Protocol
1. Voorbereiding van de Surface voor Biofilm Formation
- Gesneden 1 mm dikke 304 roestvrij stalen platen tot chips (10 x 10 mm2) met een mechanische cutter.
- Voer ultrasone reiniging van de chips in aceton, methanol, en gedeïoniseerd (DI) water achtereenvolgens gedurende 10 minuten elk. Gebruik een oplosmiddelbestendige bak van stoffen zoals glas, organische verontreiniging te verwijderen.
- Spoel de chips met stromend DI water gedurende 3-5 sec.
- Droog de chips met behulp van N2 gasstroom 3-5 sec.
2. Bereiding bacteriekweek
- Neem een P. putida KT2440 (ter beschikking gesteld door Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Zuid-Korea) voorraad opgeslagen in een -80 ° C diepvriezer.
- Ontdooien bij kamertemperatuur na 1 min, en de bovenste laag van de bevroren voorraad oplossing wendt zich tot slush. Dompel een lus in de gesmolten laag van de voorraadoplossing.
- Gebruik deze lus om streak de bacteriën op een Luria-Bertani (LB) platen die 1,5% agar.
- Incubeer de plaat overnacht bij 30 ° C om de bacteriële kolonies groeien.
- Kies een enkele kolonie van de plaat met behulp van een nieuwe lus.
- Inoculeer 10 ml LB-bouillon in een 50 ml conische buis met de lus met de enkele bacteriële kolonie.
- Incubeer de bouillon in een schudincubator gedurende 16 uur bij 30 ° C en 160 rpm.
3. Biofilm Formation op de Surface
- Pak elk van de bereide chips met een pincet en zal die in 70% ethanol 5 maal gedurende 1-2 seconden elk, om het oppervlak van elke chip steriliseren. Zorg ervoor dat de chips worden gehouden met een pincet tijdens het dompelen.
- Dip elke chip in geautoclaveerd DI-water en in LB bouillon sequentieel, 5 keer voor 1-2 seconden per stuk, om de resterende ethanol te verwijderen.
- Plaats deze chips in 6-well kweekplaten met 2 chips en 5 ml LB-bouillon per putje.
- Verdun de bacteriekweek tot de concentratie in LB bouillon bereikt8 x 10 8 cellen / ml (optische dichtheid bij 600 nm golflengte: ~ 0,8).
- Wordt geënt in elk putje met 50 ul van de verdunde bacteriecultuur.
- Incubeer de platen bij 30 ° C zonder schudden gedurende 24 uur voor de vorming van biofilms.
4. CO 2 Aerosol Cleaning
- Dompel de biofilm gevormd chips in 10 mM ammoniumacetaat buffer (volatiele) 5 tijden te verwijderen losjes verbonden en planktonische bacteriën.
- Droog deze chips in een bioveiligheid kast, waar de lucht stroomt mild.
- Meteen na het drogen plaats een chip op de laadplaats, die 20 mm van de CO 2 mondstuk langs de as van de straal. Kantel de jet-as een hoek van 40 °.
- Stel de stagnatie druk van CO 2 en N 2 gas aan 5,3 MPa en 0,7 MPa, respectievelijk, met behulp van gas-drukregelaars.
- Breng de aërosolstraal op het midden van de chip. Witte aerosolen met inbegrip van de vaste CO 2 moetzichtbaar. "Aan" de magneetklep voor de CO 2 gedurende 5 seconden, en zet hem dan "off" voor 3 seconden (cyclus: 8 sec) regelmatig met een handbediende schakelaar. Als een stikstofspoeling gebruikt moet worden, zet de elektromagnetische klep voor een continue aanvoer van N 2.
- Behandel de chips met CO 2 spuitbussen voor 16, 40 en 88 seconden met en zonder stikstofspoelingen. Behoud chips zonder behandeling als negatieve controles.
5. Analyse voor Removal Efficiency
- Bereid 1 uM groene fluorescentie nucleïnezuur vlek (golflengte excitatie / emissie: 480/500 nm) in DI water om bacteriële cellen op de controle en-aerosol behandelde chips vlekken.
- Plaats de chips in de kleuroplossing.
- Incubeer de chips in een incubator zonder licht bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Na de incubatie, voorzichtig spoel de chips met stromend DI water aan overmatige fluorescerende kleurstof te verwijderen.
- Droog de chips with N 2 gas flow.
- Neem Fluorescentiemicroscopische beelden van 5 willekeurige gezichtsveld (321 × 240 micrometer 2) voor elke chip met behulp van een epifluorescentiemicroscoop, een 40X objectief, en een CCD-camera.
- Het verkrijgen van de fluorescentie-intensiteit voor elk beeld met behulp van een beeld processing software zoals ImageJ. In ImageJ, gebruik dan de "Aftrekken Background" functie in het menu "Actie", en selecteer "Integrated density" in het venster "Set Metingen" in de "Analyze" menu. Doe de "Meting" in de "Analyze" menu om de fluorescentie-intensiteit te verkrijgen.
- Bereken de biofilm verwijderingsefficiëntie volgens de volgende formule: 100% x (I stuurchips - I behandelde chips) / (I stuurchips), waarin I de berekende fluorescentie-intensiteit.
- Het verkrijgen van de gemiddelde verwijdering efficiëntie en standaarddeviaties. gebruik opminstens 4 chips voor elke zaak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CO 2 spuitbussen werden gebruikt om de P verwijderen putida biofilms uit SUS304 oppervlakken (figuur 1). De meeste oppervlakken zijn bedekt met de biofilm na 24 uur groei. De meeste van de biofilm werd verwijderd gebruikend CO 2 aerosolen (figuur 2). Zoals verwacht, Figuur 3 toont een verhoging van biofilms efficiëntie CO 2 aerosol behandelingstijd verhoogd. Voor de behandelingstijd van 88 seconden werd de verwijderingsefficiëntie bepaald zo hoog als 97,74% en 98,29% met en zonder stikstofspoeling bepaald op resp. De luchttemperatuur 23-24 ° C en de relatieve luchtvochtigheid was 26-50% bij de reiniging experimenten uitgevoerd.
Figuur 1. Schematische toont de verwijdering van een biofilm behulp CO 2 aërosolen. De aerosolen wanneer hoge druk CO 2 gas adiabatisch wordt uitgebreid door middel van een venturi nozzle (0,4 mm) en de gas temperatuur daalt snel. Deze snelle CO 2 aerosols worden aangebracht op een oppervlak bedekt met een biofilm. Wanneer een stikstofspoeling wordt gebruikt, wordt N2 gas geleverd via 8 nozzles rond de centrale CO 2 mondstuk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Fluorescentiemicroscopische foto's voor 24-uurs-grown P. putida biofilms op 304 roestvrijstalen chips. De chips werden behandeld met CO 2 aërosols voor verschillende behandelingstijden (0, 16, 40, en 88 sec) zonder stikstofspoelingen. Monochrome beelden werden groen gekleurd, en de witte schaal staven geven 50 pm.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. verwijderingsrendement voor P. putida biofilms van 304 roestvast stalen oppervlakken met verschillende CO 2 aerosol behandelingstijden, met en zonder stikstofspoelingen. De reinigingsefficiëntie werden berekend op basis van de fluorescentie-intensiteiten van de biofilms. De fout balken geven de standaard afwijkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
