Introduction
Методом конечных элементов (FE) моделирование является инженерная техника , которая может вычислительно рассчитать и сопоставить величину и местоположение штаммов , действующих на конструкцию 1. Модель состоит из 3D-структуры, представленной сеткой "конечных элементов", и конечный результат анализа определяется целым рядом факторов, включая структуру и количество элементов в сетке, величины и расположения механического нагрузки и свойств материала. Существенные свойства описывают некоторые аспекты поведения материала при заданном типе нагрузки; модуль Юнга (Е) описывает эластичность материала в то время как коэффициент Пуассона описывает пропорциональное уменьшение ширины материала к его длине при растяжении образца. КЭ моделирование может быть использовано для вычисления различных переменных, включая перемещение, напряжение, давление и деформации, действующей на модели, принимая во внимание уникальные входные данные о структуре "; S форма, расположение и величина нагрузки и специфические свойства материала.
FE моделирование широко используется в технике 2 и все чаще для ортопедических 3 и палеонтологических приложений 4. В развитии биомеханические силы , как известно, выступают в качестве стимула во многих клетках , чтобы активировать клеточные ответы 5-8 и полезно для прогнозирования как относительные положения и величины механических стимулов в развивающихся систем органов, тем не менее, в настоящее время КЭ моделирование было мало используется для данио развития.
Оба хрящевой и костной было показано, что механочувствительных материалы. Например, сжатие в пробирке было обнаружено , чтобы активировать хондрогенное пути, в то время как напряжение было показано, что необходимо для образования костной ткани 9. FE анализ (FEA) было использовано для моделирования штаммов, действующие на биологических образцах, в том числе и те, которые действуют на скелетных элементов во время кости Foия 10. Другие разработки приложений включают его использование для прогнозирования форму сустава после того, как он подвергся воздействию теоретических биомеханических сил 11,12 и показать картину штаммов , присутствующих во время птенца коленного сустава морфогенеза 8.
Этот протокол направлен на обмен опытом создания 3-мерных поверхностей, сеток и конечно-элементных моделей из конфокальных изображений с целью понимания механики развивающихся тканей. Мы также покажем способы проверки моделей FE , хотя захватив реальное совместное перемещения информации в естественных условиях. В то время как мы используем данио челюсть как образец одни и те же методы могут быть использованы на любой малой биологической системы, для которой 3D информация о структуре костно-мышечной системы могут быть получены с помощью конфокальной или многофотонной томографии.
Protocol
Все шаги в рамках протокола следуют Университет ухода за животными Бристоля и принципов социального обеспечения и тех, Министерство внутренних дел Великобритании.
1. Визуализация костно-мышечной анатомии
Примечание: Для того, чтобы визуализировать форму скелетных элементов, чтобы определить количество мышечной массы и определить точное расположение креплений мышц, immunostain (раздел 1.1) рыбы в соответствующем возрасте для скелетных миозина (который показывает мышцы) и тип II коллагена (для визуализации хрящ). В качестве альтернативы, визуализировать костно - мышечной анатомии , используя трансгенные флуоресцентные репортер линии , такие как коллаген a1 репортер Col2a1: mCherry 13,14 визуализировать хрящ и медленный тяжелой цепи миозина репортер smyhc: GFP 15 , чтобы визуализировать положение мышечных вложений (раздел 1.2).
Альтернативные линии, отмечающие хрящей и мышц может работать одинаково хорошо.
- Флуоресцентные Immunostaоцен- ками
- Закрепить личинку в избытке 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в течение 1 часа. Стирать в PBS с 0,1% твина 20 (PBT) и обезвоживают в 50% метаноле (MeOH) в неразбавленном 100% МеОН в течение 5 мин соответственно.
Внимание: PFA является токсичным и должны быть обработаны в соответствии с материальным листом безопасности.
Примечание: Личинка может храниться в 100% МеОН до тех пор, пока требуется. - Увлажняет личинку в 50% MeOH в PBT в течение 5 мин. Стирать в PBT в течение 5 мин.
- Проницаемыми личинку в 0,25% трипсина в PBT на льду в течение 5-6 мин. Стирать в 4x PBT в течение 5 минут каждый.
- Блок в течение 2-3 ч в 5% сыворотки в PBT.
- Выдержите личинку в рекомендуемом разведении кролика против 2 типа коллагена и мышиное анти-миозина антител в 5% сыворотки в PBT в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
Примечание: Рекомендуемый диапазон разбавления, как правило, на листе данных антител. Выбор антител, поднимаемых в отношении различных видов друг с другом, и которые также раарендную плату ткани. - Вымойте личинка 6х в течение 15 минут в PBT.
- Блок в течение 1-2 ч в 5% сыворотки в PBT.
- Инкубируйте в вторичными антителами в темноте. С помощью флуоресцентно меченого анти-мышь (550) и анти-кролика (488) вторичные антитела при соответствующем разведении в 5% сыворотки и PBT для специфического антитела.
- Мытье 6X в течение 10 минут каждый в PBT и изображения на конфокальной микроскопии 10X как можно скорее.
- Закрепить личинку в избытке 4% параформальдегида (PFA) в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в течение 1 часа. Стирать в PBS с 0,1% твина 20 (PBT) и обезвоживают в 50% метаноле (MeOH) в неразбавленном 100% МеОН в течение 5 мин соответственно.
- Опорно - двигательный визуализации Геометрия
- Установить личинки вентрально на покровное в прохладную 0,3-0,5% с низкой температурой плавления (LMP) агарозы в растворе Danieau в 16.
Примечание: Трансгенные рыбы необходимо будет седативные в 0,02% MS222 (Tricaine метансульфонат, рН 7) перед монтажом и во время съемки. - Возьмите конфокальной стек изображения интересующей области с помощью 10-кратного объектива и приблизительно 2.5x цифровой зум. Подготовка изображений зеленого и красного канала с использованием 488 нм и 561 пм лазеров соответственно. Изображение с разрешением 512 пикселей х 512 с интервалом между плоскостями г 1,3 мкм и 3 средних линий. Полученный монолитный пакет будет состоять из примерно 100 г ломтиков.
- Экспорт данных в виде серии в формате TIFF. Максимальные проекции мышечных и хрящевых элементов из 5dpf данио личинки показаны на рисунке 1.
- Установить личинки вентрально на покровное в прохладную 0,3-0,5% с низкой температурой плавления (LMP) агарозы в растворе Danieau в 16.
2. Создание 3D Surface
- Выберите представительный набор данных для каждой временной точки, в 3, 4 и 5 DPF (выберите после визуализации нескольких образцов).
- Открыть 3-мерный стек TIFF и выбрать все каналы в программное обеспечение для анализа. Щелкните правой кнопкой мыши на канале хрящевой и выберите фильтр изображения и сглаживание: Gaussian (рис 2B).
- В окне проекта щелкните правой кнопкой мыши на отфильтрованного изображения и выберите "сегментация изображения", а затем "редактировать новую метку '. Создайте новый ярлык для каждого материала, то есть, хрящей и Joint. Выберите хрящевую область изображения (рис 2С, белый сигнал, фиолетовый контур) с помощью волшебной палочки инструмент. С помощью инструмента кисть для удаления шума с очертаниями.
Примечание: При использовании волшебной палочки инструмент, выберите «Все кусочки». - Выберите область соединения с помощью кисти и назначить для совместного компонента (рис 2С, синий контур)
- Гладкие несколько ломтиков сразу, выбрав сегментацию в верхнем меню и гладких этикеток. Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите генерировать поверхность для создания 3D - визуализации поверхности компонента (рис 2D).
- Нажмите на поверхности и сохранить данные в виде hmascii файла для импорта в переплетения программного обеспечения.
3. Расчет мышечных усилий, чтобы быть использованы в FE Model
- Подсчитайте количество мышечных волокон из конфокальных изображений smyhc: GFP трансгенной данио (Фигура 1А, стрелолист, 1С) и измерить диамметром волокон , чтобы вычислить их площадь поперечного сечения (2 πr).
- Определить подходящую сила на единицу площади мышц из литературы. Максимальная мышечная сила , генерируемая на единицу площади для личиночной данио скелетных мышц (40 нн / мкм2) использовали 17.
- Расчет сил для каждой анатомической группы мышц путем умножения количества волокон и их площадь силой на единицу площади. Приведены в таблице 1.
4. Создание сетки
- Импорт 3D модель сгенерированный в разделе 2 (выше) в пакет программного обеспечения, способного генерировать конечный элемент сетки.
- Генерация A2d сетки хряща и суставных поверхностей с помощью инструмента целлофановые под меню 2D. Выберите подходящий размер элемента.
Примечание: Используйте размер элемента между 1,5-2,5. При необходимости, произвести целый ряд различных размеров 2D поверхности сетки осуществить оптимизацию сетки 3D (раздел 4.4). - Проводят качества сетки проверки на вкладке "2D> Инструменты> Проверка элементов 'панель для проверки дублированных элементов, вставок и проникновений в сетке. Устранить двугранные углы с помощью вкладки утилиты в дереве модели.
- Создавать 3D-сетки с поверхности сетки 2D разного размера элемента с помощью субпанель 3D> Tetramesh.
Примечание: Сравните результаты различных размеров сетки и выбрать модель FE с наименьшим размером ячейки, сходящийся после дальнейшего моделирования и не ставит под угрозу определение функции. В примере на рисунке 3 содержит 1,5 миллиона тетраэдрических элементов для нижних хрящей челюсти и имел 2D размер элемента 2,0. - Transform сетку так, челюсти модель в масштабе в соответствии с конфокальной стека с использованием геометрии> Расстояние субпанель.
Примечание: Убедитесь, что хрящ и совместные компоненты соединены в модели, экспортируя объединенную модель или с помощью связей.
5. конечных элементов Modэль Строительство
- Использование коммерческих конечных элементов (FE) программное обеспечение, создать модель FE. Использование 3D-мышцы и хрящи маркированы конфокальной стеки, сгенерированные в разделе 1 в качестве руководства, назначить узлы, которые соответствуют точкам прикрепления мышц. Создайте вектор между двумя узлами , представляющими происхождение и вставки каждой мышцы (рисунок 3).
- Создание коллектора нагрузки 'истории' типа применить 'C' нагрузки для каждой мышцы. Укажите величину в ньютонах (рассчитанных на шаге 3.3) и назначить соответствующий вектор. На рисунке 3 показаны точки крепления для приводящего челюстями (AM), транспортир hyoideus (PH) и intermandibularis (IM).
Примечание: Для этих мышц челюсти, максимальное сократительной усилие распределяется между исходной точкой и вставки таким образом, что только 50% от каждой нагрузки осуществляется на каждом участке. - Назначают соответствующие упругие свойства изотропного материала, как определено в специальной литературе. модуль Юнга для хрящаи Interzone в этой модели было 1,1 МПа и 0,25 МПа , соответственно , и коэффициент Пуассона 0,25 для обоих 18,19.
- Создание коллектора нагрузки "границы" типа применить начальные ограничения на модели. Перейдите на вкладку Analysis> Ограничения и в создании субпанели, выбрать узлы на модели вы хотите ограничить. Выберите степеней свободы (DOF), которые ограничивают движение модели до наилучшего приближения его естественного диапазона движения.
Примечание: Модель на рисунке 3 была ограничена по всем осям движения (глубина резкости: 1, 2, 3 представляют х, у и г, соответственно) в ceratohyal , чтобы закрепить его в пространстве в средней точке в модели и в Y и Z оси в точке , где palatoquadrate соединяется с остальной частью данио черепа (рисунок 3, таблица 1). Модель должна быть ограничена во всех трех ДОФ в хотя бы один узел. - Создание 'шаг Load', для каждого типа движения вы хотите Simulели (то есть открытие, закрытие), в меню анализа и выбрать все соответствующие нагрузки (сделанные в разделе 5.2) и ограничений (сделано в разделе 5.4) , чтобы имитировать это движение. Выберите 'Static' из выпадающего меню, когда он появится.
- Экспорт модели в том числе сетки, нагрузок, ограничений и свойств материалов в соответствующем формате файла, в этом формате случае ".INP".
- Модель нагрузки в программное обеспечение для анализа FE. Создание и выполнение задания для модели с использованием модуля работы.
- Анализировать выход для напряжения, деформации, перемещения и т.д. , найденного в закладке результатов и меню визуализации (рисунок 4 и 5).
6. Проверка Челюсти / Деформация смещения Расстояния
- Выберите 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mcherry) трансгенного данио.
- Слегка анестезировать личинок с 0,02% MS222, пока они не перестанут реагировать на прикосновения, но их сердца все еще бьется.
- гораличинки в боковом направлении (в то время как под наркозом) на покровных в прохладную 1% LMP агарозы (составил в растворе Danieau в).
- Удалите агарозы из вокруг головы и челюсти с пинцетом.
- Промойте свежим раствором Danieau в (без MS222) над головой личинки, чтобы удалить анестезии с помощью пипетки Пастера, пока нормальные движения рта не возобновится.
- Используйте программное обеспечение захвата кино взять ярко-полевые видео с высокой скоростью движений рта. Возьмите фильмы около минуты длительности на самой высокой скорости кадров, или достаточно, чтобы записать несколько циклов открывания челюсти.
- Выберите кадры, которые показывают челюсть открытой до максимального смещения. Измерьте расстояние между передним концом хряща Меккеля и верхней челюсти (кончик решетчатой пластины) в мкм.
- Вычислить среднее смещение из нескольких личинок рыб.
- Извлечение данных смещения от модели. Используйте среднее смещение, рассчитанное в 6.8 для проверки модели поведения смещения (
Representative Results
Иммуногистохимическое мышцы (рис 1А) и хрящевой ткани (рис 1б) или изображений трансгенных репортеров (фиг.1С) позволяет 3D структура челюсти , чтобы визуализировать, вместе с соответствующим мускулатуру. По визуализации при высоком разрешении можно было построить модель , которая как трехмерную форму челюсти (рисунок 2) и расположение и размещение грузов (рисунок 3). Использование в естественных условиях смещений видели при захвате видео высокой скорости (рисунок 4) , мы убедились , что диапазон движения в модели была в пределах реалистичного диапазона.
Модели FE После запуска может быть использован для отображения диапазона данных, таких как стресс (рисунок 5А), минимальной и максимальной главной деформации (фиг.5В - K). Эти результаты являются тремя тусклыми ensional поэтому модель можно увеличить , чтобы увидеть прекрасные образцы деталей (рис 5e, 5i) поворачивается , чтобы получить соответствующие взгляды (рис 5F, 5G, 5J, 5K) и в цифровом виде секционного (рис 5E ', 5E' ', 5i', 5i '') , чтобы показать , как паттерны напряжения, деформации или изменения давления по всей модели. Кроме того, можно извлечь количественные данные из модели (не показана). Подтвердив модели и используя самые точные свойства материалов, нагрузки и сетки форму модель FE может быть использован для изучения наилучшей оценки механической среды, испытываемых клеток во время этого окна развития. Результаты модели могут быть непосредственно по сравнению с изменениями в клеточном поведении и экспрессии генов 20.
Re 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Характерные образы элементов опорно - двигательного аппарата данио нижней челюсти на 5 DPF Типичные конфокальной стеки нижней челюсти личинок 5dpf все показано с передним вверх (А) иммуногистохимическое A4.1025 , который окрашивает все скелетные миозин (B) иммуногистохимическое II типа коллагена , который помечает все хрящей (C) Стек из живой личинкой выражения трансгенные репортеров Col2a1: mCherry маркировка хрящ (красный) и smyhc: GFP медленный мышцы (зеленый). IA: intermandibularis передняя, PH: транспортир hyoideus, AM: аддуктор челюстями, HI: hyoideus хуже, HI: hyoideus превосходит, CH: sternohyoideus, MC: хрящ Меккелев, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Генерация 3D поверхности от конфокальной данных изображения , показывающие переход от конфокальной данных в 3D - поверхности для данио нижней челюсти с большим увеличением совместного региона.. (A) Исходные данные конфокальной; (Б) Dataset после применения фильтра Гаусса; (C) Filtered контур; (D) 3D поверхность. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Типичные сетки , показывающие ограничения и векторы силы Типичные сетки для 5 DPF личинкой для (A) и закрытия рта.(B) во рту открытие. Белые точки обозначают места , где ограничена модель и в которой размеры (например, х и у или х, у и г). Белые линии обозначают мышечные позиции, с вектором силы мышц, обозначенном белыми стрелками. Красный показывает хрящ и Желтый Interzone. Эта цифра была изменена из дополнительного материала , ранее опубликованного в Брант и др. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: тестирование чувствительности FE-модель имитации смещения челюсти в 5dpf данио для различных хрящей и межзоны модулей Юнга. Челюсть перемещение (открытого в закрытое в мкм) отмечен на челюсти; записанные с помощью ключа цвета. Каждая модель (А - Л) имеет различную комбинацию хряща (с = 1,1, 3,1 или 6,1 МПа) или межзоны (I = 0.25, 0.5, 0.75, или 1 МПа) свойствами. Горизонтальная черная стрелка указывает на значение смещения челюсти на кончик хряща Меккеля ( в лице вертикальной черной стрелкой). М и N кадры из видео , 5 DPF личинок показывая минимум, то есть, челюсти закрыты (М) и максимум, т.е. челюсть полностью открыт (N) с двумя наложенными (O) - белая линия на O представляет смещение (43 мкм). В этом случае относительная свойства хрящ 1.1 с Interzone 0,25 (А) лучший матч перемещения видели в живую рыбу (O). Панели AL этой фигуры были ранее опубликованы в Бранта и др. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенное версион этой фигуры.
Рисунок 5: Типичные данные модели FE FE-имитационная модель всех мышц , применяемых в 5 денье личинка (А - С).. (A) Мизеса (EMaxmin) (B) Минимальная главной деформации (Е Мин. Р, μɛ) (C) Максимальная основная деформация (E Макс. P., μɛ). FE-имитационная модель максимальных и минимальных главных деформаций при открывании челюсти. (D - K): Максимальная главная деформация (. E Макс П., μɛ) в (D) вентральной челюсти и (E) вентральный совместный вид (Е) показывает расположение проксимальных-дистальных отделов через хряща Меккеля сустава и Interzone в (Е ') и (Е' '), соответственно. (F): боковаячелюсть вид. (G): боковой вид сустава. (H - K): Минимальная главной деформации (. E Min P, μɛ) в (H) зрения вентральной челюсти и (I) вентральный совместного просмотра. (I) показывает расположение проксимальной-дистальной участков через хрящ сустава Меккеля и межзоны в (I ') и (I' ') , соответственно , (J): вид сбоку в челюсть. (K): боковой вид сустава. Эта цифра была ранее опубликована в Бранта и др. 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Количество мышечных волокон | Область мышечного волокна (мкм 2) | Площадь группы мышц (мкм2) | Сила (N) | |
| 5 DPF intermandibularis передняя | 5 | 23,8 | 119 | 4.76e-6 |
| 5 DPF транспортир hyoideus | 6 | 23,8 | 142,8 | 5.71e-6 |
| 5 DPF аддуктор челюстями | 9 | 23,8 | 214,2 | 8.57e-6 |
Таблица 1: Мышцы Количественное. Вычисленной средней силы мышц для Intermandibularis Передней, Adductor челюстями и транспортир Hyoideus на 5 DPF с использованием 40 Nn / мкм 2 (стоимость в расчете на единицу площади , взятой из ссылки 17). (Lorga и др., 2011) (N = 3).
Discussion
Конечно - элементных моделей были использованы для соотнесения областей скелетных элементов , которые находятся под напряжением с тех , которые подвергаются костеобразование 10, а также для отображения области , находящиеся под напряжением во время эндохондральной окостенение и совместного морфогенеза 8,12,21. Другие исследования также были в состоянии применить теоретические модели роста для репликации изменений во время совместной разработки 11,12. Здесь мы показываем протокол для построения моделей FE для относительно простой системы, данио челюсти 20. В отличие от альтернативных методов сбора необработанных изображений для моделей FE, таких как КТ 22, конфокальной микроскопии трансгенных линий или иммунологически данио позволяет нескольким ткани должны быть изучены. Он может, таким образом, обеспечивают прямую информацию о точках крепления мышц по отношению к хрящевой ткани. Среди позвоночных животных моделей данио особенно поддаются генетической и фармакологической манипуляции. Поколение моделей FE для даниокраниофациальные хрящ в настоящее время открывает возможность дальнейшего изучения взаимосвязи между биомеханики и генетики в совместном формообразования.
Есть целый ряд важных шагов в процессе создания модели FE; первый генерирует точный трехмерное представление системы. Это требует обработки изображений при достаточно высоком разрешении, чтобы четко определить границы. Обратите внимание, что даже с высокой разрешающей способностью, чтобы сделать хорошую поверхность, вероятно, придется сгладить некоторые регионы. Другим важным шагом является определение правильного размещения груза и правильных ограничений. Недостаточно ограничена модель будет не в состоянии решить и неправильное расположение нагрузок вызовет ненормальное движение.
Некоторые обработки необработанных данных (рисунок 2) необходимо в качестве поверхности , генерируется из необработанных данных , было бы трудно меш (Фигура 2В). Мы фильтруют данные с помощью гауссовского фильтра (рис 2C
Важно помнить, что всегда есть ограничения гипотетической модели иssumptions сделал для запуска моделей FE. При моделировании только один или небольшое число выборок, которые имеет решающее значение для обеспечения того, чтобы репрезентативная выборка выбирается так как, вероятно, будут небольшие вариации между людьми. Как только некоторые из элементов челюсти и мышцы были включены, модель представляет собой упрощенную версию данио краниофациальной системы опорно-двигательного аппарата. Таким образом, ограничения должны были быть установлены, чтобы учесть, где смоделированные элементы челюстной бы соединиться с остальной частью черепа и модель была искусственно ограничена в центре, чтобы зафиксировать его в "пространстве". Это искусственное ограничение не повлияло на интерпретации, проведенной из моделей как ceratohyal сам не был проанализирован. Включение большего количества краниофациальной структуры, особенно другие открытия мышцы челюсти , такие как sternohyals и подключенного к нему хряща 23, мог бы добавить к модели, но ограничения включают в себя способность больших моделей для работы в программном обеспечении конечных элементов.
s = "jove_content"> Другим ограничением является то, что мы не смоделирован вставки связки, хотя это может быть достигнуто путем введения пружин 8. Еще одно предположение, сделанное в этом случае было то, что модель будет вести себя линейно. Величины напряжений на моделях , были сопоставимы с теми , в опубликованных моделях и применены к клеткам в пробирке 10,24, штаммами быть ниже +3,500 и выше -5,000 μɛ кроме ограничений и прикрепления мышц точек. Таким образом, штаммы в соответствующих областях модели были признаны в пределах диапазона приемлемых для линейной модели. Хрящ не ведет себя полностью как линейный материал и ранее был смоделирован как пороупругой материал, который позволил анализировать поведение жидкости в модели 25. Распространение места прикрепления мышц среди кластера локальных узлов будет распределять пиковые силы и более точно отражают вставку мышц для определенных мышц.
лор "> Использование FE позволяет провести оценку деформаций и напряжений, действующих на конструкции. В качестве методики она часто используется во многих бионаучных дисциплин, включая ортопеда, палеонтологии и совсем недавно биологии развития. Здесь мы опишем, как построить FES для данио нижняя челюсть. в будущем эти модели могут быть расширены, чтобы смотреть на всю челюсть, включая вкус. Подобные методы могут быть использованы для моделирования позвоночника биомеханики в рыбе, которая до сих пор в основном были изучены с помощью кинематических средств.Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Некоторые данные на фиг 3-5 была перепечатана из J.Biomech, 48 (12), Брант и др., Моделирование методом конечных элементов предсказывает изменения в совместной форме и поведения клеток из - за потери мышечного напряжения в развитии челюсти, 3112-22. , 2015, с разрешения Elsevier 15.
Acknowledgments
LHB финансировался программой Wellcome Trust Dynamic Cell PhD; КАР финансировалось за счет гранта проекта MRC MR / L002566 / 1 (присужден и CLH Эйр) и CLH финансировалось за счет гранта Aruk 19479. Мы также хотели бы поблагодарить центр Wolfson биоимиджинга за советом к визуализации.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coll2 | Abcam | ab34712 | Type II collagen antibody - stains all cartilage |
| A4.1025 / MF20 | Developmental studies hybridoma bank | A4.1025 | Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle |
| Low melt agarose | Sigma | A9414-5G | For mounting zebrafish |
| MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) | Sigma | E10521-10G | To make anesthetic |
| Trypsin | Fisher | T/3760/48 | sample permeablilisation |
| Dylight 488 Mouse IgG | Thermofisher | 35502 | Secondary antibody |
| Dylight 550 Rabbit IgG | Thermofisher | 84541 | Secondary antibody |
| SP8/SP5 or SPE confocal | Leica | For imaging | |
| LAS Leica capture software | Leica | Imaging software | |
| Aviso (version 7.0.0) | FEI Visualization Science Group | 3D image analysis software (Section 2) | |
| Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) | Altair Engineering | FE model generating software (Section 4-5) | |
| Abaqus (version 6.14) | SIMULIA | FE analysis software (Section 5.7-5.8) |
References
- Rayfield, E. J. Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).
- Rao, S. S. The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).
- Taylor, M., Prendergast, P. J. Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities. J Biomech. 48, 767-778 (2015).
- Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments. Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).
- Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension. Dev biol. 370, 154-163 (2012).
- Rolfe, R. A., et al. Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways. BMC genomics. 15, 48 (2014).
- Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint. J Biomech. 44, 143-149 (2011).
- Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli. Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).
- Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones. J Biomech. 41, 249-258 (2008).
- Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis. J Biomech. 47, 989-995 (2014).
- Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis. J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).
- Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling. Development. 136, 3991-4000 (2009).
- Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).
- Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity. Development. 135, 2115-2126 (2008).
- Danieau's solution (30×). Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).
- Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse. J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).
- Tanck, E., et al. The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone. Bone. 35, 186-190 (2004).
- Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development. J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).
- Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos. PloS one. 6, e17526 (2011).
- Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium. Peer J. 3, 1294 (2015).
- Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo. Development. 124, 2945-2960 (1997).
- Dowthwaite, G. P., et al. A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation. Matrix biol. 22, 311-322 (2003).
- Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. Poroelasticity of cartilage at the nanoscale. Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).
