Protocol
1. Vorbereitung der Oberfläche für die Bildung von Biofilmen
- Cut 1 mm dicken 304 Edelstahlplatten in Chips (10 × 10 mm 2) mit einem mechanischen Schneider.
- Führen Ultraschallreinigung der Chips in Aceton, Methanol und deionisiertem (DI) Wasser nacheinander für jeweils 10 min. Verwenden, um einen lösungsmittelbeständigen Behälter, die aus Substanzen wie Glas, organische Verunreinigungen zu entfernen.
- Spülen Sie die Chips mit DI-Wasser für 3-5 sec fließt.
- Trocknen Sie die Chips N 2 Gasfluss für 3-5 sec verwenden.
2. Herstellung der Bakterien-Kultur
- Nehmen Sie einen P. putida KT2440 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Südkorea) Lager gelagert in einem -80 ° C Gefrierschrank.
- Tauen Sie nach 1 min bei Raumtemperatur und die obere Schicht der gefrorenen Stammlösung wird zu Matsch. Tauchen Sie eine Schleife in die geschmolzene Schicht der Stammlösung.
- Verwenden Sie diese Schleife zu Streifen, die Bakterien auf eine Luria-Bertani (LB) Platte, die 1,5% Agar.
- Die Platte über Nacht bei 30 ° C, um die Bakterienkolonien wachsen.
- Wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Platte eine frische Schleife.
- Beimpfen von 10 ml LB-Brühe in einem 50 ml konischen Röhrchen mit der Schleife die einzelnen Bakterienkolonie enthält.
- Inkubieren Sie die Brühe in einem Schüttel-Inkubator für 16 Stunden bei 30 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.
3. Bildung von Biofilmen auf der Oberfläche
- Pick-up jeder der hergestellten Chips mit einer Pinzette und tauchen sie in 70% Ethanol 5 mal für 1-2 sec je, um die Oberfläche jedes Chips zu sterilisieren. Stellen Sie sicher, dass die Chips mit einer Pinzette während des Eintauchens gehalten werden.
- Tauchen Sie jeden Chip in autoklavierten DI-Wasser und in LB-Brühe sequentiell, 5-mal für 1-2 sec je, um die verbleibenden Ethanol zu entfernen.
- Legen Sie diese Chips in 6-Well-Kulturplatten mit 2 Chips und 5 ml LB-Medium pro Vertiefung.
- Verdünne die Bakterienkultur, bis die Konzentration in der LB-Brühe Lauf8 × 10 8 Zellen / ml (optische Dichte bei 600 nm Wellenlänge: ~ 0.8).
- Impfen jede Vertiefung mit 50 ul der verdünnten Bakterienkultur.
- Inkubiere die Platten bei 30 ° C ohne von Biofilmen für 24 h zur Bildung Schütteln.
4. CO 2 Aerosol Reinigung
- Tauchen Sie die Biofilm-gebildeten Chips in 10 mM Ammoniumacetat-Puffer (flüchtig) 5-mal zu entfernen lose befestigt und planktonischen Bakterien.
- Trocknen Sie diese Chips in einem Bio-Sicherheitsschrank, wo die Luft mild fließt.
- Unmittelbar nach dem Trocknen, stellen einen Chip auf dem Ladeplatz, der sich entlang der Achse des Strahls 20 mm von der Düse CO 2 ist. Kippen Sie die Strahlachse auf einen Winkel von 40 °.
- Stellen Sie die Staudrücke von CO 2 und N 2 -Gas auf 5,3 MPa und 0,7 MPa bzw. Gasdruckregler verwendet wird .
- Wenden Sie den Aerosolstrahl auf den zentralen Teil des Chips. Weiß Aerosole einschließlich der festen CO 2 solltesichtbar sein. Schalten "auf" das Magnetventil für CO 2 für 5 Sekunden, und schalten Sie es "off" für 3 sec (Zyklus: 8 sec) in regelmäßigen Abständen einen manuell gesteuerten Schalter. Wenn eine Stickstoff - Spülung verwendet werden muss, schalten das Magnetventil für eine kontinuierliche Zufuhr von N 2.
- Behandeln Sie die Chips mit CO 2 Aerosole für 16, 40 und 88 sec mit und ohne Stickstoffspülungen. Bewahren Sie Chips ohne Behandlung als negative Kontrollen.
5. Analyse für Abscheideleistung
- Bereiten 1 uM grüne Fluoreszenz Nukleinsäurefarbstoff (Anregungs- / Emissionswellenlänge: 480/500 nm) in DI-Wasser zu Bakterienzellen an der Steuerung und Aerosol behandelten Späne färben.
- Legen Sie die Chips in der Färbungslösung.
- Inkubieren der Chips in einem Inkubator ohne Licht bei 37 ° C für 30 min.
- Im Anschluss an die Inkubation spülen Sie vorsichtig die Chips mit DI-Wasser fließt übermäßige fluoreszierenden Farbstoff zu entfernen.
- Trocknen Sie die Chips with N 2 Gasstrom.
- Nehmen Sie fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von 5 zufällige Sichtfelder (321 × 240 & mgr; m 2) für jeden Chip ein Epifluoreszenz - Mikroskop mit einer 40 - fach Objektivlinse und einer CCD - Kamera.
- Besorgen Sie sich die Fluoreszenzintensität für jedes Bild eine Bildverarbeitungssoftware wie ImageJ. In ImageJ und nutzen die "Subtract Background" -Funktion im Menü "Bearbeiten" und wählen Sie "Integrierte Dichte" in der "Set Messungen" Fenster in der "Analyse" -Menü. Haben die "Messung" im "Analyze" Menü, um die Fluoreszenzintensität zu erhalten.
- Berechnen Sie die Biofilmentfernungseffizienz nach der folgenden Formel: 100% × (I Kontrolle Chips - ich der behandelten Chips) / (I von Kontroll - Chips), wo ich die berechneten Fluoreszenzintensität ist.
- Besorgen Sie sich die durchschnittliche Abscheidegrade und Standardabweichungen. Verwenden Sie beimindestens 4-Chips für jeden Fall.
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Representative Results
CO 2 Aerosole wurden verwendet , um die zu entfernen , P. putida Biofilme aus SUS304 Flächen (Abbildung 1). Die meisten der Oberflächen wurden mit dem Biofilm nach 24 h Wachstum bedeckt. Der größte Teil des Biofilms wurde mit der CO 2 Aerosole (Abbildung 2) entfernt. Wie erwartet, 3 zeigt einen Anstieg der Biofilm - Entfernungseffizienz als die erhöhte Aerosolbehandlungszeit CO 2. Für die Behandlungszeit von 88 sec wurde die Entfernungseffizienz so hoch wie 97,74% und 98,29% mit und ohne Stickstoffspülung, jeweils bestimmt. Die Lufttemperatur betrug 23-24 ° C und die relative Luftfeuchtigkeit betrug 26 bis 50%, wenn die Reinigungsversuche durchgeführt wurden.
Abbildung 1 Schematische die Entfernung eines Biofilms unter Verwendung von CO 2 Aerosolen zeigt. Die Aerosole erzeugt bei Hochdruck - CO 2 -Gas wird adiabatisch durch eine Venturi - Düse (0,4 mm) expandiert und die Gastemperatur fällt schnell. Diese Hochgeschwindigkeits CO 2 Aerosolen auf eine Oberfläche aufgetragen mit einem Biofilm bedeckt. Wenn eine Stickstoffspülung verwendet wird, N 2 -Gas durch 8 Düsen rund um das zentrale CO 2 Düse geliefert wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Fluoreszenzmikroskopische Bilder für 24-Stunden-grown P. putida Biofilm auf Edelstahl 304 Chips. Die Chips wurden für verschiedene Behandlungszeiten mit CO 2 behandelt Aerosolen (0, 16, 40 und 88 sec) ohne Stickstoffspülungen. Monochrome Bilder wurden grün gefärbt, und die weißen Skala Balken zeigen 50 & mgr; m.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Entfernungseffizienzen für die P. putida Biofilme von den 304 rostfreien Stahloberflächen mit unterschiedlichen CO 2 Aerosolbehandlungszeiten mit und ohne Stickstoffspülungen. Die Entfernungseffizienzen wurden auf der Basis der Fluoreszenzintensitäten der Biofilme berechnet. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
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