Protocol
1. Preparación de superficies para la formación de biofilm
- Cortar 1 mm de grosor, 304 placas de acero inoxidable en chips (10 × 10 mm 2) con un cortador mecánico.
- Realizar la limpieza por ultrasonidos de los chips en acetona, metanol, y desionizada (DI) secuencialmente agua durante 10 min cada uno. Use un recipiente resistente a los disolventes, hecho de sustancias tales como vidrio, para eliminar la contaminación orgánica.
- Enjuague los chips con un chorro de agua DI durante 3-5 seg.
- Se secan las fichas utilizando el flujo de gas N2 durante 3-5 seg.
2. Preparación del cultivo bacteriano
- Tome una P. putida KT2440 (proporcionado amablemente por el Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Corea del Sur) stock almacenado en un -80 ° C congelador.
- Descongele a temperatura ambiente después de 1 min, y la capa superior de la solución madre congelada se convierte en aguanieve. Sumergir un bucle en la capa derretida de la solución madre.
- Utilice este bucle a la raya a las bacterias en un medio Luria-Bertani placa (LB) que contiene 1,5% de agar.
- Incubar la placa durante la noche a 30 ° C para crecer las colonias bacterianas.
- Elija una única colonia de la placa usando un bucle fresco.
- Inocular 10 ml de caldo LB en un tubo cónico de 50 ml con el bucle que contiene la colonia bacteriana única.
- Incubar el caldo en una incubadora de agitación durante 16 horas a 30 ° C y 160 rpm.
3. La formación de biopelículas en la Superficie
- Recoger cada una de las fichas preparadas con unas pinzas y sumergirlos en un 70% de etanol 5 veces durante 1-2 segundos cada uno, para esterilizar la superficie de cada chip. Asegúrese de que las virutas se llevan a cabo con pinzas durante la inmersión.
- Sumergir cada chip en agua DI autoclave y en LB caldo de forma secuencial, 5 veces durante 1-2 segundos cada uno, para eliminar el etanol restante.
- Colocar estos chips en placas de cultivo de 6 pocillos con 2 chips y 5 ml de caldo LB por pocillo.
- Diluir el cultivo bacteriano hasta que la concentración en los tramos caldo LB8 × 10 8 células / ml (densidad óptica a la longitud de onda 600 nm: ~ 0,8).
- Inocular cada pocillo con 50 l de cultivo bacteriano diluido.
- Incubar las placas a 30 ° C sin agitación durante 24 horas para la formación de biopelículas.
4. Limpieza de CO 2 en aerosol
- Dip los chips de la biopelícula formada en tampón acetato de amonio 10 mM (volátiles) 5 veces para eliminar débilmente unidos y bacterias planctónicas.
- Seque estos chips en una cabina de seguridad biológica, donde el aire fluye suavemente.
- Inmediatamente después del secado, colocar un chip en el lugar de carga, que es de 20 mm de la boquilla de CO2 a lo largo del eje del chorro. Incline el eje del chorro a un ángulo de 40 °.
- Establecer las presiones de estancamiento de CO2 y N2 gaseoso a 5,3 MPa y 0,7 MPa, respectivamente, utilizando los reguladores de presión de gas.
- Aplicar el chorro de aerosol en la parte central del chip. Aerosoles blancos incluyendo el CO2 sólido debese visible. "Encender" la válvula de solenoide para el CO 2 durante 5 segundos, y luego convertirlo en "off" durante 3 segundos (ciclo: 8 seg) periódicamente con un interruptor controlado manualmente. Si una purga de nitrógeno tiene que ser utilizado, a su vez en la válvula de solenoide para un suministro continuo de N 2.
- Tratar los chips con CO 2 aerosoles para 16, 40, y 88 seg con y sin purgas de nitrógeno. Conservar los chips sin tratamiento como controles negativos.
5. Análisis de eficacia de la eliminación
- Preparar 1 M mancha de ácido nucleico de fluorescencia verde (longitud de onda de excitación / emisión: 480/500 nm) en agua DI para teñir las células bacterianas en el control y patatas fritas tratadas con aerosol.
- Coloque las fichas en la solución de tinción.
- Se incuban las fichas en una incubadora sin luz a 37 ° C durante 30 minutos.
- Después de la incubación, lavar suavemente las virutas con un chorro de agua DI para eliminar el exceso de colorante fluorescente.
- Se seca el wi fichasTH flujo de gas N 2.
- Tome fluorescencia imágenes microscópicas de 5 campos aleatorios de vista (321 × 240 m 2) para cada chip utilizando un microscopio de epifluorescencia, una lente objetivo de 40X, y una cámara CCD.
- Obtener la intensidad de fluorescencia para cada imagen utilizando un software de procesamiento de imágenes tales como ImageJ. En ImageJ, utilizar la función de "Antecedentes Reste" en el menú "Acción", y seleccione "densidad integrado" en la ventana "Establecer medidas" en el menú "Analizar". Hacer el "medición" en el menú "Analizar" para obtener la intensidad de fluorescencia.
- Calcular la eficiencia de eliminación de biofilm de acuerdo con la fórmula siguiente: 100% x (I de chips de control - I de virutas tratadas) / (I de chips de control), donde I es la intensidad de la fluorescencia calculada.
- Obtener el promedio de las eficiencias de eliminación y las desviaciones estándar. Use por lomenos 4 chips para cada caso.
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Representative Results
CO 2 aerosoles se utilizan para eliminar el P. putida biofilms de SUS304 superficies (Figura 1). La mayor parte de las superficies estaban cubiertas por el biofilm después de 24 horas de crecimiento. La mayor parte de la biopelícula se retiró usando el CO 2 aerosoles (Figura 2). Como era de esperar, la Figura 3 muestra un aumento de la eficiencia de eliminación de biofilm como el tiempo de tratamiento aerosol CO 2 aumentado. Para el tiempo de tratamiento de 88 seg, la eficacia de eliminación se determinó que era tan alta como 97,74% y 98,29% con y sin una purga de nitrógeno, respectivamente. La temperatura del aire era de 23-24 ° C y la humedad relativa fue del 26-50% cuando se llevaron a cabo los experimentos de limpieza.
Figura 1. Esquema que muestra la eliminación de un biofilm usando CO 2 aerosoles. Los aerosoles cuando la alta presión de CO 2 gas se expande adiabáticamente a través de una boquilla venturi (0,4 mm) y la temperatura del gas baja rápidamente. Estos alta velocidad CO 2 aerosoles se aplican a una superficie cubierta con un biofilm. Cuando se utiliza una purga de nitrógeno, N2 gas se suministra a través de 8 boquillas que rodean la boquilla central de CO 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Fluorescencia imágenes microscópicas para P. crecido-24-hr biofilms putida en 304 virutas de acero inoxidable. Las patatas fritas fueron tratados con CO 2 aerosoles para diferentes tiempos de tratamiento (0, 16, 40 y 88 sec) sin purgas de nitrógeno. Las imágenes monocromas eran de color verde, y las barras blancas y escala métrica que 50 micras.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La eficiencia de remoción de la P. biopelículas putida de las superficies de acero inoxidable 304 con diferentes tiempos de CO 2 de tratamiento de aerosol, con y sin purgas de nitrógeno. Los rendimientos de eliminación se calcularon sobre la base de las intensidades de fluorescencia de las biopelículas. Las barras de error representan las desviaciones estándar. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
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