (ED3) può essere rilevato da un comportamento non coordinato dopo aver rimosso il transgene salvataggio (juSi164) nei seguenti passi 5.4 e 5.5.
  3. Eseguire agarosio elettroforesi su gel 15 ed esaminare le dimensioni delle bande (Tabella 1) per trovare il WT per juSi164.
  4. Esaminare se la progenie F 2 ha paralizzato i vermi a causa dell'esistenza di unc-119 (ED3).
  5. Se i vermi non coordinate si trovano sul gradino 5.4, singoli diversi vermi nonuncoordinated per ottenere tutti i vermi nonuncoordinated nella prossima generazione.

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Representative Results

Abbiamo condotto uno screening genetico in avanti con CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) con l'esposizione alla luce 30 minuti seguendo il protocollo standard descritto nelle sezioni 2 e 3. Tra 60 F 1 piastre corrispondenti a 120 genomi aploidi mutagenizzate, abbiamo trovato 8 F 1 piatti con F 2 vermi che mostrano fenotipi visibili, come difetti dimensioni del corpo (figura 3B), il movimento scoordinato (Figura 3C), e la letalità degli adulti (Figura 3D). Non abbiamo notato alcuna differenza nel numero di mutanti tra '1 ° giorno' e le piastre 'Day2'. Tutti progenie di piccoli individuati F 2 vermi e non coordinati F 2 vermi ha mostrato i fenotipi corrispondenti, suggerendo che essi sono mutanti ereditarie. L'osservazione completo è riassunta in Tabella 2. In media, una schermata clonale con 120 genomi aploidi si tradurrà in circa 10 F 1 piastre concontenente vermi con fenotipi visibilmente rilevabili come la forma del corpo e locomozione che facilmente individuato sotto uno stereomicroscopio. Più analisi quantitativa è necessario determinare il tasso di mutazione esattamente 4. Il numero atteso di mutanti visibili da questa schermata suggerisce che il ceppo e la configurazione funzionino correttamente per mutagenesi optogenetic.

Figura 1
Figura 1:. Setup LED (A) L'intero sistema. Il LED è stato montato su un supporto su misura. Dettagli si trovano nella lista dei materiali. (B) Il coperchio è realizzato in plastica. Esso non copre completamente il sistema per evitare l'accumulo di calore. (C) di controllo e la funzione di generatore. (D) Il lato posteriore del sistema. (E) Un piatto di testa di serie con CuCl 2 carta da filtro -soaked per il trattamento luce blu. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2:. Procedura sperimentale per uno schermo Clonal Dopo il trattamento la luce blu, P 0 vermi vengono trasferite a un piatto di teste di serie e ha permesso di deporre le uova. P 0 vermi vengono trasferiti in una nuova piastra testa di serie 1 d dopo il trattamento della luce e hanno ucciso 2 d dopo il trattamento della luce. F 1 vermi vengono individuati dai P 0 piastre. Fenotipi di F 2 vermi vengono esaminati dopo diventano adulti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

10fig3.jpg "/>
Figura 3: Esempio di Mutants (A) ceppo originale per la mutagenesi optogenetic:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Questo ceppo ha normale forma del corpo, il comportamento e le dimensioni covata. Barra di scala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 progenie difetto mostrando dimensioni del corpo (B), scoordinato (C), e (D) fenotipi letali Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1
Tabella 1: genotipizzazione di juSi164 e unc-119 (ED3).

Tabella 2
Tabella 2: Esempio di fenotipi from uno schermo clonale.

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Discussion

Qui, descriviamo una procedura dettagliata di mutagenesi optogenetic usando la sua-mSOG espresso nella linea germinale e fornire un esempio di uno screening genetico in avanti su piccola scala. Rispetto alla mutagenesi chimica standard, questo metodo di mutagenesi optogenetic ha diversi vantaggi. In primo luogo, non è tossico, mantenendo in tal modo il personale di laboratorio da mutageni chimici tossici come SME, ITA e trimethylpsoralen con la luce ultravioletta (TMP / UV). In secondo luogo, la procedura sperimentale di mutagenesi può essere utilizzato per un piccolo numero di P 0 animali e può essere rifinita in un'ora. In terzo luogo, la mutagenesi optogenetic produce un ampio spettro di mutazioni comprese le sostituzioni nucleotidiche e delezioni cromosomiche. Infine, la mutagenesi optogenetic può essere utilizzato per l'integrazione dei transgeni extracromosomici.

Il passo fondamentale in questo protocollo mutagenesi è quello di garantire che il setup LED lavora sul suo-mSOG contenenti ceppi presso l'exefficienza pected. Si consiglia di eseguire una schermata clonale pilota, come descritto nel protocollo Sezione 3, con circa 100 genomi aploidi. La mutagenesi è facilmente scalabile da piccole dimensioni schermi pilota agli schermi nonclonal aumentando il numero di P 0 per il trattamento di luce. Per schermi nonclonal su larga scala, si consiglia di sincronizzare i vermi a gravido giovani adulti e il trasferimento di centinaia di loro con la soluzione M9 in un piatto CuCl 2 per il trattamento della luce. La condizione standard descritto ai punti 2 e 3 si stima che l'efficienza di circa 4,4 volte inferiore rispetto al diffuso metodo di mutagenesi 50 mM SME 4. Il tasso di mutazione può essere migliorata aumentando il tempo di esposizione alla luce e / o aumentando l'intensità della luce. Tuttavia, queste modifiche possono causare fototossicità e portare a dimensioni ridotte covata e la malattia di vermi luminosi trattati. Per aumentare l'efficienza, può essere possibile utilizzare derivati ​​miniSOG con maggiore ROS resa talecome miniSOG (Q103L) anche se può aumentare l'effetto di sfondo mutagenesi senza trattamento luce 16,17. Per la modifica del costrutto di DNA, la Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3'UTR (TBB-2) plasmide (pCZ886) è disponibile in commercio.

Nelle condizioni descritte qui, transgeni integrati vengono generati a circa una linea per ogni 200 F 1, in media, 4 quando si utilizza un ceppo transgenico extracromosomico con una velocità di trasmissione di 10 - 30%. Questa efficienza può essere aumentata utilizzando ceppi transgenici extracromosomici con elevate velocità di trasmissione Come riportato in precedenza per un metodo di radiazione UV 18.

His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic induce mutazioni in una vasta gamma di geni. Inoltre, la frequenza di loci recuperato dallo schermo soppressore rpm-1 mediante mutagenesi optogenetic è simile a quelli dalla stessa schermata usando EMS 4. Tuttavia, è posBLE che mutagenesi optogenetic utilizzando un gene istone può avere una polarizzazione verso alcuni geni, a causa di fattori sconosciuti come la struttura della cromatina. Per risolvere questo problema, è necessario analizzare molte mutazioni indotte da optogenetically sequenziamento dell'intero genoma.

His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic provoca un ampio spettro di mutazioni comprese sostituzioni nucleotidiche singoli e delezioni vanno da 1 bp a qualche centinaio bp 4. Lo spettro di varianti singolo nucleotide suggerisce che le specie reattive dell'ossigeno miniSOG-indotti sono la causa delle mutazioni 4. E 'anche possibile che i danni miniSOG istone proteine e provoca cromatina instabilità perché miniSOG è utilizzato per inattivare proteine così 19. Può essere possibile manipolare il tipo di mutazioni utilizzando la luce di diversa intensità. Dal momento che la mutagenesi optogenetic provoca eliminazioni, è importante analizzare le eliminazioni così come i cambiamenti a singolo nucleotide chedati le sequenziamento del genoma per la mappatura 20.

In precedenza era stato riferito che un microscopio epifluorescente viene utilizzato per miniSOG mediata l'ablazione delle cellule 21,22. L'intensità luminosa di un microscopio composto epifluorescente standard è stato misurato essere ~ 0,5 mW / mm 2 senza lente, che è circa 4 volte inferiore a quello utilizzato nel protocollo di mutagenesi optogenetic standard. Quindi, è altamente consigliabile determinare empiricamente la efficienza nell'utilizzo un microscopio epi fluorescente come fonte luminosa. Un vantaggio del LED è la stabilità per migliaia di ore. Studi precedenti hanno mostrato che miniSOG è più potente ablazione cellule ROS-mediata sotto luce pulsata 22, anche se il meccanismo preciso resta da determinare. Abbiamo usato una funzione di generatore / amplificatore digitale per fare luce pulsata. Un'altra opzione è quella di collegare la sorgente di luce a un computer tramite l'interfaccia USB-TTL (Figura 1A) per regolare la Li LEDGHT da un programma. Il sistema a LED qui descritto può essere utilizzato anche per altri scopi, come il controllo optogenetic di cellule eccitabili utilizzando channelrhodopsin 23, l'ablazione delle cellule utilizzando mitochondria- o membrana cellulare mirati miniSOG 17,22, e Cromoforo-Assisted luce inattivazione (CALI) di proteine 19. Inoltre, questo mutagenesi optogenetic ha il potenziale per essere applicata ad altri organismi, come batteri, lieviti, volare, e zebrafish, così come le linee cellulari di mammiferi.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultra High Power LED light source Prizmatix UHP-mic-LED-460 460 ± 5 nm
LED controller Prizmatix UHPLCC-01
Digital function generator/amplifier PASCO PI-9587C PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.
BNC cable male/male THORLABS CA3136
USB-TTL interface Prizmatix Optional
Photometer THORLABS PM50 and Model D10MM
Filter paper Whatman 1001-110
Stereomicroscope Leica MZ95
NGM plate Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 µg/mL cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6.0). 
Lysis solution 10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl2, 100 µg/mL Proteinase K

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References

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Genetica genome-wide di mutagenesi casuale di modifica del DNA ROS istone-miniSOG integrazione transgene cromosomico cancellazione avanti screening genetico
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