Protocol
1. Utarbeidelse av Surface for biofilmdannelse
- Klipp 1 mm tykk 304 rustfrie stålplater i chips (10 × 10 mm 2) med en mekanisk cutter.
- Utføre ultrasonisk rengjøring av brikker i aceton, metanol og avionisert (DI) vann i rekkefølge i 10 minutter hver. Bruke en løsningsmiddelresistent beholder, fremstilt av stoffer som glass, for å fjerne organiske urenheter.
- Skyll chips med rennende DI vann i 3-5 sek.
- Tørk chips med N 2 gasstrømmen for 3-5 sek.
2. Fremstilling av bakteriekultur
- Ta en P. putida KT2440 (vennlig levert av Prof. Sung Kuk Lee, unist, Sør-Korea) lager lagret i en -80 ° C dypfryser.
- Tine ved romtemperatur etter 1 min, og det øverste laget av den frosne stamoppløsning blir til sørpe. Dyppes en løkke inn i det smeltede sjikt av stamløsningen.
- Bruk denne sløyfen til strek bakteriene på en Luria-Bertani (LB) plate inneholdende 1,5% agar.
- Platen inkuberes over natten ved 30 ° C for å dyrke bakteriekolonier.
- Plukk en enkelt koloni fra platen med en ny sløyfe.
- Inokulere 10 ml LB-næringsløsning i et 50 ml konisk rør med sløyfen som inneholder én bakteriell koloni.
- Inkuber kokes i en risteinkubator i 16 timer ved 30 ° C og 160 rpm.
3. biofilmdannelse på overflaten
- Plukke opp hver av de fremstilte chips med pinsett og dyppe dem i 70% etanol 5 ganger i 1-2 sekunder hver, for å sterilisere overflaten av hver brikke. Sørg for at brikkene holdes med pinsett under dipping.
- Dypp hver brikke i Autoclaved DI vann og i LB buljong sekvensielt, 5 ganger for 1-2 sekunder hver, for å fjerne gjenværende etanol.
- Plasser disse brikkene i 6-brønners kulturplater med 2 sjetonger og 5 ml LB buljong per brønn.
- Fortynn bakteriekultur inntil konsentrasjonen i LB-næringsløsning delene8 x 10 8 celler / ml (optisk tetthet ved 600 nm bølgelengde: ~ 0,8).
- Inokuler hver brønn med 50 ul av den fortynnede bakteriekultur.
- Platene inkuberes ved 30 ° C uten risting i 24 timer for dannelse av biofilm.
4. CO 2 Aerosol Rengjøring
- Dypp biofilm-formet chips i 10 mM ammonium acetat buffer (flyktige) 5 ganger for å fjerne løst festet og planktoniske bakterier.
- Tørk disse brikkene i en biosikkerhet kabinett, der luft strømmer mildt.
- Umiddelbart etter tørking, plassere en chip på laste stedet, som er 20 mm fra CO 2 munnstykket langs aksen av strålen. Vippe jet-aksen til en 40 ° vinkel.
- Sett stagnasjon presset av CO 2 og N 2 gass til 5,3 MPa og 0,7 MPa, henholdsvis ved hjelp av gass-trykk regulatorer.
- Påfør aerosol trålen mot den sentrale delen av brikken. Hvite aerosoler inkludert solid CO 2 børvære synlig. Slå "på" magnetventilen for CO 2 i 5 sek, og deretter slå den "off" i 3 sekunder (syklus: 8 sek) med jevne mellomrom ved hjelp av en manuelt styrt bryter. Hvis en nitrogenspyling må brukes, slå på magnetventilen for en kontinuerlig tilførsel av N2.
- Unn chips med CO 2 aerosoler for 16, 40, og 88 sek med og uten nitrogen utrenskninger. Beholde chips uten behandling som negative kontroller.
5. Analyse for fjerning Efficiency
- Forbered 1fiM grønn fluorescens nukleinsyre flekken (eksitasjon / emisjon bølgelengde: 480/500 nm) i DI vann å farge bakterieceller på kontroll og aerosol-behandlet chips.
- Plasser sjetongene i fargeløsning.
- Inkuber brikker i en inkubator uten lys ved 37 ° C i 30 minutter.
- Etter inkubering forsiktig skylle flisen med rennende avionisert vann for å fjerne overdreven fluorescerende fargestoff.
- Tørk chips with N2-gasstrøm.
- Ta fluorescens mikroskopiske bilder av 5 tilfeldige synsfelt (321 × 240 mikrometer 2) for hver brikke ved hjelp av en epifluorescence mikroskop, en 40X objektiv, og et CCD-kamera.
- Skaff fluorescens intensitet for hvert bilde ved hjelp av et bildebehandlingsprogramvare som ImageJ. I ImageJ, bruk "Trekk Bakgrunn" -funksjonen i "Process" -menyen, og velg "Integrated tetthet" i "Set Målinger" -vinduet i "Analyze" -menyen. Gjør "Measurement" i "Analyze" -menyen for å oppnå fluorescens intensitet.
- Beregn biofilm-fjerningseffektivitet i henhold til følgende formel: 100% x (I kontroll chips - I av behandlede chips) / (I i kontroll chips), hvor I er den beregnede fluorescensintensitet.
- Skaff gjennomsnittlig fjerning effektivitet og standardavvik. Bruk påminst 4 brikker for hvert enkelt tilfelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CO 2 aerosoler ble benyttet for å fjerne P. putida biofilm fra SUS304 overflater (figur 1). De fleste av de overflater ble dekket med biofilmen etter 24 timers vekst. Mesteparten av biofilmen ble fjernet ved hjelp av CO 2 aerosoler (figur 2). Som forventet, Figur 3 viser en økning i biofilm fjerningseffektivitet som CO 2 aerosol behandlingstiden økte. For behandlingstid på 88 sekunder, ble den fjerningseffektivitet bestemt til å være så høy som 97,74% og 98,29%, med og uten en nitrogenspyling, respektivt. Lufttemperaturen var 23-24 ° C og den relative fuktighet var 26-50% når rengjøring eksperimenter ble utført.
Figur 1. Skjematisk viser fjerning av en biofilm ved hjelp av CO 2 aerosoler. De aerosoler når høytrykks CO2 gassen adiabatisk ekspandert gjennom en venturi-dyse (0,4 mm) og gasstemperaturen faller raskt. Disse høy hastighet CO 2 aerosoler påføres en overflate dekket med en biofilm. Når en nitrogenrensing brukes, N2 gass leveres gjennom 8 dyser som omgir den sentrale CO 2 dyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fluorescens mikroskopiske bilder for 24-timers-vokst P. putida biofilm på 304 rustfritt stål chips. Sjetongene ble behandlet med CO 2 aerosoler for ulike behandlingstider (0, 16, 40, og 88 sek) uten nitrogen utrenskninger. Monokrome bilder ble farget grønn, og de hvite skala barer indikerer 50 mikrometer.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. fjerning effektivitet for P. putida biofilm fra 304 rustfritt stål overflater med ulike CO 2 aerosol behandlingstider, med og uten nitrogen utrenskninger. Fjerningen effektivitet ble beregnet på grunnlag av fluorescensstyrkene av biofilm. Feilstolpene representerer standardavvikene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
