Protocol
1. Beredning av Surface för biofilm bildning
- Klipp 1 mm tjocka 304 rostfria stålplattor till flis (10 × 10 mm 2) med en mekanisk kniv.
- Utföra ultraljudsrengöring av flisen i aceton, metanol och avjoniserat (DI) vatten i tur och ordning under 10 minuter vardera. Använda ett lösningsmedel resistent behållare, tillverkad av ämnen såsom glas, för att avlägsna organiska föroreningar.
- Skölj flisen med rinnande DI-vatten för 3-5 sek.
- Torka chipsen med användning av N 2 gasflöde för 3-5 sek.
2. Framställning av bakteriekultur
- Ta en P. putida KT2440 (vänligen tillhandahållen av Prof. Sung Kuk Lee, unist, Sydkorea) lager lagrad i en -80 ° C djupt frys.
- Tina vid rumstemperatur efter 1 min, och det översta lagret av den frusna stamlösningen vänder sig till slask. Doppa en slinga i den smälta skiktet av förrådslösningen.
- Använd denna slinga till strimma bakterierna på en Luria-Bertani (LB) platta innehållande 1,5% agar.
- Inkubera plattan över natten vid 30 ° C för att odla de bakteriekolonier.
- Plocka en enda koloni från plattan med användning av en färsk slinga.
- Ympa 10 ml LB-buljong i en 50 ml koniskt rör med slingan som innehåller den enda bakteriekoloni.
- Inkubera buljongen i ett skakande inkubator under 16 h vid 30 ° C och 160 rpm.
3. biofilm bildning på ytan
- Plocka upp var och en av de framställda flisen med pincett och doppa dem i 70% etanol 5 gånger för 2/1 sekund vardera, för att sterilisera ytan på varje chip. Se till att markerna hålls med pincett under doppning.
- Doppa varje chip i autoklaveras DI vatten och i LB-buljong i följd, 5 gånger för 1-2 sekunder vardera, för att avlägsna kvarvarande etanol.
- Placera dessa marker i 6-brunnars odlingsplattor med 2 marker och 5 ml LB-buljong per brunn.
- Späd bakteriekulturen tills koncentrationen i LB-buljong når8 × 10 8 celler / ml (optisk densitet vid 600 nm våglängd: ~ 0,8).
- Inokulera varje brunn med 50 pl av den utspädda bakteriekultur.
- Inkubera plattorna vid 30 ° C utan skakning under 24 h under bildande av biofilmer.
4. CO 2 Aerosol Cleaning
- Doppa biofilm formade chips i 10 mM ammoniumacetatbuffert (flyktiga) 5 gånger för att avlägsna löst fäst och planktonbakterier.
- Torka dessa marker i en biosäkerhet skåp, där luften strömmar milt.
- Omedelbart efter torkning, placera ett chip på lastningsplatsen, som är 20 mm från CO2 munstycket längs axeln av strålen. Luta jet axel till en 40 ° vinkel.
- Ställ in stagnationstryck på CO2 och N2 gas till 5,3 MPa och 0,7 MPa, respektive, använda gas-tryckregulatorer.
- Applicera aerosol strålen på den centrala delen av chipet. Vita aerosoler inklusive fast CO2 börvara synlig. Slå "på" magnetventil för CO2 i 5 sekunder, och sedan stänga den "off" för tre sekunder (cykel: 8 sek) med jämna mellanrum med hjälp av en manuellt styrd brytare. Om en kvävespolning måste användas, slå på magnetventilen för en kontinuerlig tillförsel av N 2.
- Behandla flisen med CO 2 aerosoler för 16, 40, och 88 sek med och utan kvävgasreningar. Behålla marker utan behandling som negativa kontroller.
5. Analys för borttagning Effektivitet
- Bered en iM grön fluorescens nukleinsyra fläcken (excitation / emissionsvåglängd: 480/500 nm) i avjoniserat vatten för att färga bakterieceller för kontroll och aerosoler behandlade chips.
- Placera marker i färglösningen.
- Inkubera chips i en inkubator utan ljus vid 37 ° C under 30 min.
- Efter inkubationen försiktigt skölja flisen med flödande DI vatten för att avlägsna alltför stora fluorescerande färgämne.
- Torka chips with N 2 gasflödet.
- Ta fluorescens mikroskopiska bilder av 5 slump synfält (321 × 240 | j, m 2) för varje chip som använder ett epifluorescensmikroskop, en 40X objektivlins och en CCD-kamera.
- Erhålla fluorescensintensiteten för varje bild med en bildbehandlingsprogram såsom ImageJ. I ImageJ, använd "Subtrahera Bakgrund" -funktionen i menyn "Process", och välj "Integrerad densitet" i "Set Measurements" fönster i menyn "Analysera". Gör "Mätning" i menyn "Analysera" för att få fluorescensintensiteten.
- Beräkna verkningsgraden biofilmelimineringen i enlighet med följande formel: 100% X (I i kontrollchips - I i behandlade chips) / (I av kontrollchips), där I är den beräknade fluorescensintensitet.
- Få den genomsnittliga borttagning effektivitet och standardavvikelser. Använd påminst 4 chips för varje fall.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CO 2 aerosoler har använts för att avlägsna P. putida Biofilmer från SUS304 ytor (Figur 1). De flesta av ytorna var täckta med biofilm efter 24 h av tillväxt. Mest av biofilm avlägsnades med användning av CO 2 aerosoler (Figur 2). Som väntat, Figur 3 visar en ökning av effektiviteten biofilmelimineringen som CO 2 aerosolbehandling tiden ökade. För behandlingstiden på 88 sek, var på reningsgrad bestämdes till att vara så hög som 97,74% och 98,29% med och utan en kväverening, respektive. Lufttemperaturen var 23-24 ° C och den relativa fuktigheten var 26-50% när rengörings experiment utfördes.
Figur 1. Schematisk visar avlägsnandet av en biofilm med hjälp av CO 2 aerosoler. Är aerosoler genereras när högt tryck CO2 gasen adiabatiskt expanderade genom en venturi munstycke (0,4 mm) och gasen temperaturen sjunker snabbt. Dessa höghastighets CO 2 aerosoler anbringas på en yta täckt med en biofilm. När en kväverening används, N 2 gas som levereras genom 8 munstycken omger den centrala CO2 munstycke. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fluorescens mikroskopiska bilder för 24-hr-odlade P. putida biofilmer på 304 chips i rostfritt stål. Markerna behandlades med CO 2 aerosoler för olika behandlingstider (0, 16, 40 och 88 sek) utan kvävgasreningar. Monokroma bilder färgades grön, och de vita skala staplar indikerar 50 pm.ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54827/54827fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flytt effektivitet för P. putida biofilmer från 304 rostfria ytorna med olika CO2 aerosol behandlingstider, med och utan kvävgasreningar. Effektivitetsvinsterna borttagning beräknades baserat på fluorescensintensiteterna hos biofilmer. Felgränserna representerar standardavvikelser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 304 stainless steel | Steelni (South Korea) |
Polished and diced ones | |
| Ultrasonic cleaner | Branson (USA) |
5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) |
244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) |
214010 | 500 g |
| 6-well culture plate | SPL Life Sciences (South Korea) |
32006 | |
| Ammonium acetate buffer | Sigma-Aldrich (USA) |
667404 | 10 mM |
| Dual gas unit | Applied Surface Technologies (USA) |
K6-10DG | One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) |
Invitrogen | Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm |
| Epifluorescence microscope | Nikon (Japan) | Eclipse 80i | |
| 40X objective lens | Nikon (Japan) |
Plan Fluor | NA: 0.75 |
| CCD camera | Photometrics (USA) |
Cool SNAP HQ2 | Monochrome |
References
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766 (2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
