Summary
Vi beskriver her en fremgangsmåte for å oppnå og å identifisere en nylig karakterisert subpopulasjon av nøytrofil-avledet gigantiske fagocytter. Disse cellene utvikle seg i kultur fra friske humane blod nøytrofile, og er preget av fagocytose, autofagi, umåtelig stor størrelse, og forlenget levetid. Denne fremgangsmåten er viktig for å ytterligere undersøke denne unike nøytrofil-avledet subpopulasjon.
Abstract
Nøytrofile celler (PMN) er best kjent for sine fagocyterende funksjoner mot invaderende patogener og mikroorganismer. De har den korteste halveringstid blant leukocytter og i sin ikke-aktiverte tilstand, blir konstitutivt forpliktet til apoptose. Når rekruttert til inflammatoriske nettsider for å løse betennelse, produserer de en rekke cytotoksiske molekyler med potente antimikrobiell drap. Likevel, når disse kraftige cytotoksiske molekyler er utgitt på en ukontrollert måte de kan skade omkringliggende vev. I de senere årene har imidlertid er nøytrofile allsidighet stadig dokumentert, ved å demonstrere plastisitet og immunfunksjoner. Vi har nylig identifisert en ny nøytrofil-avledet undergruppe, som utvikler spontant i standard kulturbetingelser uten tilsetning av cytokiner / vekstfaktorer så som granulocytt-kolonistimulerende faktor (GM-CSF) / interleukin (IL) -4. Deres fagocytterende evner av nøytrofile rester i stor grad bidra til å øke sinestørrelse umåtelig; derfor ble de betegnet gigantiske fagocytter (Gφ). I motsetning til nøytrofile er Gφ lenge levd i kulturen. De uttrykker klyngen av differensiering (CD) nøytrofile markører CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoksidase (MPO) / nøytrofil elastase (NE), og er blottet for monocytic avstamning markørene CD14 / CD16 / CD163 og dendrittiske CD1c / CD141 markører . De tar også opp latex og zymosan og svare ved oksidativ burst til stimulering med opsonisert-zymosan og PMA. Gφ uttrykker også åtseldyr reseptorer CD68 / CD36, og i motsetning til nøytrofile, internal oksidert-low density lipoprotein (oxLDL). Videre, i motsetning til friske nøytrofile, eller kultur monocytter, de svare på oxLDL opptak av økte reaktive oksygenforbindelser (ROS) produksjon. I tillegg er disse fagocytter inneholder mikrotubulus-assosiert protein-en lettkjede 3B (LC3B) belagt vakuoler, som indikerer aktivering av autophagy. Ved hjelp av spesifikke hemmere er det klart at både fagocytose og autofagi er prerequisites for deres utvikling og sannsynlig NADPH oksidase avhengig ROS. Vi beskriver her en metode for utarbeidelse av denne nye undergruppe lang levetid, nøytrofil-avledet phagocytic celler i kultur, deres identifisering og deres kjente egenskaper. Denne protokollen er vesentlig for å oppnå og karakterisere Gφ for videre å undersøke deres betydning og funksjoner.
Introduction
Polymorfonukleære nøytrofiler (PMN) utgjør den største bestanden av leukocytter i blodet, fungerer som den første linjen i forsvaret mot invaderende patogener ved å produsere et bredt spekter av cytotoksiske molekyler. Det tradisjonelle synet har lenge vært at av sirkulerende blod, kortvarig, profesjonelle fagocytter, som er de første som kommer til akutte inflammatoriske nettsider for å bekjempe infeksjoner og hjelpemiddel i clearance av patogener og skadelige partikler. 1 I sin ikke-aktivert tilstand, nøytrofile er konstitutivt forpliktet til apoptose. Når du overfører fra blodet til inflammatoriske seter, nøytrofile gjennomgå aktivering for å løse betennelse. De fagocyttere og drepe invaderende mikroorganismer, ved å frembringe en matrise av cytotoksiske molekyler som reaktive oksygenarter (ROS), lytiske enzymer så som nøytrofil elastase (NE) og katepsiner med potent cidisk aktivitet. For å felle patogener, nøytrofile også slipper ekstracellulære feller (NET) Som består av kjernefysisk kromatin tråder som inneholder antibakterielle peptider og diverse lytiske enzymer. Imidlertid kan ukontrollert utslipp av disse cytotoksiske molekylene fra nøytrofile også hevde betennelsesreaksjoner og indusere skader på omkringliggende vev. 2 er derfor en effektiv klarering av apoptotiske nøytrofiler av makrofager (Mii) og dendrittiske celler (DC) avgjørende for å løse betennelse. 3, 4, 5, 6
I de senere årene har det imidlertid blitt stadig tydeligere at nøytrofile er allsidige celler, hvis funksjoner går langt utover fagocytose og patogen drap. 6, 7 Ved gjennomgår priming eller aktivering, er nøytrofile plastisitet gradvis økende oppmerksomhet. For eksempel, bakterier og mykobakterier utfordret nøytrofile ble vist tilutsondre interleukin (IL) -10 og kontrollere den inflammatoriske respons, noe som tyder på tilstedeværelsen av immunregulerende tiltak. 8 Post-mitotiske nøytrofile ble vist til trans-differensiere i Mii-lignende celler, eller DC-lignende celler ved bearbeider og presenterer antigen fragmenter når de ble behandlet med cytokiner og vekstfaktorer, 9, 10 således som serverer en avgjørende rolle i å integrere medfødte og adaptive responser. 3, 6 Aktivering av vekstfaktor markedsført engulfment av apoptotiske nøytrofile celler eller celleavfall, og derved tilrettelegge for klaring av rusk i inflammatoriske seter og oppløsningen av betennelse, 3, 9 spesielt når Mii / DC klaring system er utilstrekkelig eller overveldet, 11, 12 foreslå potensielle "selvregulering" for å bidra til å reløse den inflammatoriske respons. Dette, siden apoptose er en form for regulert selv-død som kan inhibere den ekstracellulære frigjøring av cytotoksiske forbindelser og således hindre skade på omgivende vev. 6
Forlenget overlevelse er en annen funksjon i nøytrofil aktivering og ble demonstrert ved behandling med forskjellige verts avledede faktorer, slik som granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF), granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), inflammatoriske cytokiner så som interferon ( IFN) -γ, tumor nekrose faktor (TNF) -a og / eller patogene avledede produkter, og dermed, slik at neutrofiler for å modulere deres overlevelse respons. 6 Faktisk er neutrofil overlevelse en forutsetning for sin plastisitet og er knyttet til evnen til å utføre fagocytose. 6, 13 Følgelig ble det også vist å assosiere med fenotypiske og funksjonelle forandringer som DEPENded på oppregulert genuttrykk ved å indusere syntese av nye proteiner som er involvert i nøytrofile levetid forlengelse, og redusert apoptose. 10
I motsetning til nøytrofile som er kortvarig og konstitutivt gjennomgår apoptose i kultur, eller cytokiner / vekstfaktorer-aktiverte nøytrofiler, beskrevet ovenfor, som har utvidet levetid, har vi nylig identifisert en ny, liten undergruppe av nøytrofile som utvikler spontant i langvarig standard kultur forhold fra nylig isolerte humane blod nøytrofiler uten ekstern tilsetning av cytokiner eller vekstfaktorer. 14 Disse nøytrofil-avledede celler som ikke var beskrevet før i litteraturen, ble kalt gigantiske fagocytter (Gφ). Den Gφ har utvidet levetid i kultur, de er fullt utviklet i løpet av 5-7 dager, og er preget av unike morfologiske egenskaper, fenotypiske uttrykk og funksjoner. De er vesentlig utvidet grunnet autophagocytosis av døde nøytrofile rester, vacuolated, og inneholder phagolysosomes. Den Gφ uttrykke spesifikke nøytrofile granulater markør - klynge av differensiering (CD) 66b, de azurofile granulater markører - CD63 og myeloperoxidase (MPO) og ytterligere nøytrofile markører som CD11b, NE, CD15, de NADPH oksidase subenheter gp91- phox og p22- phox, og autofagi markør -LC3BII. 14, 15 Funksjonelt er de aktivt opprullingslatekskuler og zymosan partikler, og generere ROS som reaksjon på zymosan og forbol-12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering. Interessant, i motsetning til friske nøytrofile, Gφ også intensivt uttrykker scavenger reseptorer CD68 og CD36, ta opp oksidert low density lipoprotein (oxLDL), og genererer ROS som respons på stimulering med oxLDL. I tillegg Gφ er blottet for monocyttiske avstamning markørene CD14, CD16 og CD163 eller dendrittiske markører CD1c og CD141. Videre phagocytosis og autofagi og sannsynligvis funksjonell NADPH oksidase er en forutsetning for deres utvikling. Denne siden, fagocytose-inhibitor cytochalsin B, den autofagi hemmere 3-metyladenin (3-MA) og bafilomycin (BafA1) og NADPH oksidase inhibitor - difenylen -jod (DPI) - hindret deres utvikling. I tillegg monocytter / nøytrofile co-kulturer samt eksponering for periodisk hypoksi hemmet deres utvikling, mens nøytrofile tilpasning til vedvarende hypoksi var tydelig. 14,15 Deres foreslått utvikling i kultur er vist i figur 1 sikret protokoll i det foreliggende papir beskrives trinn for trinn ved fremstillingen av Gφ fra nylig isolerte humane blod sirkulerende neutrofiler, deres utvikling, identifikasjon og noen grunnleggende egenskaper. Denne protokollen kan brukes til å undersøke og avsløre det brede spekteret og rollene til disse nylig beskrevet og spennende nøytrofile-avledet Gφ for å characterize deres betydning og deres potensielle funksjoner.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av Giant celler utvikling i 7 Day nøytrofile kulturer. Det er foreslått at inflammasjons (1) nøytrofile gjennomgå apoptotisk celledød, og (2) slipper membran omkranset fragmenter som inneholder kjernefysisk avfall, granulater (grønne og røde prikker) og andre subcellulære bestanddeler som utløser autofagi mekanismer. (3) Giant fagocytter (Gφ) utvikle langsiktige nøytrofile kulturer blottet for cytokiner eller vekstfaktorer ved å internal apoptotiske legemer og nøytrofile rusk, og samtidig opprettholde funksjonell NADPH oxidase.They er preget av ulike nøytrofil CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE markører, store phagosomes omsluttende granulater og cellerester, og scavenger reseptorer CD36 og CD68. Gb1; er for det meste mononukleærerte celler, i stand til å internal også ulike partikler og oksidert LDL og generere ROS. Membranene av vakuoler fylle Gφ inneholde LC3B (markert med mørk blå), en markør for autophagosomal membran, noe som tyder på en streng sammenheng mellom autofagi og gigantiske phagocyte formasjon. Gφ utvikler ikke i medium inneholdende GM-CSF / IL-4. Også hemmere som NADPH oksidase inhibitor - difenylen -jod (DPI), de autofagi hemmere 3-metyladenin (3-MA) og bafilomycin (BafA1) og fagocytose inhibitor cytokalasin B (. Cyto B) avskaffe deres dannelse. (4) Potensielle Gφ funksjoner i vivo kan inkludere anti eller pro-inflammatoriske egenskaper og deltakelse i aterosklerotiske prosesser (dette tallet er basert på våre funn 14, 15 og ble endret fra den medfølgende Redaksjonell av BErton 20). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Protokollen ble godkjent av den lokale menneskerettskomité i henhold til Helsinkideklarasjonen, og alle deltakerne undertegnet et informert samtykkeskjema.
1. nøytrofile Isolasjon og utvikling av Gφ i Kultur
MERK: Alle trinn skal utføres ved hjelp av sterilt vev grade lipopolysaccaride (LPS) -fri løsninger i en bio-sikkerhet Laminar Flow hette. Ikke legg antibiotika, cytokiner eller vekstfaktorer til Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medium.
- Få minst 40 ml venøs blod fra unge friske voksne ved hjelp av en steril hodebunn vene sett. Trekke blod inn i vakuumrør som inneholder etylen tetra eddiksyre K 3 salt (K 3 EDTA) og bland forsiktig. Holde blodet ved romtemperatur.
- Isolere nøytrofile av to trinn diskontinuerlige tettshetsgradient hjelp polysucrose på 1,119 og 1,077 g / ml. Ta med løsninger til romtemperatur før bruk.
MERK: Under sentrifugering, rødt blodceller (RBC) aggregeres av polysucrose og sediment raskt. De mononukleære celler (monocytter / lymfocytter) finnes mellom den øvre plasma / polysucrose -1077 grensesnitt, mens de nøytrofile celler er funnet like over RBCs, ved polysucrose -1077 / 1119-grensesnitt (se figur 2). Denne fremgangsmåten tillater samtidig separering av mononukleære celler og neutrofiler fra det samme individ.
Figur 2: nøytrofile Isolasjon fra humant fullblod. Polysucrose på et 1,077 g / ml er nøye lagvis oppå polysucrose-1,119 g / ml for å danne en usammenhengende gradient. Den fortynnede fullblod blir deretter lagvis oppå polysucrose-1,077. Rørene blir straks utsatt for sentrifugering ved 700 xg i 30 min ved værelsestemperatur uten brems. Tre forskjellige band er notert. (A) Mononukleære celler, (B) polymorfonukleære celler (PMN),og (C) røde blodceller (RBC) i bunnen av røret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Tilsett 12 ml polysucrose-1119 til bunnen av en 50 ml steril polypropylen konisk sentrifugerør.
- Nøye lag 12 ml polysucrose-1077 på polysucrose -1119.
- Fortynn 10 - 12 ml fullblod til et sluttvolum på 24 ml blod med ione-fritt fosfatbuffret saltvann (PBS) inneholdende 2% varme-inaktivert føtalt kalveserum (HI-FCS). Nøye laget 24 ml av den fortynnede helblod på den øvre gradient av røret.
- Sentrifuger ved 700 xg i 30 minutter ved romtemperatur (20 - 24 ° C) uten brems.
MERK: Sentrifugering ved lavere temperaturer kan føre til celle klumper og dårlig restitusjon. - Fjern rørene forsiktig fra sentrifugen without forstyrre graderingen. To opake sjikt må overholdes (A: Mononukleære celler og B: PMN, som er vist i figur 2).
- Aspirer og kast væsken opp til 0,5 cm over lag A. Transfer (eller forkaste) cellene fra dette laget til et rør merket "Mononuclear".
- Aspirer og kast den gjenværende væske opp til 0,5 cm over lag B. Overfør cellene fra dette laget til et rør merket "PMN".
- Basseng PMN fra hver to graderte rør og vask med PBS inneholdende 2% HI-FCS til et sluttvolum på 30 ml. Sentrifuger i 12 min ved 200 xg, fjern supernatanten og kast.
- Å kvitte seg med forurensende røde blodceller (RBC), tilsett 3 ml hypoton 0,2% iskald sterilt NaCl mens resuspending pelleten ved forsiktig å trekke inn og ut med en 1 ml steril pipette tips. Hold på is i 30 sek.
- Etter 30 s, gjenopprette isotonien ved tilsetning av 3 ml steril 1,6% iskald NaCl til røret.
- Til 6 ml isotont saltvann, legge til 6 ml av forvarmet (37 ° C) RPMI-1640 medium supplert med 2% HI-FCS og sentrifuger ved 250 xg i 12 min. Kast supernatanten. Den PMN pellet skal være rent for RBC forurensning.
MERK: Hvis forurenset av RBC, vises PMN pellet rødlig. - Hvis noen forurensende RBC forbli Gjenta trinn 9 og 10 en gang til.
- Cellepelleten suspenderes i 4 ml RPMI-1640 supplert med 10% HI-FCS og telle cellene for å bestemme deres konsentrasjon og levedyktighet ved trypan blå eksklusjon.
- Juster konsentrasjonen for å 1.25 til 1.5 x 10 6 PMN / ml (avhengig av den eksperimentelle behov), og platen 1,0 ml / brønn i en 24-brønners plate.
MERK: Renheten av nøytrofile i granulocytter befolkningen alltid oversteget 95%, som vurderes av mai Grunewald-Giemsa farging og lysmikroskopi. - Etter seeding, plasserer cellene i et fuktig 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
- Erstatt medium hver 3. dag ved å forsiktig aspirere halvparten avmediet og tilsetning av samme volum av friskt RPMI-1640 medium supplert med 10% HI-FCS. Bruk LPS gratis løsninger og forbindelser og lave LPS nivåer i HI-FCS (0,05 ng / ml eller mindre).
MERK: En mild medium endringen er viktig siden Gφ, som utvikler seg i kultur ikke ordentlig feste til kultur fatet og sprek vasking kan også vaske ut utviklings celler. Utseendet av Gφ er merkbar på 3 - 4 dager etter PMN dyrking, avhengig av blod donor. De fleste av analysene og analysene beskrevet her utføres mellom 6 - 7 dager i kultur, når Gφ er veldig store i størrelse. Det skal bemerkes at tilsetning av 1 - 10 ng / ml LPS i RPMI-1640 medium ikke påvirke Gφ utvikling i kultur. 14
2. Confocal Laser Scanning Mikroskopi
- Forbered cytospins 16 fra nylig isolerte nøytrofiler, og fra 7 dagers utviklet Gφ kulturer(Utarbeidet i kapittel 1).
MERK: For å øke konsentrasjonen av Gφ i retten for ulike analyser, forsiktig fjerne halvparten av mediet. Pass på at Gφ ikke blir oppdaget i fjernet medium ved å undersøke medium under et lysmikroskop. Deretter intensivt pipettér de resterende medium for å fjerne lett levd Gφ. Sentrifuger medium i 10 minutter ved 200 xg, og resuspender pelleten i 100-120 ul medium.- Bruk 100 - 120 mL av medium som inneholder celler for hvert lysbilde. Forbered duplikat eller tredoble lysbilder fra hver behandling. Spin for 7 min ved 84 x g.
- Tørk de spunnede cellene og fikser cellene med 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 10 minutter under en kjemisk hette. Vask 3 ganger med PBS (~ 100 ul i et par sekunder pr vask). For intracellulær farging, permeabilisere cellene med 0,5% Triton X-100 i PBS ved romtemperatur i 10 minutter og vaskes 5 x med PBS.
MERK: På alle stadier, bruke egnet buffer / løsnings volumeg å dekke omkretsen av cellene på lysbildet. Bruk en hydrofob barriere penn for å bestemme celler omkretsen.
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Unngå kontakt med hud og øyne. Bruk egnet personlig verneutstyr. - Blokk-celler med 10% normalt geiteserum i RPMI-1640 medium og inkuber over natten ved 4 ° C eller ved romtemperatur i 40 min. Vask med PBS.
- Inkuber med enkelt antistoff (Ab) eller en kombinasjon av mus og kanin primære antistoffer (ABS) ved en 1: 100 fortynning (~ 100 ul). Inkuber over natten (18 - 20 timer) ved 4 ° C.
MERK: Her monoklonalt Abs inkludert: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, anti- CD15, og anti-Cytokrom b-245 lett kjede (p22- phox identifikasjon). Kanin polyklonale Abs inkludert: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-Myeloperoxidase, anti-nøytrofil elastase (NE), og anti-Nox2 / gp91- phox Abs. Isotype kontroller inkludert renset mus IgG1 og IgG2, og kanin IgG. FORBEREDELSERe de Abs i henhold til produsentens instruksjoner og bruke riktig volum (ca 100 mL) for å dekke omkretsen av cellene. - Vask cellene og inkuberes med 1/400 sekundære antistoffer Cy2-CF (488A) -konjugert geite-anti-kanin-IgG (grønn) og / eller Cy5 (CF-647) -konjugert geit-anti-mus IgG (rød) ved romtemperatur i 40 min.
MERK: Fortynn og forberede Abs i henhold til produsentens instruksjoner. - Etter vask, montere lysbilder med en dråpe monteringsmedium, som inneholder 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) for nukleær farging, deretter umiddelbart plassere dekkglass.
- Analyser lysbildene ved en konfokal laser scanning system med fluoresens mikroskop og Plan Apo 40X immersjonsolje objektiv. Utføre analysen i løpet av 30 minutter til 2 timer etter fremstillingen av skinnene, eller holde ved 4 ° C over natten.
- Beregn celleområdet og fluorescens intensitet ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (f.eks bilde J). For samlokalisering, quantify av programvare ved hjelp Manders Overlapping Coefficient (MOC) 17.
MERK: Bare celler med MOC> 0.6 kan betraktes som celler med betydelig samlokalisering.
- Beregn celleområdet og fluorescens intensitet ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (f.eks bilde J). For samlokalisering, quantify av programvare ved hjelp Manders Overlapping Coefficient (MOC) 17.
3. Sjele av PMN Across endotelceller: Effekter av IL-8 på Giant phagocyte (Gφ) Dannelse
MERK: Bruk 24-brønnen gjennomtrengelig cellekultur setter for cellen sjele analysen.
- Belegge det øvre kammer av innsatsen med 150 ul fibronektin i en konsentrasjon på 50 ug / ml, og hold ved romtemperatur i 30 min.
- Legg til det øvre kammer 5 x 10 4 EA.hy926 endoteliale celler / brønn, resuspendert i 150 ul formulert Dulbeccos modifiserte Eagles medium (komplett vekstmedium).
MERK: Kontroller at endothelial mono er konfluent før bruk. - Til det nedre kammer, tilsett 700 ul av hele vekstmedium.
- Plasser gjennomtrengeligcellekultur setter i klase skuffer og kultur de EA.hy926 endotelceller i 2 dager ved 37 ° C i 5% CO 2.
MERK: Parallelt på den andre dagen forberede fersk PMN (som beskrevet i punkt 1). - Etter 2 dager, erstatte mediet i nedre og øvre kamre av innleggene.
- Til det nedre kammer, tilsett RPMI-1640 medium supplert med 10% FCS og IH-interleukin (IL) -8 til en sluttkonsentrasjon på 50 nM / ml. Ikke legg til IL-8 for å kontrollere nedre kammer.
- Til hver øvre kammer, tilsett 10 6 fersk PMN i 100 pl RPMI-1640 medium supplert med 10% IH-FCS.
- Inkuber klyngen magasinene ved 37 ° C i 5% CO2 i 90 minutter.
- Etter 90 min inkubasjon, fjerne celler fra øvre og nedre kammer separat og telle hver undergruppe. Uttrykte celler i hvert kammer som en prosentandel av de totale celler tilsatt.
MERK: Fjern forsiktig celler fra øvre chamber ved pipettering forsiktig for å unngå å fjerne endotelceller og overføre til et sterilt rør. Fjerne cellene fra det nedre kammer ved pipettering og vasking av det nedre kammer med 500 ul og overføring til en annen sterilt rør. - Basseng 10 6 celler fra flere brønner i transmigrating (nedre kammer) og ikke-migrerende (øvre kammer) PMN-fraksjoner, og hver kultur i 7 dager uten vekstfaktorene som er angitt i trinn 14-16 (avsnitt 1).
- Spin celler på lysbilder 16 og analysere de utviklede celler i hver kultur tilstand ved konfokalmikroskopi som beskrevet i kapittel 2.
Representative Results
Nøytrofile Autophagocytosis og utvikling i kultur
Neutrofil autophagocytosis og deres utvikling til Gφ i løpet av 7 dager i kultur er vist i figurene 3 og 4. Ved dager 4 - 7, deres størrelse var vesentlig utvidet, 15 og autophagosytosis var tydelig så tidlig som 90 minutter etter co-dyrking av nøytrofile celler med fluorescerende membran flekker (PKH-26, rød, PKH-67, grønn). 14 Som en kontroll for å nøytrofil denne undergruppe, ble enkelte nøytrofile kulturer også behandlet med GM-CSF / IL-4. De cytokin-behandlede celler økte i størrelse i løpet av 7 - 14 dager i kultur som beskrevet tidligere. 18, 19 men var mindre enn Gφ og hadde cytoplasmiske fremspring som likner DC-lignende celler (figur 5), som rapportert tidligere b y Oehler et al. 19 Også, GM-CSF / IL-4-behandlede celler var negative eller hadde en lav CD66b uttrykk, 15 hvilket klart viser morfologiske og eventuelt funksjonelle forskjeller.
Figur 3: Autophagocytosis i Utvikling Giant Fagocytter (Gφ) i kultur. Fersk isolerte rensede nøytrofile ble merket med PKH-67 (grønn) eller PKH-26 (rød) membran fluorescerende fargestoffer på null tid, og deretter co-kultivert og fulgt opp til syv dager. Cellene ble sentrifugert på objektglass, kjerner ble farvet med DAPI og prøver ble analysert ved konfokal mikroskopi. Autophagocytosis er allerede merkbar etter 90 minutter av co-kultur. Sammenslåing av rødt og grønt til gult og oransje er tydelig i utviklings Gφ.filer / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Utvikling av Giant Fagocytter (Gφ) i kultur. Fersk isolerte rensede nøytrofile ble fulgt opp til 7 dager i kultur. Cellene ble spunnet på glassplater på de angitte tidsintervaller, farget med May Grunewald-Giemsa, og analysert med en lys felt mikroskopi. En person med få eosinophils presenteres for sammenligning. Legg merke til at størrelsen av eosinofiler forblir uendret i kultur. Forstørrelse 100X olje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Sammenligning mellom utviklingen av Giant Fagocytter (G φ) og GM-CSF / IL Behandlet Neutrophils i kultur. (A) May Grunwald-Giemsa farget nøytrofile dyrket uten (Gφ) og med GM-CSF / IL-4 i 7 dager. Prøvene ble analysert med en lys-felt mikroskopi. Forstørrelse, X40. Celler som er utviklet i kulturer med medium supplert med GM-CSF / IL-4 viser utbredte cytoplasmatiske anslag, men er mindre enn Gφ. (B) nylig isolerte neutrofiler ble merket med PKH-26 (rød) fargestoff og dyrket i cytokin-fritt medium i 7 dager eller merket med PKH-67 (grønn) fargestoff og dyrket i medium supplementert med GM-CSF / IL-4 for 7 dager. Deretter ble de utviklede celler blandet i et 1: 1 forhold og ko-dyrket i 2 timer. Celler ble fikset og analysert ved konfokal microscopy. Dette tallet har blitt modifisert fra referanse. 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For ytterligere å undersøke i løpet av Gφ utvikling, ble deres morfologiske forandringer også etterfulgt av time-lapse mikroskopi. Video-en (dag 3 til dag 4) og video-2 (dag 4 til dag 5) viser utviklingen i renset nøytrofile kulturer. Disse Gφ er ikke-klebende eller lett tilhenger med begrenset bevegelsesevne og aktivt innta rundt nøytrofile rester og rusk. I video-3, blir bevegelsen av monocytt-avledet Mii og Gφ sammenlignet i et blandet monocytt / nøytrofil kultur. Den Mii kryper aktivt (venstre, umerket celle). Den Gφ (til høyre), er lys PKH-26 merket celle.
Video-1: Demonstrerer Utvikling av Giant Fagocytter i Renset PMN kulturer på dag 3 - 4 ved Time-lapse mikroskopi. Nøytrofile ble fulgt opp i kultur fra dag 3 til dag 4 av time-lapse microscopy.The time-lapse mikros systemet består av invertert motorisert fluorescerende mikroskop, og en høyoppløselig svart / hvitt CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Image Capture oppkjøp av time-lapse ble tatt hver 10 min. Opprinnelig publisert i referanse 14 Klikk her for å se denne videoen.
Video-2: Demonstrerer Utvikling av Giant Fagocytter i Renset PMN Kultur på dag 4-5 av Timeg-lapse mikroskopi. Nøytrofile ble fulgt opp i kultur fra dag 4 til dag 5 av time-lapse mikroskopi. Time-lapse mikros systemet består av invertert motorisert fluorescerende mikroskop, og en høyoppløselig svart / hvitt CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Image Capture oppkjøp av time-lapse ble tatt hver 10 min. Klikk her for å se denne videoen.
Video-3: A Giant phagocyte og en Macrophage Utviklet i Co-kultur. Monocytter / nøytrofile co-kultur ble fulgt opp fra dag 4 til dag 5 av time-lapse mikroskopi. Moncyttavledede makrofag (venstre); lyse (PKH-26 farget celle) nøytrofile-avledet giganten phagocyte (til høyre). Time-lapse mikroskopi system for video er sammensatt av omvendt motorisert fluorescerende microscope, og en høyoppløselig svart / hvitt CCD-kamera, med en på scenen inkubator. Image Capture oppkjøp av time-lapse ble tatt hver 10 min. Opprinnelig publisert i referanse 14 Klikk her for å se denne videoen.
Uttrykk av markører i Giant Fagocytter
Den nøytrofil opprinnelse Gφ ble bekreftet ved positiv ekspresjon av de følgende nøytrofile markørene CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (figur 6). Den Gφ også uttrykt NADPH oksidase, de oxLDL scavenger reseptorer - CD68 og CD36, og inneholdt LC3B-belagt vakuoler og aggregater (identifisert ved Western blotting som LC3BII 15), som viser tilstedeværelsen av en autophagy markør. Men de var negative for monocytic avstamning (CD14, CD16 og CD163) og dendritic celler (CD1c og CD141) markører, noe som tyder på at Gφ ikke oppstå fra forurensende monocytter.
Figur 6: Uttrykk for ulike Markører til Neutrophils, monocytter og dendrittiske celler i Giant Fagocytter (Gφ) etter 7 dager i kultur. Positiv uttrykk for nøytrofile bestemt granulat markør CD66b, den azurophil granulater markører CD63 og MPO, nøytrofile elastase og CD15. Negativ uttrykk for de dendrittiske CD1c og CD141 markører og monocyttiske avstamning markører CD14, CD16 og CD163. I tillegg uttrykte Gφ den autofagi markør LC3B, de scavenger reseptorer CD68 og CD36 og NADPH oksidase subenheter gp91-phox / P22-phox subenheter. Kjerner ble farget med DAPI, og prøvene ble analysert ved konfokal mikroskopi. Dette tallet har blitt forandret fra referanser. 14 p>, 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Funksjoner av Gφ - NADPH oksidase Activation, ROS Produksjon og Fagocytose:
Fagocytose av latekskuler og opsonisert zymosan var tydelig i Gφ. Gφ også generert basal ROS (figur 7A), og svart på zymosan og PMA stimulering av oksidativ burst (Figur 7B-D). Men i motsetning til monocytter eller nøytrofiler, Gφ generert ROS også svar på oxLDL stimulering og ble farget av Oil Red O (figur 7B, F). Av notatet, behandling av friske nøytrofile med NADPH oksidase inhibitor - DPI, ikke bare hemmet ROS produksjon, men også prevented Gφ formasjon i kultur, noe som tyder på at ROS signalering er viktig for Gφ formasjon. 14, 15
Figur 7: Oksidativt Burst, fagocytose og oxLDL Opptak av Giant Fagocytter (Gφ). (A) Basal ROS produksjon er tydelig i lysosomer av Gφ. (B) ROS produksjon i respons til oksidert LDL (oxLDL), PMA og zymosan (er zymosan partikler klart angitt). (C) Nitro tetrazolium (NBT) test i Gφ viser luft utbrudd aktivitet uten og med PMA (lysbildene er uplettet, men innsatsene er farget med May Grunwald-Giemsa). (D) NBT test og May Grunewald-Giemsa farget Gφ med PMA og PMA / DPI som hemmet NADPH oksidase og ROS. (E) Fagocytose av LATEX og IgG-opsonisert zymosan i PKH-26 (rød) fargede celler. (F) Oil Red O flekker i ubehandlet og oxLDL behandlet Gφ. Dette tallet har blitt forandret fra referanser. 14, 15 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Sjele av PMN Across endotelceller
For å identifisere potensielle nøytrofiler sub-populasjoner som kan utvikle seg inn i Gφ, ble migrasjonen av nøytrofiler gjennom endoteliale cellemonolagene bestemt (figur 8A). Etter 90 min, 62,3 ± 12,2% av nøytrofiler transmigrated gjennom endotelceller mot IL-8 i det nedre kammeret. Av notatet, Gφ positivt for CD66b / CD15 / LC3B bare utviklet fra transmigrated bestanden av nøytrofile mens cellene som utviklet seg fra den ikke-trekkende nøytrofile brøkdel var mindre i størrelse og negative for de nøytrofile markører CD66b / CD15 (figur 8B, 8C) .
Figur 8: Effekter av IL-8-avhengige PMN Sjele Gjennom endotelceller på Giant phagocyte (Gφ) Formasjonen. (A) En ordning som illustrerer nøytrofile sjele analysen over endotelcelle monolag (ECS) mot IL-8. Denne analysen kan bli betraktet som en modell for nøytrofiler rekruttering til akutte inflammatoriske seter. (B - C) I celle migrasjon analysen (spesifisert i protokoll 3), transmigrating (B) og ikke-migrerende (C) nøytrofile fracsjoner ble dyrket i syv dager uten vekstfaktorer (som i fremgangsmåte 1). Deretter ble cellene spunnet på glassplater og analysert ved konfokal mikroskopi. Faste celler ble farget for CD66b (rød), LC3B (grønn) og CD15 (rød). Kjerner ble farget med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Giant fagocytter (Gφ) er en nylig definert undergruppe av nøytrofile-deriverte celler som uttrykker grunnleggende og spesifikke nøytrofile markører som CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Denne type av nøytrofil-avledet phagocyte ble ikke beskrevet i litteraturen tidligere. I motsetning til nøytrofile som er kortvarig og gjennomgår apoptose, Gφ er Annexin-V-negative og vise utvidet levetid. Likevel, som nøytrofiler, Gφ også internalisere partiklene og produserer NADPH oksidase-avhengig ROS som reaksjon på de partikler og til PMA. Men deres evner til å internal OxLDL og dermed å produsere ROS er unike funksjonene til Gφ. 14
En rekke faktorer ble vist å påvirke deres utvikling i kultur. Mangelen på eksterne cytokiner eller vekstfaktorer i vekstmediet er vesentlig (spesielt GM-CSF / IL-4). Men nøytrofile migrasjon mot IL-8 viste en diskriminerende faktor mellom de som devrømte inn Gφ og de som ikke gjorde det. Også, internalisering av avfall som følge av apoptotiske nøytrofiler, ekspresjon av autophagy proteiner (LC3B) og funksjonell NADPH oksidase, ble alle vist seg å være avgjørende for deres utvikling, ettersom deres hemming forhindres Gφ dannelse (figur 1). Tilsynelatende utviklingen av disse kjempeceller som kommer fra neutrofiler er forskjellig fra det som karakteriserer kjempecelledannelse i monocytt / makrofagen avstamning. De sistnevnte danner flerkjernedannelse kjempeceller i forbindelse med forskjellige kroniske inflammatoriske sykdommer, 20, 21, mens den nøytrofil Gφ beskrevet her utvikler seg via autophagocytosis, ved engulfing cellerester og forbli hovedsakelig mono-kjernedannet gjennom hele deres utvikling, 14 (sjelden imidlertid noen ganger en annen kjerne kan observeres). Videre er en rekke kontroller etablert sin nøytrofil opprinnelse: (1) EXPREssion av de konkrete neutropilic markører og fravær av dendrittiske og monocytic avstamning markører, (2) deres hemmet utvikling i monocytter / PMN co-kulturer, (3) deres ulike bevegelsesmønstre i kultur fra makrofager (som dokumentert av levende celle bildebehandling og tid -lapse mikroskopi), 14 (4) sitt lys tilslutning til plast retter og (5) sin utvikling fra ren CD15 + / CD14 - PMN ervervet ved flowcytometri.
Noen av funksjonene som er identifisert in vitro kan gi oss ledetråder til sine potensielle funksjoner i vivo. For eksempel, for å evnene til Gφ konsumerer store mengder nøytrofile granuler og rusk, tilstedeværelse av store vakuoler, og uttrykket LC3B - en autofagi protein som bidrar til å svekke betennelse gjennom regulatoriske interaksjoner med medfødte immunsignalveier, 22 - som alle støtte scavenging evner. som sådanDisse funnene indikerer også at Gφ kan fungere på inflammasjons hvor Mii / DC system er utilstrekkelig eller overveldet, og dermed bidra til løsning av betennelse. Denne forestillingen kan bli støttet av det faktum at i blandede monocytter / nøytrofile kulturer Gφ utvikling er hemmet. 14 også, gitt at Gφ uttrykke oxLDL scavenger reseptorer (CD36, CD68), internal oxLDL, og produsere ROS svar på det, kan tyde på at de er involvert i aterosklerotiske prosesser for å løse betennelse. Siden Gφ utviklet bare fra nøytrofiler som migrerte mot IL-8, og nøytrofile 'transmigrasjon på tvers av endotel-monolag mot IL-8 representerer neutrofil rekruttering til akutte inflammatoriske seter, dette funn også kan støtte anti-inflammatorisk funksjoner. Omvendt, kan ytelsen til Gφ i visse betennelsestilstander sette dem i stand til å oppfylle granule bestanddeler og ROS, og dermed bidra til perkonsistent betennelse og vevsskade. 20 Men alt i alt, sine autophagic evner indikerer at Gφ sannsynligvis involvert i reduseres den inflammatoriske respons i stedet for å videreføre den.
Interessant har vi nylig identifisert tilstedeværelsen av Gφ i menneskelige aterosklerotisk plakk. (Under forberedelse). Likevel, et stort antall spørsmål gjenstår å bli avslørt. For eksempel, er Gφ pro- eller anti-inflammatorisk? Hva er de faktorer som bestemmer deres dannelse og funksjon in vitro eller in vivo? Hvilke konkrete nøytrofile undergruppe er deres forløper celle som forenkler deres utvikling i Gφ? Er de forbundet med visse sykdommer og hvilke? Kollektivt, posing interessante spørsmål om deres opprinnelse og mulige funksjoner.
Men kritiske trinnene og fallgruver i protokollen bør holdes i bakhodet. Et kritisk punkt i utviklingen av Gφ jegs dyrking de rene nøytrofile i medium blottet for cytokiner, vekstfaktorer eller antibiotika. Et annet kritisk punkt er å utelukke at Gφ utvikle seg fra forurensende monocytter og å fastslå nøytrofil opprinnelse Gφ. Dermed, etter blodseparasjon ved diskontinuerlig gradient, neutrofilene ble videre underkastet et ytterligere trinn med rensing ved flowcytometri hjelp av granulocytt portstyring og CD15 + / CD14 - markører. Den utviklede Gφ oppnådd fra nøytrofiler som ble ytterligere renset ved hjelp av strømningscytometri separasjon var ikke forskjellig fra de som ikke ble utsatt for dette rensetrinn. Derfor ble de fleste av forsøkene gjennomført uten flowcytometri rensetrinn på grunn av ytterligere celletap. Av notatet, i noen sjeldne tilfeller noen eosinofile ble registrert i kultur. Deres størrelse forble uendret gjennom hele dyrkningsperioden. Vi bør også merke seg at selv om det finnes en rekke fremgangsmåterfor nøytrofile separasjon fra menneskeblod, metoden som er beskrevet her er den eneste metoden vi ansatt og derfor kan vi ikke sammenligne Gφ utvikling av andre tilgjengelige metoder for nøytrofile separasjon.
En stor fallgruve i å undersøke Gφ resultat av manglende evne til å få et tilstrekkelig antall rene Gφ befolkningen egnet for ulike biokjemiske analyser. Det er i utgangspunktet ikke mulig under de forhold våre eksperimenter ble utført. For det første er utbyttet av Gφ lav. Fra 1,0 x 10 til 6 PMN podet på 100-200 Gφ utvikle seg etter syv dager i kultur, avhengig av blod donor. For det andre er det i utgangspunktet vanskelig i øyeblikket for å skille den utviklede Gφ i kultur fra de resterende nøytrofile rusk i fatet. Disse begrensninger har gjort det praktisk talt umulig å analysere cellene ved biokjemiske eller molekylærbiologiske metoder. Derfor er denne protokollen fokusert på å beskrive Gφ identifikasjon og funksjon ved hjelp av lettog konfokalmikroskopi. Deres morfologisk transformasjon fra nøytrofile inn Gφ i kultur ble også etterfulgt av levende celle bildebehandling og time lapse mikroskopi. 14 Tilsynelatende mye større blodvolum kan være nødvendig for å kunne gjennomføre biokjemiske eller molekylærbiologiske metoder og overvinne den lave avkastningen innhentet og skille levedyktig Gφ fra nøytrofile 'rusk i fatet.
Oppsummert har vi nylig beskrev for første gang utviklingen av Gφ i kultur, en undergruppe av langlivede fagocytter av nøytrofil opprinnelse. Derfor er dette den eneste metoden for tiden tilgjengelig for å oppnå Gφ i kultur, selv om de to store begrensninger som er nevnt ovenfor skal overvinnes (det lave utbyttet av Gφ oppnådd i kulturen, og den manglende evne til å skille den utviklede Gφ fra nøytrofile avfall i kulturen matrett). Likevel, deres forberedelser og identifikasjon, som presenteres i denne protokollen, er Essential for forskere som er interessert i inflammatoriske responser og nøytrofil biologi og plastisitet, for ytterligere å undersøke den potensielle betydning og funksjon av Gφ.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Edith Suss-Toby for henne uvurderlig hjelp med konfokalmikroskopi studier. Denne studien ble støttet av departementet for innvandring Absorpsjon og Komiteen for planlegging og budsjettering av Rådet for høyere utdanning under rammen av Kamea program (LD og AP). Vi ønsker å takke for støtte fra stipendiat fra Lady Davis Foundation postdoktorFellowShip (OR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
| VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
| VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
| Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
| Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
| Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
| RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
| EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
| ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
| Polysucrose - Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
| Polysucrose - Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) - ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
| Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
| NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
| Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
| Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
| Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
| May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
| Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
| Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
| Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
| Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
| Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
| Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
| Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
| Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
| Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
| Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
| Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
| Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
| Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
| Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
| Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
| Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
| Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
| CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
| CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
| Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
| Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo 40X immersion oil objective |
| Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
| ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
| Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
| Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
| Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
| Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
| High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |
| Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen) | Diagnostic Biosystems | # K039 | For defining cell perimeter for immunoflourescence staining |
References
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Silva, M. T., Correia-Neves, M. Neutrophils and macrophages: the main partners of phagocyte cell systems. Front. Immunol. 3, 174 (2012).
- Cowburn, A. S., Condliffe, A. M., Farahi, N., Summers, C., Chilvers, E. R. Advances in neutrophil biology: clinical implications. Chest. 134, 606-612 (2008).
- Duffin, R., Leitch, A. E., Fox, S., Haslett, C., Rossi, A. G. Targeting granulocyte apoptosis: mechanisms, models, and therapies. Immunol. Rev. 236, 28-40 (2010).
- Silva, M. T. Macrophage phagocytosis of neutrophils at inflammatory/infectious foci: a cooperative mechanism in the control of infection and infectious inflammation. J. Leukoc. Biol. 89, 675-683 (2011).
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Cassatella, M. A., Locati, M., Mantovani, A. Never underestimate the power of a neutrophil. Immunity. 31, 698-700 (2009).
- Zhang, X., Majlessi, L., Deriaud, E., Leclerc, C., Lo-Man, R. Coactivation of Syk kinase and MyD88 adaptor protein pathways by bacteria promotes regulatory properties of neutrophils. Immunity. 31, 761-771 (2009).
- Araki, H., et al. Reprogramming of human postmitotic neutrophils into macrophages by growth factors. Blood. 103, 2973-2980 (2004).
- Iking-Konert, C., et al. Up-regulation of the dendritic cell marker CD83 on polymorphonuclear neutrophils (PMN): divergent expression in acute bacterial infections and chronic inflammatory disease. Clin. Exp. Immunol. 130, 501-508 (2002).
- Rydell-Tormanen, K., Uller, L., Erjefalt, J. S. Neutrophil cannibalism--a back up when the macrophage clearance system is insufficient. Resp. Res. 7, 143 (2006).
- Esmann, L., et al. Phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes: diminished proinflammatory neutrophil functions in the presence of apoptotic cells. J. Immunol. 184, 391-400 (2010).
- Nordenfelt, P., Tapper, H. Phagosome dynamics during phagocytosis by neutrophils. J. Leukoc. Biol. 90, 271-284 (2011).
- Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, L. The development of giant phagocytes in long-term neutrophil cultures. J. Leukoc. Biol. 96, 511-521 (2014).
- Dyugovskaya, L., Berger, S., Polyakov, A., Lavie, P., Lavie, L. Intermittent Hypoxia Affects the Spontaneous Differentiation In Vitro of Human Neutrophils into Long-Lived Giant Phatocytes. Oxid. Med. Cell. Longev. , 9636937 (2016).
- Mihalache, C. C., et al. Inflammation-associated autophagy-related programmed necrotic death of human neutrophils characterized by organelle fusion events. J. Immunol. 186, 6532-6542 (2011).
- Manders, E. M. M., Verbeek, F. J., Aten, J. A. Measurement of Colocalization of Objects in Dual-Color Confocal Images. J. Microsc. 169, 375-382 (1993).
- Matsushima, H., et al. Neutrophil differentiation into a unique hybrid population exhibiting dual phenotype and functionality of neutrophils and dendritic cells. Blood. 121, 1677-1689 (2013).
- Oehler, L., et al. Neutrophil granulocyte-committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics. J. Exp. Med. 187, 1019-1028 (1998).
- Berton, G. Editorial: Gigantism: a new way to prolong neutrophil life. J. Leukoc. Biol. 96, 505-506 (2014).
- Milde, R., et al. Multinucleated Giant Cells Are Specialized for Complement-Mediated Phagocytosis and Large Target Destruction. Cell. Rep. 13, 1937-1948 (2015).
- Deretic, V., Saitoh, T., Akira, S. Autophagy in infection, inflammation and immunity. Nat. Rev. Immunol. 13, 722-737 (2013).
