Introduction
L'insufficienza cardiaca è una sindrome complessa clinica, i cui sintomi comprendono stanchezza, dispnea, intolleranza all'esercizio, e ritenzione di liquidi nei tessuti periferici. E 'la principale causa di morte nei paesi sviluppati 1. Oltre a cardiomiopatia ereditaria causata da mutazioni in proteine sarcomero o canali ionici 2, disfunzione miocardica può essere causata da una varietà di condizioni mediche, tra cui l'ipertensione, le malattie delle valvole cardiache, l'obesità, il diabete e 3. Cambiamenti nella struttura del miocardio, conduzione elettrica, e il piombo metabolismo energetico per inadeguata capacità di pompaggio cardiaco per soddisfare le esigenze di circolazione, che alla fine si traduce in insufficienza cardiaca 3,4. Indagare i meccanismi alla base di insufficienza cardiaca, di conseguenza, è fondamentale nel campo della ricerca cardiovascolare. L'identificazione dei meccanismi molecolari che portano alla progressione dell'insufficienza cardiaca può eventualmente aiutare nella scoperta di nuovi bersagli terapeutici o biomarcatori utili
ipertrofia cardiaca e il rimodellamento svolge un ruolo critico nello sviluppo di insufficienza cardiaca. Cardiopatia ipertensiva è il fattore che contribuisce chiave di ipertrofia cardiaca e il rimodellamento maladaptive visto in pazienti umani 1. Per simulare queste condizioni umane, i modelli animali sono spesso stabiliti attraverso procedure chirurgiche. In particolare, l'aorta addominale trasversale o può essere costretta ad aumentare la resistenza contro il ventricolo sinistro, che alla fine porta ad un sovraccarico di pressione nel cuore. Questo fenomeno provoca solitamente ipertrofia cardiaca, una compensazione fisiologica dei cardiomiociti per soddisfare la domanda funzionale del sistema cardiovascolare. Tuttavia, la domanda funzionale sostituisce i normali meccanismi compensatori fisiologici, che porta alla fibrosi cardiaca e Contraccompromissione delle mattonelle. Trasversale costrizione aortica (TAC), la chirurgia spesso comporta procedure complesse, tra cui toracotomia, la ventilazione meccanica, e la separazione del timo e del tessuto grasso dall'arco aortico. Al contrario, addominale costrizione aortica richiede tecniche sperimentali semplici 6-8. L'aorta addominale, tra la sinistra e la destra arterie renali, è ristretto durante l'intervento chirurgico. Ipertrofia cardiaca e il rimodellamento può essere osservato parecchie settimane dopo l'intervento chirurgico addominale aortico costrizione 6-8; producono cardiopatia ipertensiva robusta simile a quello generato dal trasversale chirurgia costrizione aortica 9,10. Qui, descriviamo un protocollo per condurre addominale costrizione aortica nei ratti usando un metodo efficiente, altamente riproducibile e minimamente invasiva. L'aorta addominale adiacente alle arterie renali è costretto da un anello 0,72 millimetri formato da un filo di seta 4-0. Dieci settimane dopo l'intervento chirurgico, l'ipertrofia cardiaca e remodeling può essere osservato. Il modello di ratto di ipertrofia cardiaca costrizione indotta dell'aorta addominale fornisce una piattaforma per lo studio dei meccanismi di malattia e fisiopatologia, così come lo sviluppo di potenziali terapie.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, pubblicato dal National Institutes of Health (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). Questo protocollo è stato approvato dal e in conformità con le linee guida stabilite dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso National Taiwan University.
1. Chirurgia Animal
- Preparare un ago G 22 siringa ottundimento la punta di un ago su una pietra levigatura. Utilizzando pinze, plicate l'ago a un angolo retto.
- Prima della chirurgia, preparare gli strumenti necessari chirurgici e materiali, nonché una gabbia di recupero. Autoclavare tutti gli strumenti e forniture chirurgici prima dell'uso.
- Mantenere i ratti circa 200 g e tenerli sotto cicli di 12 ore luce / buio a temperatura controllata (21 ± 2 ° C), con libero accesso a cibo e acqua. Include almeno 6 topi in ciascun gruppo. Anestetizzare i topi con pentobarbital(75 mg / kg in 0,5 ml, IP) o un altro agente anestetico appropriato. Confermare la profondità dell'anestesia testando il riflesso di coda.
NOTA: L'assenza di coda riflesso è un indicatore di un'anestesia adeguata. - Inserire un topo in posizione supina su una piattaforma intervento chirurgico con una piastra elettrica per mantenere la temperatura corporea. Radere la regione addominale del ratto con un tagliatore di peli e capelli rimozione lozione per evitare contaminazioni chirurgici. Scrub l'addome in modo pulito rasato con betadine o un altro reagente di pulizia prima della chirurgia.
NOTA: E 'importante mantenere un campo sterile durante tutta la procedura. - Effettuare una incisione 2 centimetri lungo la linea mediana del ventre con un bisturi. Utilizzando normale soluzione fisiologica, mantenere l'organo addominale umido durante l'intervento chirurgico. Spostare organi digestivi attenzione al lato con batuffoli di cotone per esporre la vena cava inferiore che si trova nella regione peritoneale posteriore. Identificare l'aorta addominale, che giace giustapposta e di solito sullasinistra della vena cava inferiore.
NOTA: L'aorta addominale è il vaso che pulsa nel tempo con la frequenza cardiaca. - Pierce il peritoneo con un paio di pinze per scoprire i vasi al di sotto. isolare delicatamente l'aorta addominale adiacente alle arterie renali e superare un 8 cm a lunga 4-0 seta sutura sotto l'aorta addominale tra le origini del diritto e delle arterie renale sinistra.
- Fare un doppio nodo sciolto con la sutura; lasciare un anello di 3 mm di diametro, e posizionare l'ago 22 G attenuato e piegata all'interno del ciclo. Stringere il nodo intorno alla aorta e l'ago, e poi rimuovere immediatamente l'ago per ottenere un diametro di 0,7 millimetri costrizione.
- Chiudere la cavità addominale con 6-0 materiale di sutura riassorbibile. Suturare le incisioni del muscolo o della pelle con semplici punti staccati. Per prevenire l'infezione, strofinare il sito chirurgico con una tintura di iodio.
- Osservare l'animale accuratamente fino riprende conoscenza sufficiente, come indicato dalla libera circolazionee l'assunzione di cibo. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Per prevenire il dolore post-operatorio, trattare il ratto con paracetamolo (300 mg / kg a 0,5 ml, ip).
NOTA: gli utenti devono somministrare analgesici come approvato dalle politiche istituzionali.
2. tessuti e nel sangue Collection Campione
- A 10 settimane post-operatorie, pesare il ratto e anestetizzare con pentobarbital (75 mg / kg in 0,5 ml, ip). Prima dell'intervento, confermare la profondità dell'anestesia testando il suo riflesso di coda. Posizionare il ratto su un vassoio di metallo.
- Effettuare una incisione 2 centimetri lungo la linea mediana del collo con un bisturi. Spostare i muscoli con cura con una pinza per esporre la trachea. Osservare attentamente per identificare le arterie carotidi, che sono parallele alla trachea e pulsano nel tempo con la frequenza cardiaca.
- Raccogliere il sangue dalla carotide in un tubo di raccolta di sangue rivestito con EDTA. immediatamente centrifugail sangue per 15 min a 2000 xg e raccogliere il plasma. Conservare il plasma sanguigno a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Fare un cinque centimetri incisione alla regione toracica, intorno alla linea mediana del processo xifoideo. Forare il diaframma con una pinza taglienti. Utilizzando un paio di forbici, tagliare e rimuovere la gabbia toracica lungo le linee emiclaveare su entrambi i lati per esporre il cuore. Asportare cuore con cura lungo i confini cardiache e vascolari. Rimuovere il cuore delicatamente senza afferrare il tessuto.
- Montare il cuore su un apparato di perfusione Langendorff modificato legando il tronco aortico all'ago perfusione. Profumato cuore con tampone Krebs (contenente 110 mM NaCl, KCl 2,6 mm, 1,2 mm KH 2 PO 4, 1,2 mm MgSO 4, 25 mM NaHCO 3, e 11 mm di glucosio [pH 7.4]) per lavare il sangue. Pesare il cuore e calcolare il rapporto cuore-peso-a-corpo-peso. Fissare il cuore con 4% paraformaldeide sul ghiaccio. Ricordatevi di indossare una maschera, dal momento che il vapore paraformaldeide è toxcircuito integrato.
3. Tessuto Fibrosi Quantificazione
- Posizionare il tessuto cardiaco paraformaldeide-fisso su un dispositivo di sezionamento tessuto e tagliare 2 mm sezioni spesse. Posizionare le sezioni di tessuto in una cassetta embedding. Disidratare il tessuto attraverso una serie di bagni di alcool graduati (50%, 75%, 95% e 100% per 1 ora ciascuno).
- Infiltrati il tessuto con xilene per 1 ora e, infine, in cera per 1 ora. Posizionare il tessuto infiltrato in una cassetta embedding e incorporare con cera di paraffina. Conservare i tessuti incorporati nei blocchi di paraffina a temperatura ambiente fino microtoming.
- Tagliate il tessuto incorporato in 4 sezioni micron di spessore. Place sezioni in un bagno d'acqua di 45 ° C. Immergere un vetrino a bagnomaria in un angolo e avvicinare gradualmente i bordi della sezione di paraffina per consentire fissaggio parziale diapositiva.
- Spostare il vetrino in e fuori del bagno per rimuovere eventuali sacche d'aria sotto la sezione di tessuto e per facilitare una migliore fissaggio. t seccoscivola a 37 ° C per 1 ora e conservare a temperatura ambiente per la colorazione istologica.
- Mettere il vetrino in un serbatoio. Deparaffinare il vetrino con xilene per 30 min e reidratare in sequenza alcool diluito (95%, 75% e 50% per 3 minuti ciascuno) e infine con acqua distillata. Utilizzare un'adeguata soluzione rosso picrosirius per coprire completamente le sezioni di tessuto per 1 ora. Sciacquare i vetrini in una soluzione allo 0,5% di acido acetico per due modifiche, e quindi eseguire due risciacqui in alcool assoluto.
- Asciugare il vetrino e montare il vetrino in resina sintetica con un vetrino. Fotografare il vetrino in un campo di luce visibile.
NOTA: L'area rossa nella fotografia mostra una zona positivo rosso picrosirius sotto un microscopio a 200X ingrandimento. Calcolare la percentuale della zona positivo rosso picrosirius sull'intera area, che indica il grado di fibrosi 11.
4. Sangue Troponina Quantificazione
- Quantificare i livelli di troponina plasmaticautilizzando un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Analizzare ogni campione in duplicato. Carico 50 ml di plasma sanguigno e 50 ml di un cocktail di anticorpi nei pozzetti appropriati. Sigillare la piastra e incubare per 1 ora a temperatura ambiente su un agitatore a 400 rpm.
NOTA: troponina cardiaca nel plasma è un marker per il danno cardiaco. - Aspirare il liquido e lavare bene ciascuno con 250 microlitri di tampone di lavaggio tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e asciugare contro tovaglioli di carta puliti per rimuovere il liquido in eccesso.
- Aggiungere 100 pl di substrato tetrametilbenzidina ciascun pozzetto ed incubare per 10 minuti al buio su un agitatore a 400 rpm. Aggiungere 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto. Agitare la piastra su un agitatore per 1 minuto per mescolare. Registrare la densità ottica (DO) a 450 nm.
NOTA: La concentrazione di troponina è proporzionale al valore OD.
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Representative Results
10 settimane dopo l'intervento costrizione dell'aorta addominale, la patologia cardiaca risultante è stata analizzata. L'istologia cardiaca è stato misurato calcolando il rapporto tra il peso del cuore al peso corporeo e rilevando la quantità di collagene nel cuore. lesione cardiaca è stata confermata attraverso la misurazione della concentrazione plasmatica di troponina cardiaca.
Come mostrato in figura 1A, la dimensione cardiaca venne ampliata dopo la chirurgia costrizione dell'aorta addominale, come dimostrato da un alto rapporto di cuore-peso-peso corporeo (Figura 1B), un indicatore di ipertrofia cardiaca. Utilizzando picrosirius colorazione rossa, il miocardio fibrotico colorato con un contenuto di collagene aumento (rosso) può essere distinto da aree normali (giallo, figura 2). Fibrosi cardiaca è stata aumentata dopo chirurgia dell'aorta addominale costrizione (Figura 2B) rispetto alla c ontrolli (Figura 2A). I risultati correlano con concentrazioni plasmatiche di troponina (Figura 3). Un aumento della concentrazione di troponina indica che si è verificato rimodellamento cardiaco e lesioni durante sovraccarico di pressione. Nel loro insieme, i risultati addominali costrizione aortica in danno cardiaco evidente, contrassegnati ipertrofia cardiaca, e rimodellamento tissutale.
Figura 1:. Ipertrofia cardiaca durante sovraccarico di pressione (A) cuore Rappresentante e (B) rapporti di cuore-peso-a-corpo-peso sono mostrati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico costrizione dell'aorta addominale. I dati rappresentano la media ± SEM di sei esperimenti indipendenti effettuati. Le differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante test t. * P <0,05 rispetto al controllo. 8fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: fibrosi cardiaca durante sovraccarico di pressione.
Picrosirius colorazione rosso ha rivelato una maggiore espressione del collagene. (A) picrosirius Rappresentante colorazione rossa (Scala bar = 200 micron) e (B) percentuale di area fibrotica 10 settimane dopo l'intervento chirurgico costrizione dell'aorta addominale. I dati rappresentano la media ± SEM di sei esperimenti indipendenti effettuati. Le differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante test t. * p <0,05 rispetto al controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: lesione cardiaca durante sovraccarico di pressione.
Le concentrazioni di troponina plasma sanguigno sono stati misurati 10 settimane dopo l'intervento chirurgico costrizione dell'aorta addominale. I dati rappresentano la media ± SEM di sei esperimenti indipendenti effettuati. Le differenze tra i gruppi sono stati valutati mediante test t. * p <0,05 rispetto al controllo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G syringe needle | BD Biosciences | 309572 | |
| EDTA Blood Collection Tubes | BD Biosciences | REF365974 | |
| 4-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2515N | |
| 6-0 silk suture | Sharpoint™ Products | DC-2150N | |
| Pentobarbital | Sigma Aldrich | 1507002 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | |
| Picrosirius red solution | Abcam | ab150681 | |
| Cardiac troponin kit | Abcam | ab200016 | |
| Imagequant | Molecular Dynamics | ||
| Langendorff | ADInstruments | ML870B2 |
References
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