Protocol
1. Préparation de la surface pour la formation du biofilm
- Couper 1 mm d'épaisseur , 304 plaques d'acier inoxydable en copeaux (10 x 10 mm 2) avec un dispositif de coupe mécanique.
- Effectuer le nettoyage par ultrasons des puces dans de l'acétone, du méthanol et déionisée (DI) de manière séquentielle de l'eau pendant 10 minutes à chaque fois. Utiliser un conteneur résistant aux solvants, composé de substances telles que le verre, pour éliminer la contamination organique.
- Rincer les puces avec de l'eau DI courante pendant 3-5 sec.
- Sécher les puces utilisant N 2 flux de gaz pendant 3-5 sec.
2. Préparation de la culture bactérienne
- Prenez un P. putida KT2440 (aimablement fourni par le professeur Sung Kuk Lee, UNIST, Corée du Sud) actions stockées dans un -80 ° C congélateur.
- Décongeler à la température ambiante après 1 min, et la couche supérieure de la solution de stock congelé se transforme en neige fondante. Immergez une boucle dans la couche fondue de la solution de stock.
- Utilisez cette boucle pour strie les bactéries sur un Luria-Bertani Plaque (LB) contenant 1,5% d'agar.
- Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C pour faire croître les colonies bactériennes.
- Choisissez une seule colonie de la plaque en utilisant une boucle fraîche.
- Inoculer 10 ml de bouillon LB dans un tube conique de 50 ml avec la boucle contenant la seule colonie bactérienne.
- Incuber le bouillon dans un incubateur à agitation pendant 16 heures à 30 ° C et 160 rpm.
3. Formation biofilm sur la surface
- Prenez chacune des puces préparées avec des pincettes et les tremper dans 70% d'éthanol 5 fois pendant 1-2 secondes chacune, pour stériliser la surface de chaque puce. Veiller à ce que les copeaux sont maintenus avec des pincettes pendant le trempage.
- Tremper chaque puce dans l'eau DI autoclavée et bouillon LB séquentiellement, 5 fois pour 1-2 sec chacun, pour évacuer le reste de l'éthanol.
- Placez ces puces dans des plaques de culture à 6 puits avec 2 puces et 5 ml de bouillon LB par puits.
- Diluer la culture bactérienne jusqu'à ce que la concentration dans le bouillon atteint LB8 × 10 8 cellules / ml (densité optique à 600 nm de longueur d' onde: ~ 0,8).
- Inoculer chaque puits avec 50 ul de la culture bactérienne diluée.
- Incuber les plaques à 30 ° C sans agitation pendant 24 heures pour la formation de biofilms.
Nettoyage 4. CO 2 Aérosol
- Tremper les copeaux de biofilm formé dans un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM (volatils) 5 fois pour éliminer vaguement attachés et bactéries planctoniques.
- Sécher ces puces dans une enceinte de sécurité biologique, où l'air circule légèrement.
- Immédiatement après le séchage, placer une puce sur le lieu de chargement, qui est de 20 mm de la buse CO 2 le long de l'axe du jet. Inclinez l'axe du jet à un angle de 40 °.
- Régler la pression de stagnation du CO2 et du N2 gazeux à 5,3 MPa et 0,7 MPa, respectivement, en utilisant des régulateurs de pression des gaz.
- Appliquer le jet d'aérosol sur la partie centrale de la puce. Aérosols blancs , y compris le CO 2 solide devraitêtre visible. Tourner "sur" l'électrovanne pour le CO 2 pendant 5 secondes, puis remettez- le "off" pendant 3 sec (cycle de : 8 sec) en utilisant périodiquement un interrupteur commandé manuellement. Si une purge d'azote doit être utilisé, allumer l'électrovanne pour une alimentation continue de N2.
- Traiter les copeaux avec du CO 2 pour aérosols 16, 40 et 88 secondes , avec ou sans purge d'azote. Maintenir des puces sans traitement comme témoins négatifs.
5. Analyse de l'efficacité de suppression
- Préparer 1 uM colorant d'acide nucléique fluorescence verte (excitation / émission de longueur d'onde: 480/500 nm) dans l'eau DI pour colorer les cellules bactériennes sur le contrôle et les puces d'aérosol traité.
- Placer les morceaux dans la solution de coloration.
- Incuber les puces dans un incubateur sans lumière à 37 ° C pendant 30 min.
- Après l'incubation, rincer délicatement les morceaux avec de l'eau DI circulant pour éliminer un colorant fluorescent excessive.
- Sécher les puces wie N 2 flux de gaz.
- Prenez fluorescence images microscopiques de 5 champs aléatoires de vue (321 × 240 um 2) pour chaque puce en utilisant un microscope à épifluorescence, un objectif 40X, et une caméra CCD.
- Obtenir l'intensité de fluorescence pour chaque image en utilisant un logiciel de traitement d'image tel que ImageJ. Dans ImageJ, utilisez la fonction "Background Soustraire" dans le menu "Process", et sélectionnez "densité intégrée" dans la fenêtre "Définir les mesures" dans le menu "Analyser". Faites la "mesure" dans le menu "Analyser" pour obtenir l'intensité de fluorescence.
- Calculer l'efficacité d'élimination de biofilm selon la formule suivante: 100% × (I jetons de contrôle - I de puces traitées) / (I jetons de contrôle), où I est l'intensité de fluorescence calculée.
- Obtenir la moyenne des rendements d'élimination et les écarts types. Utilisez aumoins 4 jetons pour chaque cas.
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Representative Results
CO 2 aérosols ont été utilisés pour enlever le P. putida biofilms de SUS304 surfaces (figure 1). La plupart des surfaces étaient recouvertes de biofilm après 24 h de croissance. La majeure partie du biofilm a été éliminé en utilisant le CO 2 aérosols (figure 2). Comme on s'y attendait, la figure 3 montre une augmentation de l'efficacité de l' élimination de biofilm que le CO 2 temps de traitement d'aérosol accrue. Pour le temps de 88 secondes de traitement, l'efficacité d'élimination est déterminée comme étant aussi élevé que 97,74% et 98,29%, avec ou sans purge d'azote, respectivement. La température de l'air était de 23 à 24 ° C et l'humidité relative était de 26 à 50% lorsque les essais de nettoyage ont été effectués.
Figure 1. Schéma montrant l'élimination d'un biofilm à l' aide de CO 2 aérosols. Les aérosols sont générés lorsque la haute pression du gaz CO 2 subit une détente adiabatique à travers une buse venturi (0,4 mm) et la température du gaz diminue rapidement. Ces haut-débit de CO 2 aérosols sont appliqués à une surface recouverte d'un biofilm. Quand une purge à l'azote est utilisé, N 2 gazeux est alimenté par 8 buses entourant la centrale CO 2 buse. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Fluorescence images microscopiques pour 24 h cultivés P. biofilms sur putida 304 copeaux d'acier inoxydable. Les copeaux ont été traités avec du CO 2 aérosols pour différentes durées de traitement (0, 16, 40 et 88 sec) sans purges à l'azote. Les images monochromes ont été colorés en vert, et les barres d'échelle blanches indiquent 50 um.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. efficacités pour la suppression de P. putida biofilms sur les surfaces en acier inoxydable 304 avec des temps de traitement en CO 2 d'aérosol, avec ou sans purge d'azote. Les rendements d'élimination ont été calculées sur la base des intensités de fluorescence des biofilms. Les barres d'erreur représentent les écarts - types. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
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