Introduction
Las enfermedades del corazón siguen siendo la causa principal de muerte en todo el mundo 1,2. No sólo es el ventrículo izquierdo (LV) de la cámara de más muscular, responsable de bombear sangre desde el corazón a todo el cuerpo 3, es un sitio común la lesión cardiaca post-infarto de miocardio 4. la muerte del tejido del ventrículo izquierdo a menudo resulta en insuficiencia cardíaca sistólica. Los modelos animales de enfermedades del corazón son imprescindibles para el avance de la investigación biomédica cardiovascular. La cepa C57BL / 6 ratones de haber sido una opción popular para los modelos animales debido a su tiempo de reproducción rápida, de bajo costo y facilidad de alteraciones genéticas. La mayoría de los modelos murinos quirúrgicos para el estudio de las enfermedades del corazón implican la oclusión de la rama LAD de la arteria coronaria izquierda. El LAD a veces se llama la izquierda obtusa marginal 5,6. El LAD suministra sangre a la cara anterior del ventrículo izquierdo y paredes anterolateral. Los estudios de oclusión LAD están dirigidas a inducir infartos anteriores, a veces se extiende into las zonas de la pared inferior y lateral 7.
Dos modelos que se utilizan con frecuencia para estudios de infarto de miocardio incluyen infarto de miocardio oclusión crónica y daño por isquemia / reperfusión miocárdica. La oclusión crónica se crea mediante sutura quirúrgica alrededor y bloquear permanentemente el flujo de sangre a través de la LAD. La lesión de isquemia / reperfusión se crea mucho de la misma manera solamente con un transitorio, por lo general 30 a 60 min, período de isquemia. Para lograr la isquemia transitoria, los lazos de oclusión de sutura alrededor de la LAD y un pequeño tubo de PE-10 que se coloca paralela a la LAD sobre la superficie epicárdica del corazón, seguido de un período de reperfusión, donde se retira el tubo y sutura oclusiva y la sangre es dejó fluir una vez más a través de la arteria y en el miocardio. La cirugía de isquemia / reperfusión se ha considerado que sea clínicamente relevante debido a la naturaleza de la lesión por reperfusión en paralelo el tratamiento de infartos de humanos que incluye promangioplastia y colocación de stent coronario pt de la arteria, o cirugía de revascularización coronaria. Típicamente, durante estas cirugías, isquemia del VI en un corazón de ratón se confirma por la palidez visible de la pared miocárdica. Sin embargo, simplemente realizando las cirugías en una almohadilla de electrocardiograma (ECG) en condiciones de control constantes, cambios visibles se pueden observar en la forma de onda ECG, lo que confirma la isquemia y reperfusión del miocardio ratón.
Aunque el corazón murino es similar al corazón humano, en muchos aspectos, incluyendo su estructura de cuatro cámaras, los corazones también tienen diferencias. Una diferencia obvia es la frecuencia cardíaca en reposo promedio de ratones adultos es de 600 - 700 latidos por minuto (lpm), mientras que la de los humanos adultos se muestran ~ 60-100 lpm 8,9. Además, en los ratones las olas de la repolarización, J y T, a menudo se confunden con las ondas QRS despolarización hacer un segmento ST clara difícil discernir 10. Para complicar el proceso de electrocardiographically confirmando la isquemia miocárdica, es la elevación de la onda T y del segmento ST que se utilizan como marcadores para el diagnóstico de la isquemia y lesión por infarto de miocardio en los seres humanos, en lo clínicamente como ST e levation m yocardial i nfarction o STEMI. Una de las principales diferencias entre las formas de onda humanos y murinos es que la onda S es seguida inmediatamente ser una onda J que transfiere directamente a una onda T negativa. Durante la isquemia miocárdica aguda en ratones disminuye la amplitud de la onda S y es seguido directamente por un J-onda anormal y una onda T invertida 11. La onda T no parece representar una parte significativa de la repolarización en ratones 11. A pesar de la nomenclatura y de ratón frente a las diferencias humanas, la confirmación ECG de la isquemia miocárdica y la reperfusión murino es todavía viable y relativamente simple. En aras de la simplificación de interpretación de forma de onda, el segmento entre el SJT se conoce como ST-SEGMnt en este documento.
Directrices STEMI publicados en 2013 recomiendan un tiempo de paciente-puerta-balón de menos de 90 min 12 .Este significa que el marco de tiempo de la identificación de oclusión de la arteria coronaria del paciente hasta que la arteria se vuelva a abrir debe ser inferior a 90 min. El corazón que late está trabajando constantemente y por lo tanto, tiene un alto metabolismo oxidativo y un alto nivel de consumo de oxígeno 3. Para prever esto, en una red de capilares está disponible para cada uno de los miocitos 3. Sólo se necesita un corazón un par de compases para agotar su oxígeno y nutrientes. En una ventana de 90 minutos, una región isquémica del corazón en un ser humano habrá sido bloqueado para recibir entre 5.400 y 9.000 corazón late valor de la sangre rica en oxígeno. En esa misma ventana de 90 minutos, un ratón tendría 54.000 a 63.000 latidos del corazón. puntos de tiempo experimentales para la lesión por isquemia / reperfusión murino son típicamente entre 30 y 60 min.
La importancia de desarrollaring un método suplementario de confirmar la isquemia miocárdica y la reperfusión en un modelo murino tiene profundas implicaciones en la consistencia y reproducibilidad de los datos en los estudios de isquemia / reperfusión miocárdica. La práctica actual de observar visualmente el corazón de un cambio de color de los tejidos no es adecuada como independiente de diagnóstico. Además, la reperfusión después de la eliminación de la tubería y la sutura no está garantizada. A pesar de la arteria ya no se liga, la arteria puede tener daño sostenido durante el procedimiento y puede llegar a ser imposible reperfundir. Sería beneficioso tener un registro de los cambios electrocardiográficos para confirmar la reperfusión en lugar de confiar en las observaciones de la palidez del miocardio y rubor (color rojo). Corazones que no muestran los marcadores de lesión por isquemia / reperfusión pueden ser marcados a continuación, de forma rápida y una decisión sobre la forma de proceder se pueden hacer por los investigadores.
Por último, el establecimiento de un registro de ECG cambios desde el inicio en toda THe períodos de isquemia y reperfusión permite a los investigadores continúan vigilando el corazón después de la cirugía inicial. Los investigadores actualmente pierden de vista el corazón tan pronto como se haya completado la operación. El ECG es una forma sencilla de obtener una perspectiva de los cambios que ocurren en las horas de miocardio días después de la cirugía. ECG grabado en los puntos de tiempo después de la cirugía podría revelar ondas Q de desarrollo tardío que indica continuaron o empeoramiento de la muerte del tejido. Sin embargo, para calibrar de manera efectiva marcadores nuevos o que empeoran electrocardiográficos, un ECG basal debe estar disponible para la comparación.
Este protocolo demostrará cómo preparar, obtener e interpretar el ECG para confirmar la isquemia y reperfusión del corazón de ratón usando 8 - 12 semanas de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones.
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Protocol
Todos los procedimientos quirúrgicos realizados en animales deben llevarse a cabo de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio 13 u otras directrices éticas apropiadas. Los protocolos deben ser aprobados por el comité de bienestar de los animales en la institución apropiada antes de continuar.
1. Preparación para el ECG
NOTA: Antes de comenzar, se pongan el equipo de protección personal, incluyendo guantes, gafas y bata de laboratorio limpia o bata desechable.
- Limpie la almohadilla de ECG utilizando un no-alcohol y solución de descontaminación no basado en lejía. utilizar suavemente una tarea delicada limpie para secar el exceso de solución para garantizar que la almohadilla de electrodo no se dañe.
- Si la almohadilla de ECG tiene una función de calefacción, lo utilizan. ratones anestesiados tienden a perder calor corporal rápidamente. Calentar la almohadilla a 40-42 ° C para mantener la temperatura corporal normotérmica de 37 ° C durante toda la cirugía 14. Monitorear los estribos cuerpoATURALEZA usando un termómetro rectal. Ajustar la temperatura de la almohadilla como sea necesario para mantener la temperatura del cuerpo ~ 37 ° C.
- Como la mayoría de las toracotomías se realizan con el ratón está acostado boca arriba (decúbito supino), asegúrese de que la palanca se gira al ajuste "supina". Muchas almohadillas de ECG tienen una función para alternar entre las posiciones prona y supina. Si no se selecciona la orientación adecuada puede dar lugar a la tergiversación de eventos electrocardiográficos.
- Anestesie ratón usando 5% de isoflurano inhalado y 1 L / min de oxígeno. Una vez se anestesia el ratón, la transferencia de ratón para la almohadilla de ECG equipado con una anestesia nariz de cono y reducir isoflurano al 2% y 1 L / min de oxígeno. Confirmar la anestesia adecuada, garantizando ratón no reacciona cuando el pie del ratón se pellizca con unas pinzas.
- Aplicar una capa fina de pomada de la lubricación del ojo sobre los ojos del ratón para evitar la sequedad y el daño de la córnea, mientras anestesiado.
- Limpiar las patas del ratón con un paño húmedo para eliminar todas las camas visiblesque pudieran estar pegadas a las patas o pueden interferir con la transmisión de los impulsos eléctricos de las patas a la almohadilla de ECG. patas secas con una toallita.
- Aplicar una pequeña cantidad (un poco más pequeña que una moneda de diez centavos USD) de gel de electrolito altamente conductor a cada uno de los cuatro electrodos metálicos sobre la almohadilla de ECG.
Nota: Asegúrese de que sólo se aplican una pequeña cantidad de gel como demasiado gel hace que sea difícil de frenar las patas a la plataforma usando cinta. Además, las patas son propensos a deslizarse fuera del dispositivo de sujeción durante la cirugía si fueran húmedo antes de aplicar la cinta. - Con el ratón en la posición supina, usar cinta médica clara para contener cada pata a su correspondiente electrodo (Figura 1). Primero pulse cada pata a su pedazo de cinta adhesiva y luego se adhieren a la cinta de la almohadilla de ECG. Asegúrese de que cada pata contenida está en contacto con el gel de electrolito y el electrodo.
2. La adquisición del ECG
- Dependiendo del equipo utilizado para la adquisición del ECG, confIGURA la máquina de modo que la forma de onda de ECG se puede visualizar en tiempo real. Para los registros de ECG utilizando los ajustes de monitorización fisiológica en una máquina de ecocardiografía, una imagen en modo B en vivo tendrá la forma de onda de ECG corriendo a lo largo de la parte inferior de la pantalla.
Nota: Consulte las guías de usuario de la máquina individuales para determinar la mejor manera de configurar ese equipo. - Permitir la visualización en tiempo real de forma de onda de ECG pulsando la tecla en modo B en una máquina de ecocardiografía o el equivalente en otros dispositivos de grabación de ECG.
- Ajustar la resolución para dar cuenta de las diferencias en amplitud. Si el pico de la onda R o la cubeta (valle) de la onda Q están fuera del marco visual, ajustar la resolución hasta que se puede observar toda la altura de la forma de onda.
Nota: Esto se puede hacer bajo la pestaña de configuración fisiológicas en una máquina de ecocardiografía. Haga clic en el aumento o disminución de las flechas hasta que toda la forma de onda es visible.
- Ajustar la resolución para dar cuenta de las diferencias en amplitud. Si el pico de la onda R o la cubeta (valle) de la onda Q están fuera del marco visual, ajustar la resolución hasta que se puede observar toda la altura de la forma de onda.
- En cualquier momento en que una imagen es ser obtained, limpiar la almohadilla de ECG de herramientas. Tocar el ratón durante la grabación de ECG con unas pinzas o los dedos se perturbe la forma de onda. Asegúrese de que el ratón está todavía intacta y en la plataforma de ECG antes de grabar ECG.
- Use "registro" de la máquina o característica "tienda" antes de hacer ninguna incisión quirúrgica en el ratón. Esta imagen se utilizará como base de referencia para la comparación más adelante.
3. Procedimiento Quirúrgico y grabación de ECG
- Inyectar ratón anestesiado con analgésicos (buprenorfina, 1,5 mg, por vía intraperitoneal) antes de comenzar. Los detalles de la isquemia / reperfusión procedimiento quirúrgico también se pueden encontrar en otro lugar 5.
- Eliminar el vello alrededor del sitio quirúrgico química o mecánicamente y desinfectar la zona con una solución de betadine. Utilice un bisturí para realizar una incisión vertical paralelo al esófago y la tráquea. mover suavemente los ganglios linfáticos a cada lado de la incisión hasta que el tejido delgada que cubre la tráquea esexpuesto. Con unas pinzas, separar suavemente el tejido hasta que los anillos de cartílago blancas de la tráquea son visibles.
Nota: Generalmente usamos loción Nair eliminación del vello. La loción se aplica en el sitio quirúrgico para ~ 1 min. a continuación, Nair se lava a fondo fuera utilizando solución salina o agua. Este método se prefiere en nuestro laboratorio porque alta resolución ecocardiografía (que puede detectar los folículos pilosos) se realiza antes y después de la cirugía. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar las zonas sensibles, como los genitales, y luego lavar a fondo el Nair fuera para evitar posibles quemaduras en la piel. - eliminar rápidamente la nariz del ratón de la nariz de cono e insertar los tubos de ventilación en la boca del ratón y hacia la garganta. Cuando la punta de la tubería de ventilación es visible a través de la zona del cuello expuesta, alinear el tubo con el inicio de la tráquea. Suavemente mueva el lado del tubo a lado mientras se aplica presión al alza hasta los toboganes de tubo en la tráquea que se puede confirmar visualmente tediante la tráquea translúcido.
- Asegúrese de que el ratón permanece anestesiado durante el procedimiento de intubación. Pausa de la intubación y devolver el ratón a la ojiva si comienza a moverse.
- El uso de un lazo de cuerda, enganchar dos dientes delanteros del ratón a través del lazo y la cinta de la cadena termina a la plataforma de ECG para estabilizar la cabeza del ratón y para asegurar el tubo de ventilación no se mueve durante la cirugía. adjuntar rápidamente tubos de ventilación para ventilador de roedores y ajustar la configuración de ventilación de acuerdo con el peso del ratón. Cinta de la tubería de ventilación en su lugar.
- Cubrir la tráquea expuesta del ratón con una gasa empapada en solución salina caliente para mantener el tejido de la desecación.
- Hacer una incisión vertical utilizando un bisturí a lo largo del lado izquierdo del esternón.
- El uso de pinzas, suavemente separar la capa de fascia de la capa muscular. Corte con cuidado las capas musculares subyacentes sin cortar vasos sanguíneos visibles.
- Con unas pinzas, tomar la tercera costilla y tirarhacia arriba con suavidad. Mantener el agarre en la costilla con una mano y usar tijeras quirúrgicas para cortar cuidadosamente el tejido intercostal entre la tercera y la cuarta costilla. Asegúrese de que los pulmones no están dañados.
Nota: Los pulmones se retraerán profundamente en la cavidad del pecho casi inmediatamente después de la cavidad del pecho se perfora por la incisión quirúrgica debido a la pérdida del gradiente de presión. Espere hasta que los pulmones se han retraído antes de continuar. - El uso de fórceps para agarrar y suavemente separar la capa delgada de pericardio que rodea el corazón.
- Inserte retractores o utilizar manualmente fórceps como retractores de costilla para mover las costillas en una posición en la que el corazón es visible entre las costillas.
Nota: Es una práctica común para mover la pata inferior izquierda del ratón para que se coloque por encima de la pata inferior derecha durante la colocación de la ligadura. Esto ayuda a posicionar el corazón para que el apéndice auricular izquierdo, o aurícula, es fácilmente visible durante la colocación de la ligadura. Tenga en cuenta que el ECG válida waveforms no se obtendrán mientras que la pata inferior izquierda está fuera del electrodo. Por esta razón, es aconsejable volver la pata a su electrodo después de la ligadura de sutura se pasa a través del tejido miocárdico pero antes de un nudo se aprieta. - Busque la LAD visualmente, por debajo de la aurícula izquierda. Rápidamente insertar una aguja de sutura de seda 7-0 cónico en el miocardio lo suficiente como para pasar por debajo de la DA, pero no tan profundo como para penetrar en la cavidad del ventrículo izquierdo. Tire de la ligadura de sutura a través hasta que hay unos 4 cm de seda de sutura a la izquierda en el extremo libre (no agujas) de la ligadura de sutura.
- Comenzar a atar un nudo simple sutura. Una vez que el extremo libre de la seda de sutura se ha tirado a través de los bucles para formar el nudo, pausa.
- La celebración de los dos extremos libres y agujas de sutura de seda con unas pinzas, inserte una sección ~ 1 cm de PE-10 tubos por debajo del nudo y la formación de la cima de la superficie del epicardio.
- Si se cruza la pata izquierda del ratón, devolver la pata a su favorpor electrodo. Apretar el nudo para que el tubo de PE-10 se sutura al corazón. Liberar todo contacto físico con el ratón para permitir ECG que desea grabar.
- Permitir que la forma de onda de ECG para desplazarse a través de ~ 10 seg. Compruebe visualmente la forma de onda de ECG y registro de forma de onda como "Tiempo de oclusión". Si la onda T no aumenta en amplitud dentro de 1 min, reevaluar colocación de ligadura.
- Si la amplitud de la onda T no aumenta, o bien descartar el animal del estudio o el intento de corregir la colocación ligadura.
- comprobar visualmente el color del miocardio isquémico confirmar palidez de la LV.
- Si los cambios en el ECG y los cambios de color de miocardio indican isquemia, doble nudo de la sutura alrededor del tubo de PE-10.
- Cubra la cavidad del pecho abierto con una gasa salina caliente.
- Registro de ECG cada 5-10 min para la duración del período de isquemia.
4. Confirmación de la reperfusión Uso de ECG
- Retire solución salina cala de gasaanillo de la cavidad torácica y visualizar el corazón.
- Use una cuchilla para cortar la sutura de seda encima de la tubería de PE-10. Una vez que se corta la ligadura, eliminar la sección de tubo de PE-10 y retire con cuidado la ligadura de sutura del miocardio.
- Liberar todo contacto físico con el ratón y permitir que la forma de onda de ECG ~ 10 segundos para recorrer. forma de onda de registro como "momento de la reperfusión." Continuar registrando las ondas de ECG cada 5-10 minutos hasta que se alcance el punto deseado de tiempo experimental.
- Ajustar resolución de los cambios en la amplitud, según sea necesario. Si la onda T no cambia después de la retirada del tubo de PE-10 y la ligadura, la reperfusión no se confirma.
- Si la onda T no cambia tras la retirada del tubo, o bien descartar el animal del estudio o el intento de corregir la colocación ligadura.
- Realice una inspección visual para confirmar miocardio, además de reperfusión por el retorno al color rojo.
- Cerrar pecho cavidad suturando el espacio intercostal con un 5-0sutura de seda mientras se aplica una presión suave al pecho del ratón para expulsar el exceso de aire que ha entrado durante la cirugía. A continuación, la sutura de las capas musculares y finalmente, la piel. Nota: La aplicación de presión a la cavidad del pecho puede no ser suficiente para evacuar la cavidad del pecho de aire en todos los ratones. Por lo tanto, el método de la jeringa y la aguja de evacuación debe ser empleado para asegurar que todo el aire ha sido expulsado.
- Grabar el último ECG antes de girar la anestesia inhalada apagado y la eliminación de las patas del ratón de los electrodos. Aumentar el oxígeno a 2 L / min y mantener la ventilación hasta que el ratón de recuperar la consciencia.
- Permitir ratón para recuperar en un ambiente controlado de temperatura constante, por ejemplo, resistencia de calentamiento o incubadora caliente, para evitar la variabilidad del infarto. Tratar ratón con buprenorfina 24 horas después de la cirugía y después, según sea necesario, como se indica por la escala mueca ratón.
Nota: Procedimiento para la reperfusión también se discute en detalle por Xu et al 5.
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Representative Results
Un ECG normal de murino se muestra en la Figura 2 con los marcadores alfabéticos para eventos eléctricos P, Q, R, S, T. J y P es la despolarización auricular inicial. QRS es la onda de despolarización en los ventrículos. J es la repolarización temprana y T representa la repolarización heterogénea también conocida como la recuperación 11. Cabe señalar que muchos laboratorios no utilizan la nomenclatura de onda J y en lugar de referirse a la SJT-segmento que el segmento ST 10,15-17. A continuación, los resultados y los análisis son representativos y con sede fuera de las observaciones de laboratorio de 40 ratones. La mayoría de los ratones expuestos progresiones de formas de onda similares en el transcurso de la cirugía. Los ratones que no presentan formas de onda similares se encuentra en posición para su posterior análisis y se consideraron los animales no infartadas. Resultados de formas de onda similares también han sido reportados por Jong et al. 15.
corazones murinos Dodistinga de la isquemia regional debido a la oclusión LAD suelen mostrar una mayor amplitud de la onda R, así como un pico hiperagudo del segmento JT seguido de eventual elevación del segmento ST La figura 3 muestra la primera señal de la isquemia miocárdica aguda.; hiperagudo pico de la onda T. Como puede verse en esta figura, la onda T se ha incrementado en la amplitud de las condiciones de línea de base. Sin embargo, esto todavía no es elevación del segmento ST debido a que la onda S se sigue proyectando profunda y negativamente como lo hace en la forma de onda de referencia.
Configuración de línea de base del ECG muestra una onda S proyectar negativamente (Figura 2). A medida que pasa el tiempo, se observan cambios en el ECG. El segmento ST se define como el segmento entre el final de la onda S y el inicio de la onda T. Este segmento ST es evidente en los seres humanos. Debido a la alta tasa de corazón, este segmento se fusionó en ratones y una, la repolarización temprana "de la onda J" sep adicionalarates los S y T-ondas. Por lo tanto, la elevación de la onda S a la línea isoeléctrica o superior debe considerarse como la versión murina de elevación del segmento ST. En la figura 4 la progresión de la isquemia de miocardio a temprana puede ser visto por elevación del segmento ST. Aquí, la onda S está mostrando una amplitud elevada, por encima de la línea isoeléctrica. La onda J también es elevada, especialmente en comparación con la forma de onda de línea de base (Figura 2). Por lo tanto, el segmento ST está elevado que es indicativo de lesión / de miocardio 10.
Figura 5 sigue la progresión de un ratón desde la línea base hasta el final a través de la reperfusión. La primera forma de onda muestra un ritmo sinusal normal, que era la línea de base grabada. La segunda forma de onda muestra el ECG 1 min después de la ligadura fue atada y se convirtió en la arteria ocluida. El círculo rojo en esta línea indica en horas pico de la onda T hiperagudo. Si se compara with "línea de base", es evidente que la onda T es elevado. La tercera forma de onda muestra la elevación completa del segmento ST en el punto de tiempo de 5 min. En la imagen de "1 min de isquemia", la onda S se sigue proyectando negativamente, que pasa a la línea isoeléctrica. Sin embargo, a los 5 minutos de la parte S del complejo no llega tan lejos como debería negativo antes de progresar en los J- y ondas T. Esto se describe como elevación del segmento ST debido a que el segmento entre la S y las ondas T se eleva desde la línea isoeléctrica. Otro marcador electrofisiológico de la isquemia regional se está ampliando del intervalo QT 16 que se extiende desde el comienzo del complejo QRS y continúa hasta el final de la onda T. A los 20 minutos de isquemia, el intervalo QT se ha ensanchado y el segmento ST sigue siendo elevada. Después de 45 minutos de isquemia, los restos del intervalo QT se abrieron y el segmento ST permanece elevado.
Reperfusión del miocardio que tieneestado isquémico durante 30 minutos o menos debería resultar en el ECG de volver de nuevo a las condiciones de referencia en un ratón. Preda y Burlacu establecieron una correlación entre los cambios electrocardiográficos murinos, el tiempo de isquemia, y la gravedad del infarto 17. Se observó que los períodos de isquemia de 30 min no causaron cambios en el ECG permanentes mientras que los períodos de isquemia de 1 hora causaron cambios en el ECG permanentes. Además, la reperfusión de la arteria ocluida después de 24 horas de isquemia no tuvo ningún efecto salvamento 17. Normalmente, ondas Q pueden ser identificados como el ligero saliente hacia abajo justo antes de las despolarización QRS. Ondas Q significativas, o patológicos pueden desarrollar poco después del inicio de la isquemia miocárdica como una considerable muerte del músculo comienza a fijar en el 10. Ondas Q significativas se definen como al menos 1/3 de la altura de la onda R correspondiente, o por su tiempo alargado, lo que resulta en una gran onda Q. Los resultados significativos de una región de miocardio muertos electrica de desviación de la onda Ql corrientes de distancia desde el electrodo 7. Después de 5 minutos de la reperfusión, la evidencia de profundidad, ondas Q significativas comienzan a aparecer (Figura 5). Además, la onda T vuelve a la línea isoeléctrica (Figura 5). Después de 30 minutos de la reperfusión, las ondas Q negativos permanecen y es probable que muestran un daño permanente. En este punto del tiempo, las ondas Q son anchas y profundas, e indican que el tejido del corazón morir está desviando las corrientes eléctricas en los alrededores de la zona dañada (Figura 5).
Después de la isquemia continua, la progresión a lesiones y de miocardio conduce a la proyección de la onda T negativa mejorada (Figura 5, 30 min de reperfusión, segundo círculo rojo). Esta proyección de la onda T mejorado debido a un cierto miocardio suele ser permanente 7. El segundo círculo rojo en la forma de onda de la reperfusión de 30 minutos muestra lo que parece ser una onda T invertida (Figura 5). Si el 5 unand 30 min ondas T se comparan está claro que la onda T está proyectando de manera más negativa. Esto, junto con las ondas Q significativas proporciona evidencia de daño tisular permanente a este corazón. Cabe señalar que la anestesia isoflurano inhalado reduce la frecuencia cardíaca, y por lo tanto aumenta QT-intervalos. Sin embargo, la amplitud de la recuperación de las ondas T 18 no se ve afectado.
Los cambios antes mencionados, se pueden analizar cuantitativamente en términos de voltaje. La figura 6 muestra que la exportación de los datos fisiológicos como un archivo .csv proporcionará una gran cantidad de datos. Además de ofrecer valores de ECG (amplitudes) a tasas de fracciones de milisegundos que puede haber opciones para incluir otros datos de respiraciones, sondas de temperatura, manguitos de presión de sangre, etc, si así se desea. Estos datos cuantitativos se pueden representar gráficamente como se muestra en la Figura 7. Representación gráfica de una serie de formas de onda de la onda P a la onda P ayuda a visualizar un ECGtendencia de configuración. El período de tiempo de 500 ms es un marco de tiempo bueno para visualizar desde cualquier menos tiempo puede no resultar suficientes formas de onda y tiempo adicional hará que la gráfica aparecerá eventos desordenados y electrofisiológicos pueden pasarse por alto o difícil de reconocer cuando se ve en un monitor de ordenador estándar .
Figura 1:. La colocación correcta del ratón en el ECG Pad Este ratón se coloca en posición supina. Cada una de las patas del ratón se pegan a los electrodos correspondientes de la almohadilla de ECG de superficie. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Largo murino línea de baseECG de forma de onda. El ECG basal normal de murino se marca con las letras P, Q, R, S, T y J que se utilizan para describir los eventos eléctricos en el corazón. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La elevación de la onda T también conocido como hiperagudo de la onda T o en horas pico. La onda T es amplificada y superior a la línea de base de la onda T (Figura 2). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:. Elevación del segmento ST Esta cifra Mostrays elevación del segmento ST que se puede observar como el del segmento ST es mayor que el punto isoeléctrico. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:. Los cambios ECG típicos en el transcurso de una Cirugía / reperfusión isquemia Esta cifra sigue uno del ratón sobre la duración de la cirugía por isquemia / reperfusión miocárdica. La primera forma de onda muestra un ritmo sinusal normal, que fue grabada la línea de base (línea de base). La segunda forma de onda (1 min de isquemia) muestra la forma de onda de 1 min después de la ligadura fue atada y se convirtió en la arteria ocluida. El círculo rojo en esta línea muestra un pico de la onda T hiperagudo. El círculo rojo en la tercera forma de onda (5 min de isquemia) muestra la elevación completa del segmento ST. El círculo rojo en el fou El CRT de forma de onda (20 min de isquemia) muestra una ensanchado intervalo QT y la onda S sigue siendo elevada. El círculo rojo en la quinta forma de onda (45 min) Isquemia muestra se amplió QT-segmento y elevado del segmento ST. La sexta forma de onda (1 min de reperfusión) no muestra cambios significativos en comparación con 45 minutos ischemia.The círculo rojo en la séptima forma de onda (5 min de reperfusión) muestra la forma de onda Q profunda, significativa. El primer círculo rojo en la octava forma de onda (30 min de reperfusión) muestra ondas Q significativas, mientras que el segundo círculo rojo muestra la mejora posible de la onda T. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6:. Los datos fisiológicos Esta figura muestra los datos fisiológicos, ya que se exporta como archivo .csv a hoja de cálculo.ref = objetivo "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54814/54814fig6large.jpg" = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. Graficados Valores mV El gráfico que se muestra en esta figura se muestran los valores de mV de tres formas de onda consecutivos y completos utilizando el archivo de datos fisiológicos (Figura 6). El gráfico es un gráfico lineal simple usando puntos del archivo de datos fisiológicos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de cambios en el ECG como un método complementario para la confirmación de la isquemia miocárdica y la reperfusión asegura la colocación precisa de la ligadura de oclusión. La exactitud de la colocación de ligadura es fundamental para reducir la variabilidad de los datos entre los animales. El LAD en un corazón de ratón es una arteria difícil de visualizar. Por lo tanto, que complementa palidez visual con cambios electrocardiográficos ayudará a asegurar la colocación correcta del daño a los tejidos y ligadura resultante.
Desde la almohadilla ECG ofrece una vista no invasiva del corazón, múltiples ECG se pueden obtener durante el curso del estudio. Esto puede ayudar a proporcionar una mejor comprensión de los cambios cardíacos que se producen durante y después de la cirugía. Es fundamental para obtener un ECG basal de utilizar para la comparación después del procedimiento quirúrgico. la muerte del tejido etapa posterior y aneurisma ventricular incluso pueden ser observados por las desviaciones de señales electrofisiológicas y cambios de configuración del ECG. Esto puede dar una ideaen la progresión de la insuficiencia cardíaca.
Las ventajas de la medición de ECG que usa la máquina ecocardiográfico incluyen la medición simultánea de los parámetros estructurales y funcionales del corazón, antes o después de la cirugía de la isquemia / reperfusión. Las limitaciones del sistema de registro de ECG incluyen el alto costo de comprar una máquina de ecocardiografía. Sin embargo, si los experimentos requieren la monitorización del ECG constante durante varios días, hay una gran variedad de aparatos disponibles para la grabación de ECG, incluyendo unidades de ECG telemétricos remotas con software que puede ser programado para registrar y analizar formas de onda en diversos intervalos de tiempo correspondiente. Sin embargo, muchas de las unidades de telemetría ECG requieren un procedimiento de implantación o hábitats especializados. Además, existen muchas opciones de electrodos alterativas incluyendo clips para electrodos y agujas. cirugía / isquemia reperfusión a través de toracotomía es un procedimiento muy invasivo. Las ventajas de usar el teclado de ECG con un mac ecocardiografíaHine incluyen procedimiento no invasivo, sin cables conectados al animal durante la cirugía y ningún procedimiento quirúrgico adicional. Sin embargo, los investigadores deben determinar el mejor equipo para su laboratorio y necesidades experimentales.
Como se mencionó anteriormente, la anestesia con isoflurano disminuye la frecuencia cardíaca. Además, isoflurano puede ser cardioprotector través de la activación de canales K ATP y por lo tanto reducir el tamaño del infarto, como se ha encontrado en los perros 19. La anestesia general en los ratones puede ser inducida utilizando agentes inyectables. La anestesia por inhalación proporciona una mayor seguridad, en particular para los procedimientos de larga duración. Sin embargo, la anestesia de inhalación requiere un equipo complejo y costoso como los vaporizadores de precisión y medidores de flujo, sistemas de respiración específicos, y los sistemas de extracción eficaces para prevenir la contaminación. Las desventajas de los anestésicos inyectables incluyen dificultad en la elección de una dosis inicial, no hay posibilidad de modular con precisión la profundidad de ane prolongadasthesia, recuperación prolongada, etc. La elección de la anestesia debe ser adaptado de acuerdo a la duración del procedimiento y el objetivo del estudio 20.
El uso de ECG como un método complementario para la confirmación de la lesión por isquemia / reperfusión en ratones ayudará a mejorar la consistencia y reproducibilidad de los infartos sino que también abre la posibilidad para futuras aplicaciones de la técnica mediante el establecimiento de tendencias cuantitativas. Los investigadores pueden observar las configuraciones de ECG similares dentro de ciertos grupos experimentales. Por ejemplo, un grupo de animales modificados genéticamente puede exhibir inusualmente amplio QT-intervalos después de la cirugía en comparación con el tipo salvaje. Estos datos informativos se habría perdido si los investigadores utilizan los cambios de color de miocardio como una única confirmación de la isquemia y la reperfusión. Para los estudios comparativos de la cepa salvaje y ratones transgénicos, las consideraciones a las directrices Convenciones Lambeth también pueden ser valiosos, especialmente con respecto a la edad, el sexo, El cegamiento y la asignación al azar de los animales 21.
En conclusión, la confirmación adicional de la lesión por isquemia / reperfusión miocárdica ofrece múltiples beneficios. El uso de ECG como una técnica complementaria puede ayudar a establecer consistencia en la cirugía. Esto puede ayudar a disminuir el número de animales utilizados, mientras que proporciona datos de mayor calidad. También permite a los investigadores para controlar la lesión cardiaca, la muerte del tejido y / o remodelación de forma no invasiva con el tiempo. Por último, el uso de ECG como una confirmación de infarto de isquemia / reperfusión ofrece la posibilidad de establecer tendencias electrofisiológicos cuantitativos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 1100 | Fujifilm Visual Sonics |
Echocardiography Machine | |
| Mouse Handling Plate | Fujifilm Visual Sonics |
Heated ECG plate | |
| Signa-Gel | Highly Conductive Multi- | ||
| Electrode Gel | Parker | 15-25 | Purpose Electrolyte |
| Transpore Medical Tape | 3M | 1527-0 | |
| PI-Spray II | Pharmaceutical Innovations | NDC 36-2013-25 | Cleaning agent for ECG plate |
| C57Bl6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Male, 8 - 12 wk |
| IsoThesia-Isoflurane | Henry Schein | NDC 1169-0500-1 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Systane Nighttime Lubricant Eye Ointment | Alcon | 65050935 | |
| 7-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | 640.O32 | |
| 5-0 Perma-Hand Silk Sutures | Ethicon | K809.O32 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ | RS-5881 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| Gauze | Bio Nuclear Diagnostics Inc | DIS-022B | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Buprenex CIII | Patterson Veterinary | 0-891-9756 | Buprenorphine Hydrochloride Analgesic |
| Betadine | Purdue Products | 67618-150-08 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | NRSL-22339-05 |
References
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