Introduction
A doença cardíaca continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo 1,2. Não só é o ventrículo esquerdo (VE) da câmara mais muscular, responsável pelo bombeamento de sangue do coração para o corpo inteiro 3, é um comum local da lesão cardíaca pós-enfarte do miocárdio 4. morte do tecido ventricular esquerda muitas vezes resulta em insuficiência cardíaca sistólica. modelos animais de doença cardíaca são fundamentais para o avanço da pesquisa cardiovascular biomédica. A estirpe C57BL / 6 de camundongos têm sido uma escolha popular para modelos animais devido ao seu tempo de reprodução rápida, de baixo custo e facilidade de alterações genéticas. A maioria dos modelos cirúrgicos murinos para o estudo de doenças cardíacas envolvem a oclusão da LAD ramo da artéria coronária esquerda. A LAD é chamado às vezes à esquerda obtusa marginal 5,6. O LAD fornece sangue ao anterior do ventrículo esquerdo e as paredes ântero-lateral. estudos de oclusão LAD visam induzir infartos anteriores, às vezes estendendo-se into das regiões de parede inferior e lateral 7.
Dois modelos que são usados com freqüência para estudos de infarto do miocárdio incluem infarto do miocárdio oclusão crônica e lesão de isquemia / reperfusão do miocárdio. A oclusão crônica é criado por sutura cirúrgica ao redor e bloquear permanentemente o fluxo de sangue através do LAD. A lesão de isquemia / reperfusão é criado muito da mesma maneira única com um transiente, geralmente 30-60 min, período isquémico. Para alcançar a isquemia transiente, os laços de oclus de sutura em torno do LAD e um tubo de PE-10 pequeno que é colocado paralelamente à ADA na superfície do epicárdio do coração, seguido por um período de reperfusão em que a tubagem e a oclusão de sutura é retirado e o sangue é deixado fluir uma vez mais através da artéria e no miocárdio. A cirurgia de isquemia / reperfusão foi considerado clinicamente relevante devido à natureza da lesão de reperfusão em paralelo com o tratamento de enfartes do humanos, que inclui promangioplastia pt coronariana e implante de stent da artéria, ou cirurgia de revascularização. Tipicamente, durante estas cirurgias, isquemia do VE em um coração de rato é confirmada pela palidez visível da parede miocárdica. No entanto, simplesmente realizando as cirurgias em uma almofada de eletrocardiograma (ECG) em condições de monitoramento constante, mudanças visíveis pode ser observada na forma de onda ECG, confirmando assim isquemia e reperfusão do miocárdio mouse.
Embora o coração de murídeo é semelhante ao coração humano em muitos aspectos, incluindo a sua estrutura de quatro câmaras, os corações também têm diferenças. Uma diferença óbvia é a frequência cardíaca média de repouso de camundongos adultos é de 600 - 700 batidas por minuto (bpm), enquanto que a dos humanos adultos é ~ 60-100 bpm 8,9. Além disso, em ratinhos, as ondas de repolarização J e t, frequentemente fundir-se com o QRS complexo despolarização fazendo uma clara do segmento ST difícil discernir 10. Para complicar o processo de electrocardiographicallY confirmando isquemia do miocárdio, é a elevação da onda T e do segmento ST, que são utilizados como marcadores para o diagnóstico de lesão de isquemia e enfarte do miocárdio em seres humanos, clinicamente referido como ST E levation m yocardial i nfarction ou IAM. Uma das principais diferenças entre as formas de onda humana e murina é que o S-onda é imediatamente seguido ser um J-ondas que transfere diretamente para uma onda T negativa. Durante a isquemia miocárdica aguda em ratos diminui a amplitude da onda S e é directamente seguida por uma J-onda anormal e uma onda T invertido 11. A onda T não parece representar uma parcela significativa da repolarização em ratos 11. Apesar de nomenclatura e rato vs. diferenças humanas, ECG confirmação da isquemia miocárdica murino e reperfusão é ainda viável e relativamente simples. Por uma questão de simplificação da interpretação da forma de onda, o segmento entre o SJT é referido como ST-SEGMENT aqui.
EAMCEST orientações publicadas em 2013 recomendar um tempo paciente porta-para-balão inferior a 90 min 12 .Este significa que o período de tempo desde a identificação de oclusão da artéria coronária do paciente até que a artéria é reaberto deve ser inferior a 90 min. O coração batendo está trabalhando constantemente e, portanto, tem um alto metabolismo oxidativo e um alto nível de consumo de oxigênio 3. Para proporcionar esta, uma rede de capilares é acessível a cada um dos miócitos 3. Leva apenas um coração alguns batidas de esgotar seu oxigênio e nutrientes. Em uma janela de 90 minutos, uma região isquêmica do coração em um ser humano terá sido impedido de receber entre 5.400 e 9.000 coração bate pena de sangue rico em oxigênio. Nessa mesma janela de 90 minutos, um rato teria 54.000 para 63.000 batimentos cardíacos. Os pontos de tempo experimentais para a lesão de isquemia / reperfusão murino são tipicamente entre 30 e 60 min.
A importância de desenvolvering um método complementar de confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão num modelo murino tem profundas implicações sobre a consistência e reprodutibilidade dos dados em estudos de isquemia / reperfusão miocárdica. A prática corrente de se observar visualmente o coração por uma mudança na cor do tecido não é adequada como um stand-alone de diagnóstico. Além disso, a reperfusão após a remoção do tubo de sutura e não é garantida. Embora a artéria não está mais ligada off, a artéria pode ter danos sofridos durante o procedimento e pode tornar-se impossível de reperfusão. Seria benéfico para ter um registro de alterações eletrocardiográficas para confirmar reperfusão em vez de confiar em observações de palidez do miocárdio e rubor (cor vermelha). Corações que não mostram os marcadores de lesão de isquemia / reperfusão pode então ser rapidamente sinalizado e uma decisão sobre como proceder podem ser feitas pelos investigadores.
Por último, o estabelecimento de um registro de ECG muda da linha de base em todo the períodos de isquemia e reperfusão permite aos investigadores continuam a monitorar o coração após a cirurgia inicial. Os investigadores atualmente perder de vista o coração, logo que a cirurgia está concluída. ECG é uma maneira simples para obter insights sobre as mudanças que ocorrem nas horas miocárdio dias após a cirurgia. ECG registrados em pontos de tempo após a cirurgia poderia revelar ondas Q de desenvolvimento tardio indicando continuação ou piora da morte do tecido. No entanto, para calibrar eficazmente novos ou agravamento marcadores eletrocardiográficos, um ECG de base devem estar disponíveis para comparação.
Este protocolo irá demonstrar como preparar, obter e interpretar o ECG para confirmar isquemia e reperfusão do coração mouse usando 8 - do sexo masculino 12 semanas de idade C57BL / 6.
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Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos realizados em animais devem ser realizadas de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório 13 ou outras diretrizes éticas adequadas. Os protocolos devem ser aprovados pelo comitê de bem-estar animal na instituição adequada antes de prosseguir.
1. Preparação para o ECG
NOTA: Antes de começar, don equipamento de protecção individual, incluindo luvas, óculos e um casaco de laboratório limpo ou bata descartável.
- Limpe a almofada de ECG usando um não-álcool e solução de descontaminação com base não-lixívia. Gentilmente usar uma tarefa delicada wipe para apagar o excesso de solução para garantir que o bloco de eletrodo não se danifique.
- Se a almofada de ECG tem uma característica de aquecimento, usá-lo. camundongos anestesiados tendem a perder o calor do corpo rapidamente. Aquece-se a almofada para 40-42 ° C para manter a temperatura corporal normotérmica de 37 ° C durante toda a cirurgia 14. Monitorar temperamento corpoAture usando um termômetro retal. Ajustar a temperatura do rato conforme necessário para manter a temperatura do corpo ~ 37 ° C.
- Como a maioria das toracotomias são executadas com o mouse deitado de costas (supino), garantir que a alternância é virado para a configuração "supino". Muitas almofadas ECG tem uma função para alternar entre as posições prona e supina. Fracasso para selecionar a orientação correta pode resultar em deturpação de eventos eletrocardiográficos.
- Anestesiar rato usando 5% de isoflurano inalado e 1 L / min de oxigénio. Uma vez rato é anestesiado, rato transferência para ECG almofada equipado com uma anestesia nariz-cone e reduzir isoflurano a 2% e 1 L / min de oxigénio. Confirmar a anestesia adequada, garantindo mouse não reagir quando o pé do mouse é beliscado com uma pinça.
- Aplique uma camada fina de pomada lubrificante ocular sobre os olhos do rato para evitar ressecamento e danos à córnea, enquanto anestesiados.
- Limpar as patas do rato com um lenço umedecido para remover todo o fundamento visívelque pode ser preso às patas ou pode interferir com a transmissão de impulsos eléctricos a partir das patas para a almofada de ECG. patas secos com um pano.
- Aplique uma pequena quantidade (um pouco menor do que uma moeda de dez centavos USD) de gel de eletrólito altamente condutivo para cada um dos quatro eletrodos metálicos no teclado de ECG.
Nota: Certifique-se de aplicar apenas uma pequena quantidade de gel como demasiado gel torna difícil para conter as patas para o bloco usando fita. Além disso, as patas são susceptíveis de deslizar para fora do sistema de retenção durante a cirurgia se eles estavam molhados antes de aplicar fita. - Com o mouse na posição supina, use fita adesiva médica clara para conter cada pata a seu eletrodo correspondente (Figura 1). Primeiro pressione cada pata ao seu pedaço de fita e, em seguida, aderir a fita para o pad ECG. Certifique-se de que cada pata é contido em contacto com o gel do electrólito e do eléctrodo.
2. Aquisição do ECG
- Dependendo do equipamento utilizado para a aquisição de ECG, configura a máquina de modo que a forma de onda do ECG podem ser visualizados em tempo real. Para registos de ECG, utilizando as configurações de monitorização fisiológicas em uma máquina de ecocardiografia, uma imagem em modo B vivo terá a forma de onda do ECG correndo ao longo da parte inferior da tela.
Nota: Consulte guias individuais do usuário de máquina para determinar a melhor forma de configurar o equipamento. - Permitir a visualização em tempo real de forma de onda ECG, pressionando a tecla de modo B em uma máquina de ecocardiografia ou o equivalente em outros dispositivos de gravação de ECG.
- Ajuste a resolução para explicar as diferenças de amplitude. Se o pico da onda R ou a calha (vale) da onda Q estão fora da moldura visual, ajustar a resolução até que toda a altura da forma de onda pode ser observada.
Nota: Isto pode ser feito na guia configurações fisiológicas em uma máquina de ecocardiografia. Clique no aumento ou diminuição setas até que toda a forma de onda é visível.
- Ajuste a resolução para explicar as diferenças de amplitude. Se o pico da onda R ou a calha (vale) da onda Q estão fora da moldura visual, ajustar a resolução até que toda a altura da forma de onda pode ser observada.
- Qualquer vez que uma imagem é para ser obtained, limpe a almofada ECG de ferramentas. Tocar o mouse durante a gravação de ECG com uma pinça ou os dedos vai perturbar a forma de onda. Certifique-se de que o mouse ainda intocado e está na plataforma de ECG antes de gravar qualquer ECGs.
- Use "record" da máquina ou recurso "loja" antes de fazer qualquer incisões cirúrgicas no mouse. Esta imagem será utilizada como uma base para comparação mais tarde.
3. Procedimento cirúrgico e gravação de ECG
- Injectar rato anestesiado com analgésico (buprenorfina, 1,5 g, intraperitoneal) antes de começar. Os detalhes da isquemia / reperfusão, intervenção cirúrgica pode também ser encontrada em outros lugares 5.
- Remover os pêlos ao redor do local da cirurgia quimicamente ou mecanicamente e desinfectar a área com uma solução de betadine. Use um bisturi para fazer uma incisão vertical paralelo ao esôfago e traquéia. Suavemente mover os nódulos linfáticos para cada lado da incisão até que o tecido fino que cobre a traqueia éexposto. Usando fórceps, suavemente separar o tecido até que os anéis de cartilagem branca da traqueia são visíveis.
Nota: Nós usamos geralmente Nair loção remoção de pêlos. A loção é aplicada sobre o local cirúrgico para ~ 1 min. Nair é, então, cuidadosamente lavado com soro fisiológico ou água. Este método é preferido porque no nosso laboratório de alta resolução ecocardiografia (que pode detectar folículos pilosos) é realizada antes e após a cirurgia. No entanto, deve ser tomado cuidado para evitar áreas sensíveis, como os órgãos genitais, e, em seguida, lavar bem o Nair off para evitar queimaduras potenciais da pele. - remover rapidamente o nariz do rato a partir do nariz-cone e inserir tubos de ventilação na boca do rato e para a garganta. Quando a ponta do tubo de ventilação é visível através da área exposta do pescoço, alinhar o tubo com o início da traqueia. Gentilmente mexer lado do tubo para o outro enquanto aplica pressão para cima até os slides tubo na traqueia que podem ser confirmadas visualmente ttravés da traqueia translúcido.
- Certifique-se de que o rato permanece anestesiado durante o procedimento de intubação. Pausa de intubação e retornar o mouse para o nariz-cone se ele começa a se mexer.
- Usando um laço de corda, gancho dois dentes da frente do rato através do laço e prenda com fita a string termina à almofada ECG para firmar a cabeça do rato e garantir o tubo de ventilação não se move durante a cirurgia. anexar rapidamente a tubulação de ventilação para ventilação roedores e ajustar as configurações de ventilação de acordo com o peso do mouse. tubo de ventilação de fita no lugar.
- Cubra traqueia exposta do rato com uma gaze embebida em solução salina quente para manter o tecido de secagem.
- Adicione uma incisão vertical, utilizando um escalpelo ao longo do lado esquerdo do esterno.
- Usando fórceps, suavemente separar a camada de fáscia a partir da camada muscular. Corte cuidadosamente as camadas musculares subjacentes sem cortar os vasos sanguíneos visíveis.
- Utilizando uma pinça, pegue a terceira costela e puxepara cima delicadamente. Manter controle sobre a costela com uma mão e usar uma tesoura cirúrgica para cortar cuidadosamente o tecido intercostal entre a terceira ea quarta costela. Certifique-se de que os pulmões não estão danificados.
Nota: Os pulmões irá retrair profundamente na cavidade torácica quase imediatamente após a cavidade torácica é perfurada pela incisão cirúrgica devido à perda de gradiente de pressão. Espere até que os pulmões têm retraído antes de continuar. - Use uma pinça para agarrar e suavemente separar a camada fina de pericárdio que circunda o coração.
- Inserir manualmente afastadores ou utilizar uma pinça como afastadores de nervura para mover as nervuras para uma posição onde o coração é visível entre as nervuras.
Nota: É prática comum para mover pata inferior esquerdo do rato de modo a que esta se sobreponha à pata direita inferior durante a colocação da ligadura. Isto ajuda a posicionar o coração, de modo que o apêndice atrial esquerda ou orelha, é facilmente visível durante a colocação da ligadura. Esteja ciente de que ECG válido waveforms não será obtido enquanto a pata esquerda inferior está desligado do eléctrodo. Por esta razão, é aconselhável para voltar a pata para o seu eléctrodo, após a ligadura de sutura é passado através do tecido do miocárdio, mas antes de um nó é apertada. - Localize o LAD visualmente, abaixo da aurícula esquerda. Rapidamente inserir um 7-0 seda afilado agulha de sutura no miocárdio profundamente o suficiente para passar debaixo da LAD, mas não tão profundo como para penetrar a cavidade do VE. Puxar a sutura através da ligadura até que haja cerca de 4 cm de seda de sutura à esquerda na (não-agulha) extremidade livre da sutura ligadura.
- Começam a amarrar um nó de sutura simples. Uma vez que a extremidade livre da sutura de seda foi puxado através dos laços de modo a formar o nó, pausa.
- Segurando ambas as extremidades livres e agulha da seda de sutura com uma pinça, insira uma seção cm ~ 1 da PE-10 tubos por baixo do nó formando e sobre a superfície do epicárdio.
- Se pata esquerda do rato é atravessada, voltar a pata a seu propor eletrodo. Apertar nó de modo a que o tubo de PE-10 é suturado ao coração. Libere todo o contato físico com o mouse para permitir ECG a ser gravado.
- Permitir onda de ECG para percorrer para ~ 10 seg. Verifique ECG onda visual e forma de onda registro como "Tempo de oclusão". Se a onda T não aumenta em amplitude dentro de 1 min, reavaliar colocação da ligadura.
- Se a amplitude da onda T não aumentar, quer descartar o animal do estudo ou tentar corrigir a colocação da ligadura.
- verificar visualmente a cor do miocárdio para confirmar empalidecendo isquémica do LV.
- Se alterações no ECG e alterações na cor do miocárdio indicam isquemia, nó duplo a sutura em torno do tubo PE-10.
- Cubra a cavidade torácica aberta com gaze salina morna.
- Ficha de ECG a cada 5-10 min durante a duração do período isquémico.
4. Confirmação de reperfusão Usando ECG
- Remover salina gaze covetocar a cavidade torácica e visualizar o coração.
- Utilize uma lâmina para cortar a sutura de seda no topo do tubo de PE-10. Uma vez que a ligadura é cortado, remover a seção de tubo PE-10 e retire cuidadosamente a ligadura de sutura do miocárdio.
- Libere todo o contato físico com o mouse e permitir que a forma de onda ECG ~ 10 segundos para percorrer. onda de registro como "Time de reperfusão." Continuar a registar ondas de ECG a cada 5-10 min até o ponto de tempo experimental desejada seja atingida.
- Ajustar a resolução para mudanças na amplitude, conforme necessário. Se a onda T não altera após a remoção do tubo de PE-10 e ligadura, reperfusão não foi confirmada.
- Se a onda T não muda após a remoção do tubo, ou descartar o animal do estudo ou tentar corrigir a colocação da ligadura.
- inspecionar visualmente miocárdio para confirmar adicionalmente reperfusão pelo retorno à cor vermelha.
- Fechar cavidade torácica por sutura do espaço intercostal com um 5-0fio de seda ao aplicar pressão suave para o peito do rato para expelir o excesso de ar que entrou durante uma cirurgia. Então suturar as camadas musculares e, finalmente, a pele. Nota: A aplicação de pressão para a cavidade torácica pode não ser suficiente para evacuar a cavidade de caixa de ar em todos os ratinhos. Portanto, o método da seringa e da agulha de evacuação deve ser empregue para assegurar que todo o ar foi expulso.
- Grave o último ECG antes de virar a anestesia inalatória fora e remover as patas do rato dos eletrodos. Aumentar o oxigênio a 2 L / min e manter a ventilação até que o mouse recupera a consciência.
- Permitir mouse para recuperar em um ambiente controlado de temperatura constante, por exemplo, almofada de aquecimento ou incubadora quente, para evitar a variabilidade do enfarte. Tratar com buprenorfina rato 24 horas após a cirurgia e em seguida, se necessário, tal como indicado pela escala de rato careta.
Nota: Procedimento de reperfusão também é discutida em detalhe por Xu et al 5.
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Representative Results
Um ECG normal de murino é apresentada na Figura 2 com marcadores alfabéticos para eventos eléctricos P, Q, R, S, J e T. P representa a despolarização atrial inicial. QRS é a onda de despolarização ao longo dos ventrículos. J é repolarização precoce e T representa a repolarização heterogêneo também conhecida como recuperação de 11. Deve notar-se que muitos laboratórios não utilizar a nomenclatura J-ondas e não se referem à SJT do segmento como a do segmento ST 10,15-17. Aqui, os resultados e as análises são representativos e baseado fora de observações de laboratório de 40 ratos. A maioria dos ratos apresentaram progressões de forma de onda semelhantes ao longo da cirurgia. Os ratos que não apresentam formas de onda similares foram marcados para posterior análise e foram considerados animais não-infartados. Resultados similares forma de onda também têm sido relatados por Jong et ai. 15.
corações murino suffering de isquemia regional, devido à oclusão da LAD tipicamente apresentam um aumento de amplitude da onda-R, bem como o pico hiperaguda do segmento JT-seguido pela eventual elevação do segmento ST A Figura 3 mostra o primeiro sinal de isquemia miocárdica aguda.; pico hyperacute do T-wave. Como pode ser visto nesta figura, a onda T aumentou em amplitude de condições da linha de base. No entanto, isto não é ainda elevação do segmento ST, porque a onda S projectam ainda está profundamente e negativamente como o faz na forma de onda de linha de base.
Configuração de linha de base do ECG exibe uma onda S projectam de forma negativa (Figura 2). Com o passar do tempo, alterações no ECG são anotados. O segmento ST é definido como o segmento entre o fim da onda S e o início da onda T. Este segmento ST é clara em humanos. Devido à frequência cardíaca alta, esse segmento é mesclado em ratos e um, repolarização precoce "J-wave" Setembro adicionalarates S- e t-ondas. Portanto, a elevação da onda S para a linha isoeléctrico ou maior deve ser considerado como a versão murina de elevação do segmento ST. Na Figura 4 a progressão da isquemia para enfarte precoce pode ser visto por elevação do segmento ST. Aqui, a onda S exibe na amplitude elevada, acima da linha de isoeléctrico. O J-ondas também é elevada, especialmente quando comparado com a forma de onda de referência (Figura 2). Por conseguinte, o segmento ST é elevada o que é indicativo de lesão / infarto 10.
Figura 5 segue a progressão de um rato a partir da linha de base durante todo o tempo de reperfusão. A primeira forma de onda apresenta um ritmo sinusal normal que foi gravada a linha de base. A segunda forma de onda exibe o ECG 1 min após a ligadura foi amarrado e a artéria tornou-se ocluído. O círculo vermelho nesta linha indica o pico da onda T hyperacute. Se wi comparaçãoth "Linha de Base", é evidente que a onda T é elevado. A terceira forma de onda mostra a elevação do segmento ST completa no ponto de tempo de 5 minutos. Na imagem "1 min de isquemia", a onda S projectam ainda estava negativamente, passando a linha isoeléctrico. No entanto, a 5 min a parte S do complexo não chegar tão longe negativo como deveria antes de avançar para as J- e t-ondas. Isso é descrito como elevação do segmento ST porque o segmento entre o S e ondas T é elevada a partir da linha isoelétrica. Outro marcador electrofisiológico de isquemia regional é alargamento do intervalo QT-16, que se estende desde o início do complexo QRS e continua até ao final da onda T. Aos 20 min de isquemia, o intervalo QT ampliou ea ST-segmento ainda é elevado. Após 45 min de isquemia, os restos do intervalo QT se arregalaram e do segmento ST permanece elevada.
A reperfusão do miocárdio, que possuisido isquêmico durante 30 minutos ou menos deve resultar no ECG retornando às condições da linha de base em um mouse. Preda e Burlacu estabeleceu uma correlação entre as alterações eletrocardiográficas murino, tempo de isquemia e gravidade do infarto 17. Observou-se que períodos de isquemia de 30 minutos não causar alterações permanentes no ECG enquanto que períodos isquémicos de 1 h causou alterações ECG permanentes. Além disso, a reperfusão da artéria obstruída, após 24 horas de isquemia não teve nenhum efeito residual 17. Normalmente, Q-ondas pode ser identificada como a ligeira saliência para baixo um pouco antes a despolarização QRS-complexo. Significativas, ou patológicas ondas Q pode desenvolver logo após o início da isquemia miocárdica como a morte muscular considerável começa a definir 10. Significativas ondas Q são definidos como pelo menos 1/3 da altura da onda R correspondente, ou por sua vez alongada, o que resulta em uma grande onda Q. Os significativos resultados de ondas Q de uma região do miocárdio mortos electrica desviandol correntes de distância do eléctrodo 7. Após 5 min de reperfusão, a evidência de profundidade, significativas ondas Q começam a aparecer (Figura 5). Além disso, o T-onda retorna à linha isoeléctrico (Figura 5). Após 30 min de reperfusão, as ondas Q negativos permanecem e são propensos mostrando danos permanentes. Neste ponto de tempo, as ondas Q são de largura e profundidade, e indicam que o tecido cardíaco é morrer deflectir as correntes eléctricas em torno da área danificada (Figura 5).
Após isquemia contínua, a progressão de lesões e enfarte leva a projecção T-onda negativa aumentada (Figura 5, 30 min de reperfusão, segundo círculo vermelho). Esta projecção da onda T melhorada devido a um enfarte do verdadeiro será geralmente permanente 7. O segundo circulo vermelho na forma de onda de reperfusão de 30 min mostra o que parece ser uma onda T invertido (Figura 5). Se a 5 umnd T-30 min ondas são comparados, é evidente que a onda T é mais saliente negativamente. Isso, juntamente com as significativas ondas Q fornece evidência para dano tecidual permanente a este coração. Deve notar-se que a anestesia de isoflurano inalado reduz a frequência cardíaca, e, portanto, aumenta QT-intervalos. No entanto, a amplitude de ondas T de recuperação permanece inalterado 18.
As referidas alterações podem ser analisados quantitativamente em termos de tensão. A Figura 6 mostra que a exportação de dados fisiológicos como um ficheiro.csv irá fornecer uma quantidade muito grande de dados. Além de oferecer valores de ECG (amplitudes) a taxas de fracções de milissegundos pode haver opções para incluir outros dados de respirações, sondas de temperatura, medidores de pressão arterial etc., se assim o desejar. Estes dados quantitativos pode ser representada graficamente como apresentado na Figura 7. Representação gráfica de uma série de formas de onda a partir de P-ondas a onda P ajuda a visualizar um ECGtendência de configuração. O período de tempo de 500 ms é um prazo bom para visualizar uma vez que qualquer menos tempo pode não resultar em formas de ondas suficientes e de qualquer tempo adicional fará com que o gráfico aparecer eventos desordenados e eletrofisiológicos podem ser perdidas ou de difícil reconhecer quando visualizado em um monitor de computador padrão .
Figura 1:. Posicionamento correto do mouse no ECG do rato Este rato é posicionado em decúbito dorsal. Cada uma das patas do rato são gravadas para os eletrodos correspondentes no teclado de superfície ECG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: linha de base normal de murinoECG de forma de onda. O ECG de base murino normal é marcado com as letras P, Q, R, S, J e T que são usados para descrever eventos elétricos no coração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Elevação da onda T também conhecido como T-wave hyperacute ou pico. A onda T é amplificado e maior do que a linha de base da onda T (Figura 2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Elevação do segmento ST Esta figura displays elevação do segmento ST, que pode ser observado como o segmento ST é maior do que o ponto isoelétrico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Alterações ECG típicas ao longo de uma cirurgia / isquemia-reperfusão Esta figura segue um mouse sobre a duração da operação de isquemia / reperfusão do miocárdio. A primeira forma de onda apresenta um ritmo sinusal normal que foi gravada a linha de base (linha de base). A segunda forma de onda (1 min de isquemia) apresenta a forma de onda de 1 min, após a ligadura foi amarrado e a artéria tornou-se ocluído. O círculo vermelho nesta linha mostra o pico da onda T hyperacute. O círculo vermelho no terceiro forma de onda (5 min de isquemia) exibe a elevação do segmento ST completa. O círculo vermelho no fou rth forma de onda (20 min de isquemia) apresenta um alargado intervalo QT e a onda S ainda é elevado. O círculo vermelho no quinto forma de onda (45 min de isquemia) mostra alargado QT-segmento e elevada do segmento ST. A sexta forma de onda (1 min de reperfusão) apresenta alterações significativas em comparação com 45 min ischemia.The círculo vermelho no sétimo forma de onda (5 min de reperfusão) apresenta forma de onda Q profunda, significativa. O primeiro círculo vermelho na oitava forma de onda (30 min de reperfusão) mostra ondas Q significativas, enquanto o segundo círculo vermelho mostra realce possível onda T. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6:. Dados fisiológicos Esta figura mostra os dados fisiológicos como ele é exportado como arquivo .csv para planilhas.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54814/54814fig6large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7:. Sobrepostos valores mV O gráfico apresentado nesta figura mostra os valores mV a partir de três formas de onda consecutivos e completa utilizando o ficheiro de dados fisiológico (Figura 6). O gráfico é um gráfico de linha simples usando pontos do arquivo de dados fisiológico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando alterações no ECG como um método complementar para confirmar isquemia do miocárdio e reperfusão assegura o posicionamento preciso da ligadura oclusão. Precisão da colocação da ligadura é fundamental para a redução da variabilidade dos dados entre os animais. O LAD em um coração de rato é uma artéria difíceis de visualizar. Portanto, completando palidez visual, com alterações eletrocardiográficas vai ajudar a garantir o correto posicionamento do dano tecidual ligadura e resultante.
Uma vez que a almofada de ECG permite uma visão não-invasiva do coração, ECGs múltiplos pode ser obtido durante o decorrer do estudo. Isto pode ajudar a fornecer uma melhor compreensão das alterações cardíacas que ocorrem durante e depois da cirurgia. É crítico para se obter uma linha de base do ECG a ser usado para comparação após o procedimento cirúrgico. Mais tarde, a morte do tecido palco e até mesmo aneurisma ventricular pode ser observado por desvios de sinais eletrofisiológicos e alterações de configuração do ECG. Isto pode fornecer uma visãopara a progressão da insuficiência cardíaca.
As vantagens de utilizar a medição de ECG máquina ecocardiográfica incluem a medição simultânea de parâmetros estruturais e funcionais do coração antes ou após a cirurgia da isquemia / reperfusão. As limitações do sistema de registro de ECG incluem o alto custo de comprar uma máquina de ecocardiografia. No entanto, se os experimentos requerem monitoramento ECG constante ao longo de vários dias, há uma variedade de aparelhos disponíveis para gravação de ECG, incluindo unidades de ECG telemetria remotos com software que pode ser programado para registrar e analisar formas de onda em vários intervalos de tempo correspondente. No entanto, muitas das unidades ECG telemetria requerem um procedimento de implante ou habitats especializados. Além disso, existem muitas opções de eléctrodos alterative incluindo clipes e eléctrodos de agulhas. Isquemia cirurgia / reperfusão via toracotomia é um procedimento altamente invasivo. Vantagens de se utilizar o teclado de ECG com um mac ecocardiografiaHine incluem procedimento não-invasivo, sem fios conectados ao animal durante a cirurgia e nenhum procedimento cirúrgico extra. No entanto, os investigadores devem determinar o melhor equipamento para o seu laboratório e necessidades experimentais.
Como mencionado anteriormente, a anestesia de isoflurano diminui a frequência cardíaca. Além disso, pode ser isoflurano cardioprotector através da activação de canais de K ATP e, portanto, reduzir o tamanho do enfarte, como foi encontrado em cães 19. A anestesia geral em ratos pode ser induzida utilizando agentes injetáveis. anestesia inalatória prevê maior segurança, particularmente para procedimentos prolongados. No entanto, anestesia inalatória requer equipamentos complexos e caros, como vaporizadores de precisão e medidores de vazão, sistemas de respiração específicos e sistemas de exaustão eficientes para prevenir a poluição. As desvantagens dos anestésicos injectáveis incluem dificuldade na escolha de uma dose inicial, sem possibilidade de modular com precisão a profundidade de ane prolongadasthesia, recuperação prolongada, etc. A escolha da anestesia devem ser adaptadas de acordo com a duração do processo e objetivo do estudo 20.
Usando ECG como um método complementar para confirmar a lesão de isquemia / reperfusão em ratos vai ajudar a melhorar a consistência e reprodutibilidade dos infartos, mas também abre a possibilidade para futuras aplicações da técnica, através da identificação das tendências quantitativas. Os investigadores podem notar Configurações de ECG semelhantes dentro de certos grupos experimentais. Por exemplo, um grupo de animais geneticamente modificados podem apresentar intervalos QT-anormalmente grande após a cirurgia, quando comparado com o tipo selvagem. Estes dados informativos teria sido perdida se os investigadores usam as alterações de cor do miocárdio como uma única confirmação de isquemia e reperfusão. Para estudos comparativos entre o tipo selvagem e ratinhos transgénicos, as considerações às orientações Convenções de Lambeth também pode ser valioso, especialmente em relação à idade, sexo, Cegando e randomização dos animais 21.
Em conclusão, a confirmação suplementar de lesão de isquemia / reperfusão do miocárdio oferece vários benefícios. Usando ECG como uma técnica suplementar pode ajudar a estabelecer a consistência na cirurgia. Isto pode ajudar a diminuir o número de animais utilizados, ao mesmo tempo que fornece os dados de maior qualidade. Também permite que os investigadores para monitorar a lesão cardíaca, morte do tecido e / ou remodelação de forma não invasiva ao longo do tempo. Por último, usando ECG como uma confirmação de miocárdio isquemia / reperfusão oferece a possibilidade de estabelecer tendências eletrofisiológicos quantitativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 1100 | Fujifilm Visual Sonics |
Echocardiography Machine | |
| Mouse Handling Plate | Fujifilm Visual Sonics |
Heated ECG plate | |
| Signa-Gel | Highly Conductive Multi- | ||
| Electrode Gel | Parker | 15-25 | Purpose Electrolyte |
| Transpore Medical Tape | 3M | 1527-0 | |
| PI-Spray II | Pharmaceutical Innovations | NDC 36-2013-25 | Cleaning agent for ECG plate |
| C57Bl6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, 8 - 12 wk |
| IsoThesia-Isoflurane | Henry Schein | NDC 1169-0500-1 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment | Alcon | 65050935 | |
| 7-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | 640.O32 | |
| 5-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | K809.O32 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ | RS-5881 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Gauze | Bio Nuclear Diagnostics Inc | DIS-022B | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Buprenex CIII | Patterson Veterinary | 0-891-9756 | Buprenorphine Hydrochloride Analgesic |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-08 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | NRSL-22339-05 |
References
- Kochanek, K. D., Murphy, S. L., Xu, J. Deaths: Final Data for 2011. Natl Vital Stat Rep. 63 (3), 1-120 (2015).
- World Health Organization. The 10 leading causes of death in the world. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2012).
- Klabunde, R. E. Cardiovascular Physiology Concepts 2edn. , Wolters Kluwer Health Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 243 (2012).
- Bhardwaj, R., Kandoria, A., Sharma, R. Myocardial infarction in young adults-risk factors and pattern of coronary artery involvement. Niger Med J. 55 (1), 44-47 (2014).
- Xu, Z., Alloush, J., Beck, E., Weisleder, N. A murine model of myocardial ischemia-reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery. J Vis Exp. (86), (2014).
- Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. J Anat. 212 (1), 12-18 (2008).
- Thaler, M. S. The Only EKG Book You'll Ever Need. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. 4 edn (2003).
- Poirier, P. Exercise, heart rate variability, and longevity: the cocoon mystery? Circulation. 129 (21), 2085-2087 (2014).
- Boudoulas, K. D., Borer, J. S., Boudoulas, H. Heart Rate, Life Expectancy and the Cardiovascular System: Therapeutic Considerations. Cardiology. 132 (4), 199-212 (2015).
- Wehrens, X. H., Kirchhoff, S., Doevendans, P. A. Mouse electrocardiography: an interval of thirty years. Cardiovasc Res. 45 (1), 231-237 (2000).
- Boukens, B. J., Rivaud, M. R., Rentschler, S., Coronel, R. Misinterpretation of the mouse ECG: 'musing the waves of Mus musculus. J Physiol. 592 (21), 4613-4626 (2014).
- O'Gara, P. T., et al. ACCF/AHA guideline for the management of ST-elevation myocardial infarction: executive summary: a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines: developed in collaboration with the American College of Emergency Physicians and Society for Cardiovascular Angiography and Interventions. Catheter Cardiovasc Interv. 82 (1), E1-E27 (2013).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press. Washington DC. 8 edn (2011).
- Gao, S., Ho, D., Vatner, D. E., Vatner, S. F. Echocardiography in Mice. Curr Protoc Mouse Biol. 1, 71-83 (2011).
- Jong, W. M., et al. Reduced acute myocardial ischemia-reperfusion injury in IL-6-deficient mice employing a closed-chest model. Inflamm Res. 65 (6), 489-499 (2016).
- Nadtochiy, S. M., et al. In vivo cardioprotection by S-nitroso-2-mercaptopropionyl glycine. J Mol Cell Cardiol. 46 (6), 960-968 (2009).
- Preda, M. B., Burlacu, A. Electrocardiography as a tool for validating myocardial ischemia-reperfusion procedures in mice. Comp Med. 60 (6), 443-447 (2010).
- Speerschneider, T., Thomsen, M. B. Physiology and analysis of the electrocardiographic T wave in mice. Acta Physiol (Oxf. 209 (4), 262-271 (2013).
- Kersten, J. R., Schmeling, T. J., Pagel, P. S., Gross, G. J., Warltier, D. C. Isoflurane mimics ischemic preconditioning via activation of K(ATP) channels: reduction of myocardial infarct size with an acute memory phase. Anesthesiology. 87 (2), 361-370 (1997).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR J. 53 (1), E55-E69 (2012).
- Curtis, M. J., et al. The Lambeth Conventions (II): guidelines for the study of animal and human ventricular and supraventricular arrhythmias. Pharmacol Ther. 139 (2), 213-248 (2013).
