Protocol
Biofilm गठन के लिए सतह के 1. तैयारी
- एक यांत्रिक कटर के साथ चिप्स में 1 मिमी मोटी 304 स्टेनलेस स्टील प्लेट (10 × 10 मिमी 2) में कटौती।
- 10 मिनट प्रत्येक के लिए एसीटोन, मेथनॉल, और विआयनीकृत (डीआई) पानी क्रमिक रूप में चिप्स की अल्ट्रासोनिक सफाई प्रदर्शन करना। एक विलायक प्रतिरोधी कंटेनर, कांच जैसे पदार्थों का इस्तेमाल किया, जैविक प्रदूषण को दूर करने के लिए।
- 3-5 सेकंड के लिए डि पानी बहने के साथ चिप्स कुल्ला।
- 3-5 सेकंड के लिए एन 2 गैस के प्रवाह का उपयोग चिप्स सूखी।
2. जीवाणु संस्कृति की तैयारी
- एक पी लो putida KT2440 शेयर एक -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में संग्रहीत (कृपया प्रो सुंग Kuk ली, UNIST, दक्षिण कोरिया द्वारा प्रदान की)।
- 1 मिनट के बाद कमरे के तापमान पर पिघलना, और जमे हुए शेयर समाधान के ऊपर परत कीचड़ में बदल जाता है। शेयर समाधान का पिघला परत में एक पाश विसर्जित कर दिया।
- एक Luria पर बैक्टीरिया लकीर को यह लूप का प्रयोग करें-Bertani (पौंड) प्लेट 1.5% अगर युक्त।
- बैक्टीरियल कालोनियों विकसित करने के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर थाली सेते हैं।
- प्लेट एक ताजा पाश का उपयोग करने से एक भी कॉलोनी उठाओ।
- एकल बैक्टीरियल कॉलोनी युक्त पाश के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में लेग शोरबा के 10 मिलीलीटर टीका लगाना।
- 30 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा और 160 आरपीएम के लिए एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में शोरबा सेते हैं।
3. सतह पर biofilm गठन
- प्रत्येक चिप की सतह बाँझ 1-2 सेकंड प्रत्येक के लिए चिमटी के साथ तैयार चिप्स के प्रत्येक उठाओ और, 5 बार उन्हें 70% इथेनॉल में डुबकी। सुनिश्चित करें कि चिप्स की सूई के दौरान चिमटी के साथ आयोजित की जाती हैं।
- Autoclaved डि पानी में और लेग शोरबा क्रमिक रूप में प्रत्येक चिप, 1-2 सेकंड प्रत्येक के लिए 5 बार, शेष इथेनॉल दूर करने के लिए डुबकी।
- 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में इन चिप्स 2 चिप्स और 5 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से लेग शोरबा के साथ रखें।
- लेग शोरबा इलाकों में एकाग्रता जब तक बैक्टीरियल संस्कृति पतला8 × 10 8 कोशिकाओं / एमएल (600 एनएम तरंगदैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व: ~ 0.8)।
- पतला जीवाणु संस्कृति के 50 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक टीका लगाना।
- biofilms के गठन के लिए 24 घंटे के लिए मिलाते हुए बिना 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं।
4. सीओ 2 एयरोसोल सफाई
- 10 मिमी अमोनियम एसीटेट बफर में biofilm गठन चिप्स डुबकी (अस्थिर) 5 बार शिथिल जुड़ी है और planktonic बैक्टीरिया को दूर करने के लिए।
- एक जैव सुरक्षा कैबिनेट, जहां हवा हल्का बहती है में इन चिप्स सूखी।
- इसके तत्काल बाद सुखाने के बाद, लोडिंग जगह है, जो जेट की धुरी के साथ सीओ 2 नोक से 20 मिमी है पर एक चिप जगह है। एक 40 डिग्री के कोण करने के लिए जेट अक्ष झुकाएँ।
- , 5.3 और 0.7 एमपीए एमपीए क्रमश: सीओ 2 और एन 2 गैस के ठहराव के दबाव सेट गैस दबाव नियामकों का उपयोग कर।
- चिप के मध्य भाग पर एयरोसोल जेट लागू करें। ठोस सीओ 2 चाहिए सहित व्हाइट एयरोसौल्ज़दिखाई हो। "" पर 5 सेकंड के लिए सीओ 2 के लिए solenoid वाल्व बारी है, और फिर इसे 3 सेकंड के लिए "बंद" बारी (चक्र: 8 सेकंड) समय समय पर एक मैन्युअल रूप से नियंत्रित स्विच का उपयोग। एक नाइट्रोजन शुद्ध इस्तेमाल किया जा करने की जरूरत है, तो एन 2 की एक सतत आपूर्ति के लिए solenoid वाल्व पर बारी।
- 16, 40 के लिए 2 एयरोसौल्ज़ सीओ के साथ चिप्स का इलाज है, और साथ और नाइट्रोजन purges के बिना 88 सेकंड। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इलाज के बिना चिप्स को बनाये रखें।
5. हटाने दक्षता के लिए विश्लेषण
- नियंत्रण और एयरोसोल इलाज चिप्स पर बैक्टीरियल कोशिकाओं दाग डि पानी में: 1 माइक्रोन हरी प्रतिदीप्ति न्यूक्लिक एसिड दाग (480/500 एनएम उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य) तैयार करें।
- धुंधला समाधान में चिप्स रखें।
- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश के बिना एक मशीन में चिप्स सेते हैं।
- ऊष्मायन के बाद, धीरे डि पानी बहने अत्यधिक फ्लोरोसेंट रंजक को दूर करने के साथ चिप्स कुल्ला।
- सूखी चिप्स वाईवें एन 2 गैस का प्रवाह।
- एक epifluorescence माइक्रोस्कोप, एक 40x उद्देश्य लेंस, और एक सीसीडी कैमरा का उपयोग कर प्रत्येक चिप के लिए दृश्य के 5 यादृच्छिक क्षेत्रों (321 × 240 माइक्रोन 2) के सूक्ष्म छवियों प्रतिदीप्ति ले लो।
- ImageJ जैसे एक इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रत्येक छवि के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करते हैं। ImageJ में, "प्रक्रिया" मेनू में "घटाना पृष्ठभूमि" समारोह का उपयोग करें, और "विश्लेषण" मेनू में "एकीकृत घनत्व" का चयन करें "सेट माप" विंडो में। प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त करने के लिए "विश्लेषण" मेनू में "मापन" करो।
- निम्न सूत्र के अनुसार biofilm हटाने दक्षता की गणना: 100% × (नियंत्रण चिप्स का मैं - इलाज के चिप्स का मैं) / (नियंत्रण चिप्स का मैं) है, जहां मैं गणना की प्रतिदीप्ति तीव्रता है।
- औसत हटाने क्षमता और मानक विचलन प्राप्त करते हैं। पर प्रयोग करेंप्रत्येक मामले के लिए कम से कम 4 चिप्स।
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Representative Results
सीओ 2 एयरोसौल्ज़ पी दूर करने के लिए इस्तेमाल किया गया putida SUS304 सतहों (चित्रा 1) से biofilms। सतहों के अधिकांश विकास के 24 घंटे के बाद biofilm के साथ कवर किया गया। Biofilm की सबसे सह का उपयोग कर 2 एयरोसौल्ज़ (चित्रा 2) हटा दिया गया था। जैसी कि उम्मीद थी, चित्रा 3 सीओ 2 एयरोसोल उपचार के समय में वृद्धि के रूप biofilm हटाने दक्षता में वृद्धि का पता चलता है। 88 सेकंड के इलाज के समय के लिए, हटाने दक्षता 97.74% और के साथ और एक नाइट्रोजन शुद्ध बिना क्रमश: 98.29% के रूप में उच्च किया जा करने के लिए निर्धारित किया गया था। हवा का तापमान 23-24 डिग्री सेल्सियस था और सापेक्ष आर्द्रता 26-50% जब सफाई प्रयोगों का आयोजन किया गया था।
चित्रा 1. योजनाबद्ध एक biofilm सीओ 2 एयरोसौल्ज़ का उपयोग कर के हटाने दिखा। एयरोसौल्ज़ उत्पन्न कर रहे हैं जब उच्च दबाव सीओ 2 गैस adiabatically एक वेंचुरी नोक (0.4 मिमी) के माध्यम से विस्तार किया है और गैस तापमान तेजी से चला जाता है। इन उच्च गति सीओ 2 एयरोसौल्ज़ एक सतह एक biofilm के साथ कवर करने के लिए लागू कर रहे हैं। जब एक नाइट्रोजन शुद्ध प्रयोग किया जाता है, एन 2 गैस 8 आसपास के केंद्रीय सीओ 2 नोक नलिका के माध्यम से आपूर्ति की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. प्रतिदीप्ति 24 घंटे की देसी पी लिए सूक्ष्म छवियों 304 स्टेनलेस स्टील चिप्स पर putida biofilms। चिप्स नाइट्रोजन purges बिना अलग उपचार समय के लिए सीओ 2 एयरोसौल्ज़ (0, 16, 40, और 88 सेकंड) के साथ इलाज किया गया। मोनोक्रोम छवियों हरे रंग थे, और सफेद स्केल सलाखों 50 माइक्रोन से संकेत मिलता है।पुनश्च: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. पी के लिए हटाने क्षमता अलग सीओ 2 एयरोसोल उपचार बार, के साथ और नाइट्रोजन purges के बिना साथ 304 स्टेनलेस स्टील सतहों से putida biofilms। हटाने क्षमता biofilms के प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर गणना की गई। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
