Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية

doi: 10.3791/54811 Published: December 3, 2016

Introduction

محدود عنصر (FE) النمذجة هي تقنية الهندسة التي يمكن حساب حسابيا ورسم خريطة لحجم وموقع السلالات بناء على هيكل 1. يتكون نموذج للهيكل 3D، ممثلة شبكة من "العناصر المحددة"، ويخضع النتيجة النهائية للتحليل من قبل عدد من العوامل بما في ذلك هيكل وعدد من العناصر في شبكة، وحجم وموقع الميكانيكية الأحمال وخصائص المواد. خصائص المواد تصف جوانب معينة من السلوك مادة تحت نوع معين من الحمل. معامل يونج (E) يصف مرونة من المواد في حين يصف نسبة بواسون الانخفاض النسبي في عرض مادة طوله عند امتدت عينة. FE نماذج يمكن استخدامها لحساب مجموعة متنوعة من العوامل بما فيها التهجير، والإجهاد والضغط والإجهاد يتصرف على هذا النموذج من قبل مع الأخذ بعين الاعتبار إدخال البيانات فريدة من نوعها حول الهيكل '؛ ق الشكل والموقع وحجم الأحمال وخصائص المواد المحددة.

ويستخدم على نطاق واسع FE النمذجة في الهندسة (2) وعلى نحو متزايد لتقويم العظام 3 و الحفرية التطبيقات 4. وفي تطور معروفة قوات النشاط الحيوي ليكون بمثابة حافز في العديد من الخلايا لتنشيط استجابة خلايا 5-8 ومن المفيد للتنبؤ على حد سواء المواقف النسبية والمقادير من المحفزات الميكانيكية في تطوير أجهزة الجسم، ومع ذلك، في الوقت الحالي وقد FE النمذجة تستخدم إلا قليلا للتنمية الزرد.

وقد تبين أن كلا الغضاريف والعظام أن تكون المواد mechanosensitive. على سبيل المثال، تم العثور في المختبر ضغط لتفعيل مسارات المولدة للغضروف، في حين ثبت التوتر أنها ضرورية لتكوين العظام 9. وقد استغلت FE التحليل (الهيئة الاتحادية للبيئة) لنموذج السلالات بناء على العينات البيولوجية، بما في ذلك أولئك الذين يعملون على عناصر الهيكل العظمي خلال العظام FOrmation 10. وتشمل التطبيقات الإنمائية الأخرى استخدامه للتنبؤ شكل مشترك بعد تعرضها لقوات النشاط الحيوي النظرية 11،12 ولإظهار نمط من السلالات الحالية خلال كتكوت الركبة التشكل مشترك 8.

ويهدف هذا البروتوكول إلى تبادل الخبرات لتوليد السطوح 3-الأبعاد، تنسجم ونماذج عنصر محدود من الصور مبائر بهدف فهم اليات الأنسجة النامية. وتبين لنا أيضا طرق المصادقة على النماذج FE الرغم من التقاط المعلومات والتشريد مشتركة الحقيقية في الجسم الحي. بينما نستخدم الفك الزرد باعتباره نموذجا نفس تقنيات يمكن استخدامها على أي نظام البيولوجي الصغيرة التي يمكن الحصول على معلومات 3D على هيكل الجهاز العضلي الهيكلي بواسطة التصوير متحد البؤر أو multiphoton.

Protocol

كل الخطوات ضمن بروتوكول تتبع جامعة بريستول رعاية الحيوان والمبادئ التوجيهية الرعاية الاجتماعية وتلك من وزارة الداخلية في المملكة المتحدة.

1. التصور العضلية الهيكلية التشريح

ملاحظة: لتصور شكل من العناصر الهيكلية، لتحديد العضلات وتحديد وضع المحدد من المرفقات العضلات، immunostain (القسم 1.1) الأسماك في العمر المناسب للميوسين الهيكل العظمي (الذي يكشف العضلات) والنوع الثاني الكولاجين (لتصور غضروف). بدلا من ذلك، تصور تشريح العضلات والعظام باستخدام خطوط مراسل الفلورسنت المعدلة وراثيا مثل الكولاجين مراسل A1 col2a1: mCherry 13،14 لتصور الغضروف وبطيئة الميوسين السلسلة الثقيلة مراسل smyhc: GFP 15 إلى تصور موقف إرفاق ملفات العضلات (القسم 1.2).

خطوط بديلة بمناسبة الغضاريف والعضلات يمكن أن تعمل جيد على قدم المساواة.

  1. نيون Immunostaining
    1. إصلاح يرقة في زيادة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 1 ساعة. يغسل في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين 20 (PBT) ويذوى في 50٪ الميثانول (MeOH) في PBT و 100٪ MeOH لمدة 5 دقائق على التوالي.
      تحذير: PFA غير سامة، ويجب أن يتم التعامل معها وفقا لصحيفة سلامة المواد.
      ملاحظة: يمكن تخزين اليرقة في 100٪ MeOH حتى المطلوبة.
    2. ترطيب يرقة في 50٪ MeOH في PBT لمدة 5 دقائق. يغسل في PBT لمدة 5 دقائق.
    3. Permeabilize يرقة في التربسين 0.25٪ في PBT على الجليد لمدة 5-6 دقيقة. يغسل في 4X PBT لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. منع لمدة 2-3 ساعة في 5٪ مصل في PBT.
    5. احتضان اليرقة في التخفيف الموصى بها من أرنب المضادة من نوع 2 الكولاجين والفأر الأجسام المضادة المقاومة للميوسين في 5٪ مصل في PBT لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: مجموعة التخفيف الموصى به هو عادة على ورقة بيانات الأجسام المضادة. اختيار الأجسام المضادة التي تثار ضد الأنواع المختلفة لبعضها البعض، والتي هي أيضا زراعية مختلفةالإيجار إلى الأنسجة.
    6. غسل 6X اليرقة لمدة 15 دقائق في PBT.
    7. منع لمدة 1-2 ساعة في 5٪ مصل في PBT.
    8. احتضان في الأجسام المضادة الثانوية في الظلام. استخدام fluorescently المسمى مكافحة فأر (550) والمضادة للأرنب (488) الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف المناسبة في 5٪ مصل وPBT لالأجسام المضادة المحددة.
    9. غسل 6X لمدة 10 دقائق في كل PBT وصورة على مبائر المجهر 10X في أقرب وقت ممكن.
  2. التصوير العضلية الهيكلية الهندسة
    1. جبل اليرقات البطني على ساترة في الفاتر منخفض الاغاروز 0.3-0.5٪ نقطة انصهار (آخر دورة شهرية) في حل Danieau في 16.
      ملاحظة: الأسماك المعدلة وراثيا ستكون هناك حاجة إلى تخدير في 0.02٪ MS222 (تريكين methanesulfonate، ودرجة الحموضة 7) قبل التركيب وأثناء التصوير.
    2. خذ كومة صورة متحد البؤر في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام عدسة الهدف 10X وتقريب رقمي 2.5x و تقريبا. إعداد الصور للقناة الخضراء والحمراء باستخدام نانومتر 488 و 561 نم يزر على التوالي. صورة في بكسل القرار 512 × 512 مع فاصل زمني بين الطائرات ض من 1.3 ميكرون و 3 متوسطات خط. وسيضم كومة مما أدى ما يقرب من 100 شرائح ض.
    3. تصدير البيانات على شكل سلسلة شجار. وتظهر التوقعات إلى أقصى حد من العضلات والغضاريف عناصر من اليرقة الزرد 5dpf في الشكل 1.

2. توليد سطح 3D

  1. اختيار مجموعة بيانات تمثيلية لكل نقطة زمنية في 3 و 4 و 5 DPF (اختر بعد التصور من عينات متعددة).
  2. فتح 3-الأبعاد كومة شجار وتحديد كافة القنوات في برامج التحليل. انقر بزر الماوس الأيمن على قناة الغضروف واختر صورة مرشح وتمهيد: جاوس (الشكل 2B).
  3. في ضوء مشروع حق انقر على الصورة التي تمت تصفيتها واختر 'تقطيع الصورة' ثم 'تعديل تسمية جديدة ". إنشاء تسمية جديدة لكل مادة، أي الغضروف ويoint. حدد منطقة غضروف الصورة (الشكل 2C، إشارة البيضاء، الخطوط العريضة الأرجواني) باستخدام أداة العصا السحرية. استخدام أداة فرشاة لإزالة الضجيج من الخطوط.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم أداة العصا السحرية، انقر فوق "جميع شرائح.
  4. حدد منطقة مشتركة مع أداة الفرشاة وتعيين إلى مكون مشترك (الشكل 2C، المخطط الأزرق)
  5. شرائح متعددة ناعمة في آن واحد عن طريق تحديد تجزئة في القائمة العلوية والعلامات على نحو سلس. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر توليد سطح لإنتاج سطح 3D تجعل من المكون (الشكل 2D).
  6. انقر على السطح وحفظ البيانات كملف hmascii للاستيراد إلى برنامج الربط.

3. حساب القوات العضلات لاستخدامه في FE نموذج

  1. حساب عدد الألياف العضلية من الصور مبائر من smyhc: GFP الزرد المعدلة وراثيا (الشكل 1A، رأس السهم، 1C) وقياس بقطرالعطر من الألياف لحساب مساحة المقطع صليبهم (πr 2).
  2. تحديد القوة المناسبة لكل وحدة مساحة العضلات من الأدب. واستخدمت القوة العضلية القصوى ولدت في وحدة المساحة للعضلات الهيكل العظمي الزرد اليرقات (40 ن ن / ميكرون 2) 17.
  3. حساب القوى من أجل كل مجموعة العضلات التشريحية بضرب عدد من الألياف ومنطقتهم من قبل القوة في وحدة المساحة. انظر الجدول 1.

4. توليد لشبكة

  1. استيراد نموذج 3D ولدت في القسم 2 (أعلاه) إلى مجموعة من البرامج قادرة على توليد شبكة العناصر المحدودة.
  2. توليد A2D شبكة من الغضروف والسطوح المشتركة باستخدام أداة يتقلص التفاف ضمن القائمة 2D. اختر حجم العنصر المناسب.
    ملاحظة: استخدام حجم عنصر بين 1.5-2.5. إذا لزم الأمر، وتوليد مجموعة من سطح 2D الحجم بشكل مختلف الحديدية لتنفيذ 3D شبكة الأمثل (القسم 4.4).
  3. القيام بعمليات تفتيش جودة شبكة وجدت تحت "2D> أدوات> تحقق عناصر" لوحة للتحقق من العناصر المكررة، الإدراج والاختراقات في شبكة. إصلاح زاوية زوجية باستخدام علامة التبويب فائدة في شجرة النموذج.
  4. توليد شبكة 3D من تنسجم سطح 2D من اختلاف حجم عنصر باستخدام subpanel 3D> Tetramesh.
    ملاحظة: مقارنة نتائج أحجام شبكة مختلفة، واختيار النموذج FE بأقل حجم شبكة أن يتقاطع بعد مزيد من عمليات المحاكاة ولا تساوم تعريف الميزة. على سبيل المثال في الشكل (3) يحتوي على 1.5 مليون العناصر رباعي السطوح لغضاريف الفك السفلي، وكان حجم عنصر 2D من 2.0.
  5. تحويل شبكة بذلك نموذج الفك على نطاق وفقا كومة متحد البؤر باستخدام الهندسة> بعد subpanel.
    ملاحظة: تأكد من الغضروف وترتبط مكونات مشتركة في النموذج من خلال تصدير نموذج المدمجة أو باستخدام العلاقات بين البلدين.

5. عنصر محدود وزارة الدفاعالبناء ايل

  1. باستخدام البرمجيات التجارية العناصر المحدودة (FE)، خلق نموذج FE. باستخدام العضلات والغضاريف 3D المسمى مداخن متحد البؤر ولدت في القسم 1 كدليل، تعيين العقد التي تتوافق مع نقاط التعلق العضلات. إنشاء ناقلات بين عقدتين تمثل الأصل والإدراج من كل العضلات (الشكل 3).
  2. إنشاء جامع شحنة من "التاريخ" نوع لتطبيق "تحميل C" لكل عضلة. تحديد الحجم في نيوتن (المحسوبة في الخطوة 3.3) وتعيين ناقلات المرتبطة بها. ويبين الشكل 3 نقاط مرفق للفك السفلي المقرب (AM)، منقلة اللامي (PH) وintermandibularis (IM).
    ملاحظة: للحصول على هذه عضلات الفك، يتم توزيع أقصى قوة مقلص بين الأصل والإدراج بحيث يتم تطبيق 50٪ فقط من كل حمولة في كل موقع.
  3. تعيين خصائص المواد الخواص المرنة المناسبة على النحو الذي تحدده الأدب. معامل يونغ لغضروفوكانت interzone في هذا النموذج 1.1 ميجا باسكال و 0.25 ميجا باسكال على التوالي وكان نسبة بواسون 0.25 لكل من 18،19.
  4. إنشاء جامع حمولة من نوع "الحدود" لتطبيق القيود الأولية على النموذج. انتقل إلى علامة التبويب تحليل> القيود وفي خلق subpanel، واختيار العقد على النموذج الذي ترغب في تقييد. حدد درجات الحرية (DOF) أن حركة الحد من النموذج إلى أفضل تقريب نطاقها الطبيعي للحركة.
    ملاحظة: تم تقييد هذا النموذج في الشكل (3) في جميع محاور الحركة (DOF: 1، 2، 3 تمثل س، ص و z على التوالي) في قرني لامي لتثبيته في الفضاء في منتصف نقطة في نموذج وفي محور y و ض عند النقطة التي تربط palatoquadrate إلى بقية الجمجمة الزرد (الشكل 3، الجدول 1). يجب أن تكون مقيدة نموذج في كل شعبة الشؤون المالية الثلاث في أقل عقدة واحدة.
  5. إنشاء "تحميل خطوة، لكل نوع من أنواع الحركة التي ترغب في simulأكل (أي فتح، إغلاق)، ضمن القائمة تحليل وتحديد كافة الأحمال ذات الصلة (صنع في القسم 5.2) والقيود (صنع في القسم 5.4) لمحاكاة هذه الحركة. اختر 'ثابت' من القائمة المنسدلة عند ظهوره.
  6. نموذج التصدير بما في ذلك شبكة، والأحمال والقيود وخصائص المواد في تنسيق الملف المناسب، في شكل هذه القضية ".inp".
  7. نموذج الحمل في برامج التحليل FE. إنشاء وتنفيذ وظيفة للنموذج باستخدام وحدة العمل.
  8. تحليل الناتج عن الإجهاد، والتوتر، والتشريد، وما إلى ذلك وجدت في نتائج التبويب والقائمة التصور (الشكل 4 و 5).

6. التحقق من الفك التشوه / المهجرين المسافات

  1. حدد 3-6 تيراغرام (Col2a1aBAC: mcherry) الزرد المعدلة وراثيا.
  2. بخفة تخدير اليرقات مع 0.02٪ MS222 حتى انتهوا إلى الاستجابة للمس ولكن قلوبهم لا تزال الضرب.
  3. جبلاليرقات أفقيا (في حين مخدرة) coverslips على في الفاتر 1٪ من آخر دورة شهرية الاغاروز (تتكون في حل Danieau ل).
  4. إزالة الاغاروز من حول الرأس والفك مع ملقط.
  5. طرد حل جديد Danieau ل(مع عدم وجود MS222) على رأس اليرقة لإزالة التخدير باستخدام ماصة باستور حتى تستأنف حركات الفم العادية.
  6. استخدام الفيلم التقاط برامج لاتخاذ مشرق الميدان عالية السرعة الفيديو من حركات الفم. خذ الأفلام من حول مدة دقيقة على أعلى معدل الإطار، أو كافية لتسجيل دورات متعددة من فتح الفك.
  7. اختيار الإطارات التي تظهر الفك مفتوحة إلى أقصى النزوح لها. قياس المسافة بين طرف الأمامي من غضروف ميكل والفك العلوي (غيض من لوحة الغربالية) في ميكرون.
  8. حساب متوسط ​​النزوح من يرقات الأسماك متعددة.
  9. استخراج البيانات النزوح من الطراز. استخدام متوسط ​​النزوح المحسوبة في 6.8 للتحقق من السلوك النزوح نموذجي (

Representative Results

المناعية للعضلة (الشكل 1A) والغضاريف (الشكل 1B) أو التصوير من الصحفيين المعدلة وراثيا (الشكل 1C) يسمح للهيكل 3D من الفك أن تصور، جنبا إلى جنب مع الجهاز العضلي المرتبطة بها. بواسطة التصوير بدقة عالية كان من الممكن لبناء نموذج الذي يلتقط كل من شكل ثلاثي الأبعاد من الفك (الشكل 2) والموقع ووضع الأحمال (الشكل 3). استخدام في نزوح فيفو ينظر من خلال التقاط فيديو عالي السرعة (الشكل 4) ونحن التحقق من أن مجموعة من الحركة في النموذج كان ضمن مجموعة واقعية.

يمكن استخدام نماذج FE مرة واحدة المدى لعرض مجموعة من البيانات، مثل الإجهاد (الشكل 5A)، والحد الأدنى والحد الأقصى للسلالة الرئيسي (الشكل 5B - K). هذه النتائج هي ثلاثة قاتمة، ensional ذلك نموذج يمكن تضخيم لمعرفة أنماط غرامة من التفاصيل (الشكل 5E، 5I) استدارة للحصول على وجهات النظر ذات الصلة (الشكل 5F، 5G، 5J، 5K) ومقطوع رقميا (الشكل 5E، 5E ''، 5I، 5I '') لإظهار كيف أن أنماط من الإجهاد أو سلالة أو التغير في الضغط طوال هذا النموذج. ومن الممكن أيضا لاستخراج البيانات الكمية من طراز (لا يظهر). من خلال التحقق من نموذج وباستخدام أدق خصائص المواد، والأحمال وشبكة شكل نموذج FE يمكن استخدامها لاستكشاف أفضل تقدير للبيئة الميكانيكية التي تمر بها الخلايا خلال تلك النافذة التنمية. نتائج نموذج يمكن مقارنة مباشرة للتغيرات في السلوك الخلوية والتعبير الجيني 20.

إعادة 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg "/>
الشكل 1: صور الممثل من العناصر العضلات والعظام من الفك السفلي الزرد في 5 DPF مداخن متحد البؤر التمثيلية للالفك السفلي من اليرقات 5dpf كلها تظهر مع الأمامي إلى أعلى (A) المناعية للA4.1025 التي بقع جميع الميوسين الهيكل العظمي (ب) المناعية لنوع الثاني الكولاجين الذي يصادف كل الغضروف (C) كومة من يرقة حية معربا عن صحفيين col2a1 المعدلة وراثيا: mCherry علامات الغضروف (الحمراء)، وsmyhc: GFP العضلات بطيئة (الأخضر). IA: intermandibularis الأمامي، PH: منقلة اللامي، AM: المقربة الفك السفلي، مرحبا: اللامي السفلي، مرحبا: اللامي متفوقة، CH: القصية اللامية، MC: غضروف ميكل، PQ: Palatoquadrate، CH: قرني لامي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 2
الشكل 2: جيل من سطح 3D من البيانات مبائر الصور تظهر الانتقال من البيانات مبائر إلى 3D سطح الفك السفلي الزرد مع التكبير العالي في المنطقة المشتركة. (أ) البيانات متحد البؤر الخام. (ب) الإدراجات بعد تطبيق فلتر التمويه. (ج) مخطط تصفيتها. سطح (D) 3D. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): شبكة الممثل تظهر القيود وناقلات قوة تنسجم التمثيلية لليرقة 5 DPF ل(A) إغلاق الفم و.(ب) فتح الفم. بقع بيضاء دلالة على الأماكن التي يتم تقييد نموذج والتي الأبعاد (على سبيل المثال، x و y أو X و Y و Z). خطوط بيضاء تدل على مواقع العضلات، مع ناقل القوة العضلية الرمز بواسطة السهام البيضاء. يظهر الأحمر الغضروف والاصفر interzone. تم تعديل هذا الرقم من المواد التكميلية التي نشرت سابقا في برانت وآخرون. 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: اختبار الحساسية FE-نموذج محاكاة النزوح الفك في الزرد 5dpf لغضروف مختلفة والرجوعية يونغ interzone. الفك النزوح (مفتوح ليغلق في ميكرون) وضعت على الفك. سجلت باستخدام مفتاح اللون. كل نموذج (أ - L) لديها مجموعة مختلفة من الغضروف (ج = 1.1، 3.1، أو 6.1 ميجا باسكال) أو interzone (ط = 0.25، 0.5، 0.75، أو 1 ميجا باسكال) الخصائص. الأفقي السهم الأسود يسلط الضوء على قيمة النزوح الفك في غيض من غضروف ميكل (ويمثلها السهم الأسود العمودي). M و N لقطات من الفيديو من 5 يرقات DPF تبين الحد الأدنى، أي مغلق الفك (M) والحد الأقصى، أي الفك مفتوحة بالكامل (N) مع اثنين من فرضه (O) - خط أبيض حول O يمثل تشريد (43 ميكرون). في هذه الحالة النسبية خصائص غضروف 1.1 مع interzone 0.25 (أ) أفضل مباراة نزوح ينظر في الأسماك الحية (O). لوحات AL هذا الرقم يكون قد سبق نشرها في برانت وآخرون. 15. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرسأيون من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: بيانات تمثيلية من نماذج المحاكاة FE FE-نموذج من جميع عضلات تطبيقها في 5 DPF يرقة (A - C). (A) فون ميزس (EMaxmin) (ب) سلالة الحد الأدنى الرئيسي (E مين. P، μɛ) (C) سلالة الرئيسي أقصى (E ماكس. P.، μɛ). محاكاة FE-نموذج من السلالات الرئيسية القصوى والدنيا خلال فتح الفك. (D - K): سلالة الرئيسي أقصى (. إي ماكس P.، μɛ) في (د) عرض الفك بطني و (E) عرض مشترك بطني (E) يبين موقع أقسام الداني القاصي من خلال غضروف ميكل المشتركة وinterzone في (E ') و (E' ')، على التوالي. (F): الجانبيالفك الرأي. (G): عرض مشترك الجانبي. (H - K): سلالة الرئيسي الحد الأدنى (هاء مين P، μɛ) في (H) عرض الفك بطني و(I) عرض مشترك بطني. (I) ويبين موقع المقاطع الداني القاصي من خلال مشترك غضروف ميكل وinterzone في (أنا ') و (أنا' ') على التوالي (J): الجانبي عرض الفك. (K): عرض مشترك الجانبي. وقد تم هذا الرقم المنشور سابقا في برانت وآخرون. 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

عدد من الألياف العضلية منطقة الألياف العضلية (ميكرون 2) منطقة مجموعة العضلات (ميكرون2) قوة (N)
5 DPF intermandibularis الأمامي 5 23.8 119 4.76e-6
5 DPF منقلة اللامي 6 23.8 142.8 5.71e-6
5 DPF المقرب الفكية 9 23.8 214.2 8.57e-6

الجدول 1: الكمي العضلات. محسوب متوسط قوات العضلات لIntermandibularis الأمامي، المقرب للفك والمنقلة اللامي في 5 DPF باستخدام 40 ن ن / ميكرون 2 (القيمة في وحدة المساحة المأخوذة من الإشارة 17). (Lorga وآخرون، 2011) (ن = 3).

Discussion

وقد استخدمت نماذج عنصر محدود لربط المناطق من العناصر الهيكلية التي هي تحت ضغط مع تلك التي تتعرض لتكوين العظام 10، وكذلك لرسم خريطة للمناطق تحت الضغط خلال التحجر غضروفي والتشكل مشترك 8،12،21. وكانت دراسات أخرى أيضا قادرة على تطبيق نماذج النمو النظرية لتكرار التغييرات خلال التنمية المشتركة 11،12. هنا نعرض بروتوكول لبناء نماذج FE للنظام بسيط نسبيا، الفك الزرد 20. خلافا لأساليب بديلة لجمع الصور الخام للنماذج FE، مثل الفحص بالاشعة المقطعية 22، التصوير متحد البؤر من خطوط المعدلة وراثيا أو الزرد immunostained يسمح لأنسجة متعددة لدراستها. فإنه يمكن، بالتالي، تقديم معلومات مباشرة على نقاط التعلق العضلات فيما يتعلق الغضروف. ومن بين النماذج الفقاريات الزرد قابلة جدا للتلاعب الجيني والدوائي. توليد نماذج FE لالزردالغضروف القحفي يفتح حتى الآن إمكانية إجراء مزيد من الدراسة للتفاعل بين الميكانيكا الحيوية وعلم الوراثة في التشكل المشترك.

وهناك عدد من الخطوات الحاسمة لعملية خلق نموذج FE. الأول هو توليد تمثيل دقيق ثلاثي الأبعاد للنظام. وهذا يتطلب التصوير في قرار مرتفع بما فيه الكفاية أن تحدد بوضوح حدود. لاحظ أنه حتى مع ارتفاع القرار التصوير لجعل سطح جيد واحد قد يكون لتذليل بعض المناطق. خطوة حاسمة أخرى هي تحديد موضع الصحيح للتحميل والقيود الصحيحة. ستفشل نموذج مقيدة بما فيه الكفاية لحلها وسوف وضع غير صحيح من الأحمال يسبب حركة غير طبيعية.

بعض معالجة البيانات الخام (الشكل 2) ضروري كسطح المتولدة من البيانات الخام سيكون من الصعب شبكة (الشكل 2B). نحن تصفية البيانات باستخدام فلتر جاوس (الشكل 2C

من المهم أن نتذكر أن هناك دائما حدود لنموذج افتراضي و جعل ssumptions لتشغيل نماذج FE. عندما وضع نماذج فقط واحد أو عدد قليل من عينات من الأهمية بمكان لضمان أن عينة تمثيلية يتم اختيار كما أن هناك احتمالا أن تكون الاختلافات الصغيرة بين الأفراد. كما أدرجت فقط بعض العناصر الفك والعضلات، وهذا النموذج هو نسخة مبسطة من نظام العضلات والعظام القحفي الزرد. ولذلك، كان القيود على وضعه لحساب حيث العناصر الفك غرار سوف يربط مع بقية الجمجمة ونموذج مقيدة بشكل مصطنع في وسط لاصلاحها في "الفضاء". لم هذا القيد الاصطناعي لن يؤثر على تفسير استخلاصها من نماذج مثل قرني لامي لم تحلل نفسها. إدراج أكثر من هيكل القحفي، خصوصا الأخرى الفك فتح العضلات مثل sternohyals والغضاريف المرفقة به 23، يمكن أن تضاف إلى هذا النموذج، وإنما تشمل القيود على قدرة النماذج الكبيرة للتشغيل في البرنامج عنصر محدود.

الصورة = "jove_content"> الحد الآخر هو أننا لم غرار الرباط الإدراج، رغم أن هذا يمكن تحقيقه عن طريق إدخال الينابيع 8. كان واحدا افتراض الأخرى التي تقدمت بها في هذه الحالة أن هذا النموذج سوف تتصرف خطيا. وكانت مقادير من الضغوط على نماذج مماثلة لتلك التي في النماذج المنشورة وتطبيقها على خلايا في المختبر 10،24، مع سلالات يجري تحت 3500 وفوق -5000 μɛ بصرف النظر عن القيد والتعلق العضلات نقطة. لذلك، اعتبرت السلالات في المناطق ذات الصلة من طراز ضمن نطاق مقبول لنموذج خطي. الغضروف لا تتصرف تماما كمادة الخطية وسبق غرار كمادة poroelastic، مما مكن تحليل سلوك السوائل في نموذج 25. ان نشر نقاط التعلق العضلات بين مجموعة من العقد المحلية توزيع القوات الذروة وتمثل أكثر دقة الإدراج العضلات لعضلات معينة.

والأنف والحنجرة "> استخدام FE يتيح إجراء تقييم للسلالات والضغوط بناء على الهيكل. وتقنية في كثير من الأحيان يتم استخدامه في العديد من التخصصات العلوم الحيوية بما في ذلك العظام، علم المتحجرات ومؤخرا البيولوجيا التطورية. نحن هنا تصف كيفية بناء فاس للالزرد الفك السفلي، وفي المستقبل يمكن تمديد هذه النماذج للنظر في الفك كله، بما في ذلك الحنك. تقنيات مماثلة يمكن استخدامها لنموذج الميكانيكا الحيوية في العمود الفقري في الأسماك، والتي حتى الآن لم معظمها تم دراستها من قبل وسائل الحركية.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وقد طبع بعض البيانات في التين 3-5 من J.Biomech، 48 (12)، برانت وآخرون، والنمذجة عنصر محدود يتوقع تغييرات في شكل مشترك وسلوك الخلية بسبب فقدان شد عضلي في التنمية الفك، 3112-22. 2015، بإذن من السيفير 15.

Acknowledgments

وقد تم تمويل LHB من قبل برنامج الدكتوراه خلية يلكوم ترست الحيوي. وقد تم تمويل كار عن طريق منحة المشروع MRC MR / L002566 / 1 (تمنح للEJR وCLH)، والممول من قبل الوامق ARUK منحة 19479. كما نود أن نشكر منشأة وولفسون Bioimaging للحصول على المشورة التصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coll2 Abcam ab34712 Type II collagen antibody - stains all cartilage
A4.1025 / MF20 Developmental studies hybridoma bank A4.1025 Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle 
Low melt agarose Sigma  A9414-5G For mounting zebrafish
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) Sigma E10521-10G To make anesthetic
Trypsin Fisher T/3760/48 sample permeablilisation
Dylight 488 Mouse IgG Thermofisher 35502 Secondary antibody
Dylight 550 Rabbit IgG Thermofisher  84541 Secondary antibody
SP8/SP5 or SPE confocal Leica  For imaging 
LAS Leica capture software Leica Imaging software
Aviso (version 7.0.0) FEI Visualization Science Group 3D image analysis software (Section 2)
Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) Altair Engineering FE model generating software (Section 4-5)
Abaqus (version 6.14) SIMULIA FE analysis software (Section 5.7-5.8)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rayfield, E. J. Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).
  2. Rao, S. S. The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. (2010).
  3. Taylor, M., Prendergast, P. J. Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities. J Biomech. 48, 767-778 (2015).
  4. Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments. Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).
  5. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).
  6. Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension. Dev biol. 370, 154-163 (2012).
  7. Rolfe, R. A., et al. Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways. BMC genomics. 15, 48 (2014).
  8. Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint. J Biomech. 44, 143-149 (2011).
  9. Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli. Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).
  10. Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones. J Biomech. 41, 249-258 (2008).
  11. Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis. J Biomech. 47, 989-995 (2014).
  12. Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis. J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).
  13. Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling. Development. 136, 3991-4000 (2009).
  14. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).
  15. Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity. Development. 135, 2115-2126 (2008).
  16. Danieau's solution (30×). Cold Spring Harb Prot. pdb.rec12467 (2011).
  17. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).
  18. Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse. J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).
  19. Tanck, E., et al. The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone. Bone. 35, 186-190 (2004).
  20. Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development. J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).
  21. Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos. PloS one. 6, e17526 (2011).
  22. Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium. Peer J. 3, 1294 (2015).
  23. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo. Development. 124, 2945-2960 (1997).
  24. Dowthwaite, G. P., et al. A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation. Matrix biol. 22, 311-322 (2003).
  25. Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. Poroelasticity of cartilage at the nanoscale. Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).
بناء نماذج العناصر المحدودة المعنية بالتحقيق في الزرد الفك الميكانيكا الحيوية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brunt, L. H., Roddy, K. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics. J. Vis. Exp. (118), e54811, doi:10.3791/54811 (2016).More

Brunt, L. H., Roddy, K. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics. J. Vis. Exp. (118), e54811, doi:10.3791/54811 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter