Protocol
1. Подготовка поверхности для биопленки
- Вырезать 1 мм толщиной 304 пластины из нержавеющей стали в щепу (10 × 10 мм 2) с механическим резаком.
- Выполнение ультразвуковой очистки щепы в ацетоне, метаноле, и деионизированную (ДИ) воды последовательно в течение 10 минут каждый. Используйте растворитель резистентных контейнер, изготовленный из веществ, таких как стекло, для удаления органических загрязнений.
- Ополосните чипы с проточной DI воды в течение 3-5 сек.
- Сухие чипы с использованием N 2 поток газа в течение 3-5 сек.
2. Подготовка бактериальной культуры
- Возьмите P. putida KT2440 (любезно предоставленный проф Sung Kuk Ли, UNIST, Южная Корея) запаса , хранящегося в -80 ° C морозильнике.
- Разморозить при комнатной температуре, после 1 мин, а верхний слой замороженного исходного раствора превращается в слякоть. Погружают петлю в расплавленном слое исходного раствора.
- Используйте эту петлю, чтобы полоса бактерий на Лурия в-Bertani (LB) пластины, содержащей 1,5% агара.
- Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 30 ° C, чтобы расти колонии бактерий.
- Выберите одну колонию из планшета с использованием свежей петли.
- Инокулируйте 10 мл LB бульона в конической трубе 50 мл с помощью петли, содержащей единственную бактериальную колонию.
- Инкубируйте бульон в качалке инкубаторе в течение 16 часов при температуре 30 ° C и 160 оборотов в минуту.
3. биопленки на поверхности
- Встреча каждого из готовых чипов с помощью пинцета и окунуть в 70% этаноле в 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы стерилизовать поверхность каждого чипа. Убедитесь в том, что чипы удерживаются с помощью пинцета во время погружения.
- Dip каждый чип в автоклавного DI воде и в LB бульоне последовательно, 5 раз в течение 1-2 сек каждый, чтобы удалить остатки этанола.
- Поместите эти фишки в 6-луночные культуральные планшеты с 2-х микросхемах и 5 мл LB бульона на лунку.
- не Развести бактериальной культуры до концентрации в бульоне LB достигает8 × 10 8 клеток / мл (оптическая плотность при 600 нм: ~ 0,8).
- Инокулируйте каждую лунку 50 мкл разведенного бактериальной культуры.
- Инкубируйте пластин при 30 ° С без встряхивания в течение 24 ч для образования биопленки.
Очистка 4. CO 2 Аэрозоль
- Dip биопленка сформированных чипов в 10 мМ буфере ацетата аммония (летучие) в 5 раз, чтобы удалить слабо связаны и планктонных бактерий.
- Сушат эти чипы в шкафу биологической безопасности, где воздух проходит мягко.
- Сразу после высыхания, поместите чип на место погрузки, который находится в 20 мм от CO 2 сопла вдоль оси струи. Наклон оси струи под углом 40 °.
- Установите Застой давление СО 2 и N 2 газа до 5,3 МПа и 0,7 МПа соответственно, с помощью регуляторов давления газа.
- Нанесите аэрозольную струю на центральную часть чипа. Белые аэрозоли , включая твердый CO 2 должнобыть видимым. Поворот "на" электромагнитный клапан для СО 2 в течение 5 секунд, а затем включите его "выключено" в течение 3 сек (цикл: 8 сек) периодически используя вручную управляемый выключатель. Если продувку азотом необходимо использовать, включите электромагнитный клапан для непрерывной подачи N 2.
- Лечить чипы с СО 2 аэрозолями для 16, 40 и 88 сек и без азота чисток. Сохранил чипы без лечения в качестве отрицательного контроля.
5. Анализ эффективности для удаления
- Приготовьте 1 мкМ зеленая флуоресценция нуклеиновой кислоты пятно (длина волны возбуждения / испускания: 480/500 нм) в деионизированной воде для окрашивания бактериальных клеток на контроле и аэрозольных обработанных чипов.
- Поместите фишки в красящим раствором.
- Инкубируйте чипы в инкубаторе без света при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
- После инкубации осторожно прополоскать стружку с проточной водой DI для удаления избытка флуоресцентного красителя.
- Сушат чипы Wiго N 2 потока газа.
- Возьмите флюоресценции микроскопические изображения 5 случайных полей зрения (321 × 240 мкм 2) для каждого чипа с помощью эпифлуоресцентной микроскопа, 40X объектив, и камера CCD.
- Получить интенсивности флуоресценции для каждого изображения, используя программное обеспечение для обработки изображений, такие как ImageJ. В ImageJ, используйте функцию "Вычитание фона" в меню "Process" и выберите "интегральной плотности" в окне "Установка измерений" в меню "Analyze". Выполните "измерения" в меню "Анализ", чтобы получить интенсивность флуоресценции.
- Рассчитать эффективность удаления биопленки в соответствии со следующей формулой: 100% × (I чипсов контрольных - I обработанных чипсов) / (I чипсов управления), где I является вычисленной интенсивности флуоресценции.
- Получить среднее эффективность удаления и стандартные отклонения. Использование вНаименее 4 фишки для каждого случая.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CO 2 аэрозолей были использованы для удаления P. putida биопленки из SUS304 поверхностей (рисунок 1). Большая часть поверхности были покрыты биопленки после 24 часов роста. Большая часть биопленки была удалена с помощью СО 2 аэрозолей (рисунок 2). Как и следовало ожидать, на рисунке 3 показано увеличение эффективности удаления биопленки как время обработки аэрозольный СО 2 увеличивается. За время лечения 88 сек, эффективность удаления была определена выше, 97,74% и 98,29%, с использованием и без продувки азотом, соответственно. Температура воздуха 23-24 ° С и относительная влажность была 26-50%, когда были проведены эксперименты по очистке.
Рисунок 1. Схема , показывающая удаление биопленки с использованием CO 2 аэрозолей. Аэрозоли генерируются при высоком давлении СО 2 газ адиабатически расширяется через сопло Вентури (0,4 мм) и температура газа резко падает. Эти высокоскоростные СО 2 Аэрозоли наносят на поверхность , покрытую биопленки. Когда продувочный азот используется, N 2 газ подается через 8 форсунок , окружающих центральный CO 2 сопла. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Флуоресцентные микроскопические изображения для 24-ч-выращенного P. putida биопленки на 304 фишек из нержавеющей стали. Чипы обрабатывали CO 2 для аэрозолей разное время лечения (0, 16, 40 и 88 сек) без азота чисток. Черно-белые изображения были окрашены в зеленый цвет, а белые полоски показывают масштаб 50 мкм.пс: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Эффективность удаления для P. putida биопленки из 304 поверхностей из нержавеющей стали с различными временами CO 2 обработки аэрозоля, с и без азота чисток. Эффективность удаления были рассчитаны на основе интенсивности флуоресценции биопленки. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
