Protocol
바이오 필름 형성을위한 표면의 1. 준비
- 기계적 커터 칩으로 304 1 mm 두께의 스테인레스 판 (10 × 10 mm 2)를 잘라.
- 10 분 각각 아세톤, 메탄올, 탈 (DI) 물 순차적 칩의 초음파 세척을 수행합니다. 유기 오염 물질을 제거하고, 유리와 같은 물질로 이루어진 제성 컨테이너를 사용한다.
- 3-5 초 동안 DI 물 흐르는 칩을 헹군다.
- 3-5 초 동안 N 2 가스 흐름을 이용하여 칩을 건조.
세균성 문화의 2. 준비
- P.를 타고 -80 ° C 깊은 냉동고에 저장 재고 (친절 교수 성 동국 리, UNIST, 한국에서 제공) 푸티 다 KT2440.
- 1 분 후 상온에서 해동 한 동결 스톡 용액의 상층에 슬러시집니다. 원액의 용융 층으로 루프를 담근다.
- 루리아에 행진에 세균이 루프를 사용하여1.5 % 한천을 포함 -Bertani (LB) 플레이트.
- 박테리아 식민지 성장을 30 ℃에서 하룻밤 접시를 품어.
- 새로운 루프를 사용하여 플레이트에서 하나의 식민지를 선택합니다.
- 단일 박테리아 콜로니를 함유하는 루프와 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 LB 배지 10 ㎖를 접종한다.
- 30 ° C에서 16 시간 160 RPM의 진탕 배양기에서 국물을 품어.
표면에 3 biofilm 형성
- 각 칩의 표면을 살균, 1-2 초마다 5 회 핀셋 제조 된 칩의 각각을 픽업 70 % 에탄올에 담갔다. 칩이 침지시 핀셋으로 개최되어 있는지 확인합니다.
- 남아있는 에탄올을 제거 멸균 된 DI 물과 LB 배지 순차적으로 각 칩, 1 ~ 2 초마다 5 번 찍어.
- 이 칩과 잘 당 5 ml의 LB 배지로 6 웰 배양 판에이 칩을 놓습니다.
- LB 배지에 도달의 농도까지 박테리아 문화를 희석8 × 108 세포 / ㎖ (파장 600nm에서의 광학 밀도 : 0.8 ~).
- 희석 세균 배양의 50 μl를 잘 각각 접종.
- 바이오 필름의 형성을위한 24 시간 동안 흔들림없이 30 ° C에서 접시를 품어.
4. CO 2 에어로졸 청소
- 10 mM의 초산 암모늄 버퍼에 바이오 필름 형성 칩을 찍어 (휘발성) 5 회 느슨하게 부착 플랑크톤 박테리아를 제거합니다.
- 공기가 온화하게 흐르는 바이오 안전성 캐비닛에이 칩을 건조시킵니다.
- 건조 직후, 제트의 축선을 따라 CO 2 노즐로부터 20mm 인로드 위치에 칩을 배치했다. 40 ° 각도로 분사 축을 기울입니다.
- 가스 압력 조절기를 사용하여, 각각 5.3 MPa의 0.7 MPa의에 CO 2와 N 2 가스의 정체 압력을 설정합니다.
- 칩의 중앙 부분에 에어로졸 젯을 적용합니다. (2)해야 고체 CO 포함 화이트 에어로졸볼 수 있습니다. 5 초 동안 CO 2의 솔레노이드 밸브 "의"를 켠 다음 3 초 동안 "OFF"전원을 켜 : 주기적으로 수동으로 제어 스위치를 사용하여 (사이클 8 초). 질소 퍼지를 이용해야하는 경우, N (2)의 연속 공급을위한 솔레노이드 밸브를 켜.
- 16, 40 CO 2 에어로졸을 칩을 치료하고와 질소 퍼지없이 88 초. 음성 대조군으로 처리없이 칩을 유지합니다.
제거 효율 5. 분석
- 제어 및 에어로졸 처리 칩 세균 세포를 염색하기 위해 DI 물 : 1 μM 녹색 형광 핵산 얼룩 (500분의 480 nm의 여기 / 방출 파장)을 준비한다.
- 염색 용액에 칩을 놓습니다.
- 30 분 동안 37 ° C에서 빛이없는 배양기에서 배양 한 칩.
- 배양 후, 부드럽게 과도한 형광 색소를 제거하는 DI 워터를 흐르는 칩을 헹군다.
- 칩 위스콘신을 건조제 N 2 가스 흐름.
- 표면 형광 현미경하는 40X 대물 렌즈와 CCD 카메라를 사용하여 각각의 칩에 대한보기의 5 랜덤 필드 (321 × 240 μm의 2)의 현미경 이미지를 형광 가져 가라.
- 이러한 ImageJ에 같은 화상 처리 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에 대한 형광 강도를 얻었다. ImageJ에에서 "프로세스"메뉴에서 "빼기 배경"기능을 사용하고 "분석"메뉴의 "설정 측정"창에서 "통합 밀도"를 선택합니다. 형광 강도를 얻기 위해 "분석"메뉴에서 "측정"을 수행.
- 다음 식에 따라 생물막 제거 효율을 계산한다 : 100 % × (제어 칩 I를 - 처리 칩 Ⅰ) / I 계산 된 형광 강도이다 (제어 칩 I).
- 제거 효율과 표준 편차 평균을 구합니다. 에 사용각각의 경우에 대해 최소 4 칩입니다.
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Representative Results
CO 2 에어로졸은 P.을 제거하는 데 사용 된 푸티은 SUS304 표면 (그림 1)에서 생물막. 표면의 대부분은 성장의 24 시간 후, 바이오 필름으로 덮여 있었다. 생물막의 대부분은 CO 2 에어로졸 (도 2)를 이용하여 제거 하였다. 예상대로,도 3은 증가 CO 2 에어로졸 처리 시간 등의 생물막 제거 효율의 증가를 나타낸다. 88 초의 처리 시간의 경우, 제거 효율은 97.74 %와 함께 각각 질소 퍼지없이 98.29 %로 높은 것으로 측정되었다. 공기 온도가 23 ~ 24 °의 C이고 세정 실험을 수행했을 때의 상대 습도는 26~50%이었다.
CO 2 에어로졸을 이용하여 바이오 필름의 제거를 나타내는도 1 회로도. 에어로졸이 생성된다 고압 CO2 가스는 단열 벤츄리 노즐 (0.4 mm)를 통해 팽창 가스의 온도가 급격히 떨어질 때. 이러한 고속 CO 2 에어로졸은 생물막 피복 표면에 적용된다. 질소 퍼지를 사용하는 경우, N 2 가스가 중앙 CO 2 노즐을 둘러싼 8 개의 노즐을 통해 공급된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
24 시간 성장 P. 그림 2. 형광 현미경 이미지 304 스테인레스 스틸 칩 푸티 생물막이. 칩 질소 퍼지없이 CO 2 가지 처리 회 에어로졸 (0, 16, 40, 88 초)으로 처리 하였다. 단색 화상을 녹색으로하고, 하얀 스케일 바는 50㎛의를 나타낸다.추신 : //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
P. 그림 3. 제거 효율 와 질소 퍼지없이 다른 CO 2 에어로졸 치료 시간을 가진 304 스테인레스 강 표면의 바이오 필름은 푸티. 제거 효율은 생물막의 형광 강도에 기초하여 산출 하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
