Protocol
1.表面的制备生物膜形成
- 切断用机械切刀1毫米厚的304不锈钢板成芯片（10×10毫米2）。
- 每10分钟进行的丙酮，水依次甲醇和去离子（DI）芯片的超声波清洗。使用的耐溶剂容器，制成的物质如玻璃，以除去有机污染物。
- 有3-5秒的流动DI水冲洗芯片。
- 使用3-5秒的 N 2气流干燥该芯片。
2.细菌培养的制备
- 以一个P.恶臭假单胞菌 KT2440储存在-80℃深冷冻股票（由宋谷李教授，UNIST，韩国友情提供）。
- 解冻在室温下1分钟后，与冷冻储液的顶层变为融雪。浸入一个循环到原液的熔化层。
- 使用此循环连胜细菌到卢里亚含有1.5％琼脂-Bertani（LB）板上。
- 过夜孵育所述板在30℃下生长的细菌菌落。
- 使用一个新的循环板挑取单个菌落。
- 接种10毫升LB肉汤中在与含有单菌落环路50ml锥形管中。
- 孵育在振荡培养箱的肉汤在30℃下16小时和160的转速。
3.表面生物膜的形成
- 拿起所制备的各芯片用镊子和在70％的乙醇蘸5次，每次1-2秒，以消毒每个芯片的表面上。确保芯片保持与浸渍期间镊子。
- 浸在蒸压DI水和肉汤LB依次每一个芯片，5次，每次1-2秒，以去除残留的乙醇。
- 放置在6孔培养板，这些芯片具有2芯片和每孔5ml的LB肉汤。
- 稀释细菌培养，直到在LB肉汤达到的浓度8×10 8个细胞/ ml（在600nm波长的光密度：〜0.8）。
- 用50μl稀释的细菌培养物接种每个孔中。
- 孵育在30℃下将板不摇动用于形成生物膜的24小时。
4. 二氧化碳汽清洗
- 浸生物膜形成芯片在10mM乙酸铵缓冲液（挥发性的）5次，以去除松散附着和浮游细菌。
- 在生物安全柜，那里的空气流动婉转干这些芯片。
- 立即干燥后，放置在装载位置，这是由沿射流轴线的CO 2的喷嘴20mm的芯片。倾斜射流轴线以40°角。
- 设置CO 2和N 2气体的停滞压力分别5.3兆帕和0.7兆帕，利用气体压力调节器。
- 应用该气溶胶喷射到芯片的中心部分。白色的气溶胶包括固体二氧化碳应是可见的。转“的”为二氧化碳 5秒电磁阀，然后将其“关闭”3秒（周期：8秒）定期使用手动控制开关。如果氮气吹扫需要使用，打开该电磁阀的N 2的连续供给。
- 用CO处理芯片2气溶胶16，40，和88秒的使用和不使用氮气清洗。芯片保留不经处理作为阴性对照。
5.分析去除效率
- 制备1μM的绿色荧光核酸染料（激发/发射波长：500分之480纳米）在DI水中进行染色上的控制和气溶胶处理的芯片的细菌细胞。
- 放置芯片在染色溶液。
- 孵育在培养箱芯片没有光在37℃下30分钟。
- 孵育后，轻轻地用流动的去离子水去除过量的荧光染料冲洗芯片。
- 擦干芯片无线第N 2气的流动。
- 取荧光用落射荧光显微镜，40X物镜，和CCD照相机对每个芯片的视图5随机视野（321×240微米2）的显微图像。
- 获得如ImageJ的每个图像使用图像处理软件的荧光强度。在ImageJ的，使用“扣除背景”功能，在“进程”菜单，在“分析”菜单中的“设置测量”窗口中选择“集成密度”。执行“测量”中的“分析”菜单获得的荧光强度。
- 根据下列公式计算生物膜去除效率：100％×（的控制芯片我 - 我处理芯片）/（Ⅰ的控制芯片），其中I是计算的荧光强度。
- 获得平均去除率和标准偏差。在使用至少4芯片每种情况。
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Representative Results
二氧化碳气溶胶被用来去除P.恶臭从SUS304表面（ 图1）生物膜。大部分表面被后生长24小时覆盖有生物膜。大多数生物膜的是使用二氧化碳气溶胶（ 图2）除去。正如预期的那样， 图3示出生物膜去除效率为二氧化碳气溶胶处理时间增加的增加。为88秒的处理时间，除去效率被确定为高达97.74％和有和没有氮气吹扫，分别98.29％。空气的温度为23-24℃，相对湿度为26-50％时在清洁实验。
图1.示意图，显示除去使用的 CO 2气溶胶生物膜，产生气溶胶当高压的 CO 2气体绝热通过文丘里喷嘴英寸（0.4毫米）膨胀和气体温度迅速下降。这些高速二氧化碳气溶胶被施加到覆盖有生物膜的表面。当使用氮气吹扫，N 2气体通过围绕中央CO 2的喷嘴8喷嘴提供。 请点击此处查看该图的放大版本。
24小时生长P.图2.荧光显微图像304不锈钢片恶臭假单胞菌生物膜。该芯片用无氮吹扫的 CO 2气溶胶不同处理时间（0，16，40，和88秒）处理。单色图像彩色绿色和白色的刻度条表示50微米。PS：//www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3. P.去除率来自具有不同的 CO 2气雾剂治疗时间，有和没有氮气吹扫的304不锈钢表面恶臭假单胞菌生物膜。基于所述生物膜的荧光强度计算的去除效率。误差条表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
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