Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En In Vitro Model til at studere cellulær Transformation af Kaposis sarkom Herpesvirus

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Kaposis sarkom (KS) er en tumor forårsaget af infektion med muterede virus humant herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). I endothelial celle kultur model beskrevet her er unikt tilpasset til at studere de mekanismer, hvorved KSHV forvandler værtsceller.

Abstract

Kaposis sarkom (KS) er en usædvanlig tumor bestående af spindel celler, der er initieret af infektion i endothelial celler (EF) med KSHV, og udvikler sig oftest i fastsættelsen af immunosuppression. Trods årtiers forskning, optimal behandling af KS forbliver dårligt defineret og kliniske resultater er især ugunstige i ressource-begrænset indstillinger. KS læsioner er drevet af patologiske angiogenese, kronisk inflammation og oncogenesis, og forskellige i vitro celle kultur modeller er blevet udviklet for at studere disse processer. KS udspringer af KSHV-inficerede celler i endothelial oprindelse, så EF-slægt celler giver de mest hensigtsmæssige i vitro surrogater af spindel celle forløber. Dog fordi EF har en begrænset in vitro- levetid, og som de muterede mekanismer, der er ansat af KSHV er mindre effektiv end andre tumorfremkaldende virus, har det været vanskeligt at vurdere processer af transformation i primære eller telomerase-udødeliggjort EC. Derfor, en roman EF-baserede kultur model blev udviklet som let understøtter transformation efter infektion med KSHV. Ektopisk udtryk for human papillomavirus type 16 E6 og E7 gener giver mulighed for udvidede kultur af alder - og passage-matchede mock - og KSHV-inficeret EF og støtter udviklingen af en virkelig omdannet (dvs., tumorfremkaldende) fænotype i inficerede cellekulturer . Denne tractable og stærkt reproducerbare model af KS har lettet opdagelsen af flere væsentlige signaling veje med stort potentiale for oversættelse i kliniske indstillinger.

Introduction

Kaposis sarkom (KS) er en multi focal angioproliferative tumor påvirker gennem huden, slimhinder og visceralt sites der udvikler sig oftest i fastsættelsen af avancerede immunsuppression1. Fire epidemiologiske former er blevet beskrevet: classic, en indolent form, der typisk rammer ældre mennesker i Middelhavsområdet og Mellemøsten arv; iatrogen, som følge af behandling med immunosuppressive lægemidler efter organtransplantation; epidemien, en AIDS-definerende kræft; og endemiske, en HIV-uafhængig form almindelige hos børn i endemiske områder i Afrika. Med fremkomsten af effektive kombination anti-retroviral medicin regimer til behandling af HIV er epidemi KS langt mindre almindeligt diagnosticeret i udviklingslande. Men de klinisk aggressive endemiske og epidemiske formularer stadig blandt de mest almindeligt diagnosticeret kræft i mange afrikanske lande2,3,4. Identifikation af effektive patogenese-målrettede lægemidler til behandling af KS er derfor prioriteres forskning.

Histologisk, er KS læsioner karakteriseret af omfattende, men unormal neovascularization hvorved spindel celler af EF-oprindelse danner diskontinuert vaskulære netværk5. Disse unormale fartøjer ("vaskulære slidser") tillader ekstravasation af erytrocytter, som giver læsioner deres karakteristiske farve. Derudover indeholde læsioner talrige leukocytter, der karakteriserer kronisk betændelse (dvs., lymfocytter, makrofager og plasma celler). Regression af KS læsioner efter immun rekonstituering er blevet beskrevet, tyder på, at KS har funktioner i både et hyper-proliferativ læsion og en ægte tumor6,7,8,9.

KS herpesvirus (KSHV), det agens af KS, blev identificeret i 199410. Siden så mange in vitro- cellekultur modeller er blevet udviklet for at aktivere patogenese undersøgelser, herunder celler eksplanterede fra tumor biopsi materiale og primære eller at udtrykke telomerase EF inficeret med KSHV in vitro-11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ingen af de aktuelt tilgængelige modeller fuldt sammenfatter KS tumor mikromiljø, men alle har bidraget med værdifuld viden til vores forståelse af pathobiology af KSHV infektion. I modsætning til de andre kendte tumorfremkaldende humant herpesvirus Epstein - Barr virus (EBV), KSHV ikke let transformere celler i kultur efter de novo infektion19,20,21, 22. imidlertid denne begrænsning har overvundet af transducing primære menneskelige EF af enten iblandet E6 mikrovaskulære eller lymfatisk oprindelse og E7 gener fra human papillomavirus type 16 forud for infektion med KSHV23,24 . Udtryk for disse eksogene onkogener øger dramatisk transformerende potentialet i KSHV in vitro- delvis ved at tilbyde yderligere hæmning af Retinoblastom-protein og p5323,-24. Denne EF transduktion metode har tilladt flere laboratorier til at identificere vigtige ændringer i vært celle genekspression der er fremkaldt af KSHV infektion og der synes at lette KS celle overlevelse og spredning25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. de protokoller er beskrevet heri er ligetil og meget reproducerbar, og vil resultere i generation af alder - og passage-matchede KSHV-inficerede EF og mock-inficerede objekter, der kan være kulturperler i langt længere tid end primærelementer og vil giver mulighed for undersøgelse af muterede mekanismer ansat af KSHV. Selv om protokollen inkluderer en metode til produktion af vildtype KSHV fra den primære effusion lymfom cellelinje BCBL-1, E6/E7-udødeliggjort EF er også meget modtagelige for stammer infektion med rekombinante BACmid KSHV-BAC1630. Protokoller for forberedelse af BAC16 er beskrevet andetsteds33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: alle procedurerne i denne protokol bør udføres BSL-2 betingelser.

1. KSHV Stock forberedelse

  1. forberede TNE buffer: 292.24 mg EDTA i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. 605.7 mg Tris i ddH 2 O opløses, bringe til 225 mL, og justeres til pH 8. Kombinere EDTA og Tris løsninger, tilføje 4,38 g NaCl, justere endelige mængden til 500 mL, filtrere steriliseres og opbevares ved 4 ° C .
  2. Kultur KSHV-positive, EBV-negative primære effusion lymfom cellelinje BCBL-1 i en fugtig inkubator ved 37 ° C plus 5% CO 2 i RPMI suppleret med 10% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) og antimikrobielle stoffer til ca. 1 til 1,2 x 10 6 celler pr. mL.
  3. Til at fremkalde KSHV produktion, opdele kulturer 1:2 med friske medium og tilføje Phorbol 12-Myristate 13-acetat (PMA) til en endelig koncentration på 20 ng/mL og Inkuber kulturer i 5 dage. Som et alternativ, behandling af celler med natrium butyrat (NaB; 0,1 mM) i 3 dage for at fremkalde lytisk viral replikation.
  4. For at høste viruspartikler, først centrifugeres kultur supernatanten ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur til at sammenpresse cellerne og overføre supernatanter til frisk rør.
  5. Til yderligere at præcisere supernatanten for at undgå overførsel af celleaffald, centrifugeres på 2.500 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: som et alternativ til høj hastighed centrifugering for afklaring af kultur supernatanter, filtrering gennem et sterilt 0,45 µm filter kan udføres. Vi har bemærket en betydelig nedgang i titer ved hjælp af filtrering; Derfor, vi rutinemæssigt udføre andet trin, centrifugering i stedet.
  6. Næste, overlay 5 mL 25% rørsukkeropløsning TNE buffer med ca. 30 mL af den klarede kultur supernatanten i 6 ultracentrifuge rør.
  7. Centrifuge afbalanceret rør på 75.000 x g i 2 timer ved 4 ° C under vakuum.
  8. Dekanteres kultur supernatanten og duppes rand af hver tube til at fjerne så meget supernatanten og saccharose løsning som muligt, så resuspenderes virus, som ikke måske er synlige i 150 µL af TNE buffer.
  9. Pool alle genopslemmes virus, bland godt, og fryse 25 µL alikvoter ved-80 ° C .

2. Transduktion af EF med E6 og E7 Papillomavirus Genes

NOTE: vi rutinemæssigt bruger standard vævskultur flasker til dyrkning af primære EC. Dog hvis utilfredsstillende vækst i EF er fremstillet så brugen af kommercielle kultur kolber bør betragtes.

  1. Kultur primære human dermal mikrovaskulære eller lymfe EF i en fugtig inkubator ved 37 ° C plus 5% CO 2 i EF vækstmediet (EGM; indeholder EF basal medium [EBM] suppleret med EGM-2 BulletKit [indeholdende FBS, hydrocortison, menneskelige fibroblast vækstfaktor-B, vaskulære EF vækstfaktor, insulin-lignende vækstfaktor-1, ascorbinsyre, menneskelige epitelial vækstfaktor, antibiotika og heparin]) i en T75 celle kultur kolbe til ca 50% sammenløbet.
  2. For transduktion, kultur PA317 LXSN 16E6E7 celler 24 , 35 i en fugtig inkubator ved 37 ° C plus 5% CO 2 i DMEM suppleret med 10% FBS og antimikrobielle stoffer i en T150 celle kultur kolbe indtil de er cirka 90% sammenflydende. Derefter inkuberes natten over i 16 mL medium.
  3. Præcisere PA317 mediet ved centrifugering ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur.
  4. Fjerne EGM fra EF kultur og overlay celler med 12 mL af den klarede PA317 medium og Inkuber i 4 h.
    Bemærk: Centrifugering 16 mL af konditioneret medium på 300 x g 5 min resultater i en kompakt pellet, der ikke er forstyrret af den omhyggelige efterfølgende fjernelse af 12 mL klarede supernatant. Men hvis overførslen af PA317 LXSN 16E6E7 celler til primære EF kulturer er et problem (celle pakkelinie vil hurtigt vokser EF), derefter filtrering af konditioneret supernatanten gennem et 0,45 µm filter før overførsel kan udføres.
  5. Erstatte 6 mL af PA317 medium med friske EGM og inkuberes natten.
  6. Refeed EF med 12 mL frisk EGM og inkuberes en yderligere 48 h.
  7. For at sub kultur EF, fjerne medium og vask med 12 mL PBS uden kationer, og tilsættes 3 mL kommerciel enzymatisk dissociation opløsning (f.eks. TrypLE) af og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
  8. Overføre cellesuspension til en 15 mL konisk slange og centrifugeres ved 300 x g i 5 min ved stuetemperatur. Resuspenderes resulterende celle frisk EGM og opdele jævnt i 3 x T75 kolber med en endelige mængden af 12 mL EGM pr. kolbe.
  9. For at vælge for EF transduced med E6 og E7, føje G418 til en endelig koncentration på 200 µg/mL for to passager, hvorefter den transduced EF kan belagt for infektion eller frosset i flydende nitrogen.

3. Infektion af Transduced EF med KSHV

  1. på dagen før infektionen høste EF af enzymatisk fordøjelsen ved hjælp af den kommercielle enzymatiske dissociation løsning, som beskrevet ovenfor. Resuspend celle pellet i 1 mL af ekstraordinær generalforsamling. Bruge 5 µL af celler til at forberede en 1/10 fortynding i Trypan blå. Tælle levende celler ved hjælp af en hemocytometer og frø 2,5 x 10 5 levende celler i 2 mL af EGM pr. brønd i 6 godt plader.
  2. På dagen for infektion, fjerne EGM og vaske cellerne med 3 mL PBS med calcium og magnesium pr. brønd, og derefter tilsættes 2 mL EBM.
    Bemærk: Det er vigtigt at bruge EBM snarere end EGM under infektion, som heparin EGM vil hæmme bindingen af virale partikler til og efterfølgende infektion af target EC.
  3. Til at inficere celler med KSHV, tilføje 5 til 20 µL virus lager til hver brønd og slyng plade til at blande. Til mock-inficerede celler tilføje et lige saa stort volumen af TNE buffer til hver brønd.
  4. Centrifugeres plader på 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur og derefter inkuberes plader ved 37 ° C i 90 min.
  5. Hvis målet med undersøgelsen er at undersøge tidlige begivenheder der kræver en synkron virusinfektion, fx tidlige begivenheder i de novo infektion, fjerne den virale inokulum på dette punkt. Skyl og refeed celler med 2 mL frisk EGM. Ellers, tilsættes 2 mL EGM og inkuberes kulturer natten.
  6. Refeed celler med 2 mL EGM dagen efter infektion og derefter hver anden dag.
  7. Når celler er ca 90% sammenflydende, høst af enzymatisk fordøjelsen ved hjælp af kommercielle enzymatisk dissociation løsning som beskrevet ovenfor, så pool celler fra tre brønde i en T75, at bemærke, både de samlede passage antallet og passage efter infektionen.
  8. Udvide mock - og KSHV-smittede EF 1:3 splits for mindst to yderligere passager på hvilket tidspunkt celler kan anvendes i eksperimenter eller frosset i flydende nitrogen.
    Bemærk: Som med opdeling i EF transduced med E6 og E7, vedligeholdelse kulturer af mock - og KSHV-inficerede celler bør opdeles før sammenløbet (~ 85-90%).

4. bekræfter infektion med KSHV ved immunfluorescens

Bemærk: påvisning af KSHV latency-associerede nukleare antigenet (LANA-1/ORF73) giver en pålidelige kvantitative mål for infektion. Anti-LANA antistoffer er kommercielt tilgængelige.

  1. Dagen før farvning, plade to brønde hver med mock - eller KSHV-inficeret EF på en 24-godt plade på 1 x 10 5 celler pr godt i 1 mL EGM og inkuberes natten.
  2. Vask celler to gange med 500 µL af PBS plus calcium og magniseum. Vask for 30 s på en vuggende platform.
  3. i et eksternt ventillated stinkskab, lave celler med 500 µL af 4% PARAFORMALDEHYD i 15 min. ved stuetemperatur.
  4. Vaske cellerne tre gange med 500 µL af vaskebuffer (0,1% Triton X-100 plus 0,02% ged serum i PBS plus kationer).
  5. Blokere celler med 500 µL af 2% ged serum i wash buffer i 30 min. ved stuetemperatur.
  6. Vaske cellerne tre gange med 500 µL af vaskebuffer.
  7. Mærke et godt af mock - eller KSHV-inficeret EF med 200 µL af primære antistof fortyndet 1:100 i wash buffer i 30 min. ved stuetemperatur på en rocker. Inkuber de resterende to brønde i 200 µL af wash buffer kun.
  8. Vaske cellerne tre gange med 500 µL af vaskebuffer.
  9. Mærke alle fire brønde med 200 µL af sekundær antistof fortyndet 1: 100 i wash buffer i 30 min. ved stuetemperatur på en rocker.
  10. Vaske cellerne tre gange med 500 µL af vaskebuffer.
  11. Til hver brønd anvende 20 µL af montering medium indeholdende DAPI og en coverslip og vurdere farvning ved hjælp af en omvendt fluorescerende mikroskop.
  12. Bestemmer den procent infektion af KSHV-inficerede celler ved at tælle antallet af LANA-positive kerner i mindst 200 celler. Infektion med rekombinant KSHV-Bac16 kan også blive overvåget via observation af kulturer for udtryk for normal god landbrugspraksis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologi af primære EF er klassisk beskrevet som "cobble stone", og denne morfologi ændres ikke af udtryk for papillomavirus E6, E7 gener (figur 1A). Udtryk af E6 og E7 gener alene fremkalde ikke en transformeret fænotype; således celler er modtagelige for kontakt hæmning og vil ophøre med at dividere ved ankomsten til sammenløbet i kultur. Cellerne vil dog formere og regrow til sammenløbet på trypsinization og replating på en lavere tæthedsgrad, giver mulighed for vedligeholdelsen af alder - og passage-matchede kulturer til brug som mock-inficerede objekter.

Infektion af E6/E7-transduced EF med KSHV forårsager dramatiske morfologiske ændringer i kulturen, der minder om "spindel celle" fænotype observeret i KS læsioner (figur 1B). En transformeret fænotype er også foranlediget ved infektion med KSHV, som er åbenbart i del af tab af kontakt hæmning når cellerne er kulturperler efter sammenløbet (figur 1 c) og forankring-uafhængig vækst i blød agar (figur 2). Tab af både kontakt hæmning og afhængigheden af ekstra-cellulære matrix interaktioner (anchorage) under oncogenesis er to af kendetegnende for cellulær transformation36. Det er vigtigt at bemærke, at primære EF er også modtagelige for infektion med KSHV og primære EF systemer har været yderst værdifuld for belyse forskellige aspekter af virus-værts-samspillet, og dens konsekvenser. Sådanne undersøgelser er godt repræsenteret i litteraturen og flere eksempler nævnes heri37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Immunfluorescent farvning viser at spindel morfologi af KSHV-inficerede celler er forbundet med udtryk for den virale proteiner LANA-1/ORF73 (figur 3A og 3B, rød). Som koncentrationen af virus i bestande vil variere mellem præparater, mængden af virus tilføjet pr. brønd bør justeres, således at KSHV-inficerede kulturer nå > 90% infektion i én eller to passager. Med seriel passage procentdelen af infektion vil nærme sig 100% og vil blive opretholdt for varigheden af kultur (ca. 20 passager). Lavere mængder af virus kan anvendes, hvis en undersøgelse af paracrine indflydelse er beregnet, eller hvis tilstødende ikke-inficerede celler er ønskeligt som kontrolelementer (f.eks.for immunofluorescens undersøgelser der involverer andre proteiner af interesse). Inficerede kulturer støtter også udtryk for lytisk virale proteiner, men som er observeret i KS læsioner, kun et mindretal af celler i kultur spontant vil gennemgå lytisk reaktivering (figur 3B, grøn). Celler inficeret med KSHV-BAC16, som er markeret med normal god landbrugspraksis, også udvikle en spindel morfologi (figur 3 c og 3D). Når KSHV-BAC16 bruges, kan viral titers opnås ved at inficere celler med en seriefremstillede fortyndet koncentreret virus bestand og evaluere celler for normal god landbrugspraksis udtryk på 48 timer efter infektion ved hjælp af flow flowcytometri30.

For både rekombinant og WT virus, kan viral genomer i stock præparater også måles ved at rense DNA fra inficerede celler efterfulgt af PCR kvantificering af KSHV DNA niveauer; man skal dog ikke antage at alle genomer er smitsomme45. Hvis studiet af KSHV lytisk cyklus er beregnet, virus reaktivering kan opnås ved at stimulere EF med inducerende agenter som beskrevet ovenfor for BCBL-1 celler, selv om effektiviteten af genaktivering er lavere23. Lytisk cyklus kan også være fremkaldt af transduktion af EF med KSHV transaktivatoren protein ORF5046. Konsistente med resultaterne i andre celle kultur modeller af KS, både spontane udtryk og kemiske induktion af KSHV lytisk gener i E6/E7-udtrykker EF mindskes med tiden trods opretholdelsen af en stabil latent infektion11,16 .

Figure 1
Figur 1: morfologi af mock- og KSHV inficeret EC. (A) Mock-inficerede EF encellelag udstille den klassiske cobble stone udseende af fase kontrast vitale mikroskopi. Uden foranstaltninger af KSHV gener vil disse celler ikke omdannes og derfor ophøre med at dividere og udstille kontakt hæmning ved ankomsten til sammenløbet i kultur. (B) KSHV-inficerede celler, udvikle derimod et aflangt "spindel celle" morfologi minder om KS spindel celler. Dette panel viser morfologi af KSHV-inficerede celler på dag 5 PI ved ankomsten til sammenløbet. (C) i KSHV-inficerede celler, omfattende ændringer i vært celle genekspression føre til cellulær transformation, som bliver indlysende, når KSHV-inficerede celler er kulturperler uden passage. Under disse omstændigheder fortsætte KSHV-inficerede celler prolifererende selv efter at have nået sammenløbet fører til udviklingen af multi-lag foci af celler. Dette panel viser morfologi af KSHV-inficerede celler på dag 14 PI, kulturperler for 9 dage efter sammenløbet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Anchorage uafhængige vækst. Untransformed celler typisk gennemgå apoptotisk celledød efter tab af kontakt med et substrat, en proces kaldet anoikis. (A) når E6/E7-transduced mock-inficerede EF, som ikke overføres, er suspenderet i blød agar og kulturperler i to uger de ikke danner kolonier. (B) KSHV-inficerede EF, som virus-transformeret, er resistente over for anoikis og vil danne kolonier i blød agar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Demonstration ekspression af virale proteiner. (A) spindel morfologi er tydelig efter infektion med KSHV (40 X forstørrelse). (B) immunfluorescent farvning af feltet samme vist i (A) viser, at spindel morfologi forbundet med udtryk for viral latency protein ORF73 (rød). Inficerede celler støtte lytisk virusreplikation så godt, som det fremgår af en lille procentdel af celler, der udtrykker den virale processivity faktor ORF59 (grøn). (A og B ændres fra reference26.) Spindel morfologi af celler inficeret med KSHV-BAC16 virus (C) er forbundet med udtryk for normal god landbrugspraksis (D) (20 X forstørrelse). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesis er en omstændelig proces, der omgår vigtige sikkerhedsforanstaltninger inden for en organisme36. KS læsioner findes langs et spektrum af kronisk inflammation til sande sarkomer, kræver udredning af visse patofysiologiske processer, formidlet af KSHV at blive gennemført nogle undersøgelser i celle kultur modeller, der understøtter transformation9. Det skal bemærkes, at tab af kontakt hæmning og forankring-afhængige vækst, fænotyper vejledende for cellulær transformation, ikke udvikler umiddelbart efter infektion i primære EF EF udødeliggjort af eksogene udtryk af telomerase. Derfor, mens in vitro- modellen af KS beskrevet her ikke sammenfatte alle aspekter af KS tumor mikromiljø eller opførsel af eksplanterede KS celler, det er unikt tilpasset til at studere ændringer i vært celle genekspression induceret ved infektion med KSHV, der bidrager til KS tumordannelse.

Først rapporterede genekspression profilering undersøgelse ved hjælp af kultur system beskrevet heri identificeret receptor tyrosin kinase c-Kit som en bidragyder til den transformerede Fænotypen af KSHV-inficerede celler25. Banke ned af c-Kit udtryk ved hjælp af siRNA eller hæmning af c-Kit signalering, ved hjælp af en dominerende negativ konstruktion eller tyrosin kinase inhibitor STI 571 (Imatinib) påvirkes af tab af foci dannelsen efter forlænget med omdanne evne til KSHV manifest kultur af inficerede celler. Efterfølgende klinisk evaluering af Imatinib har vist effekt af dette stof i patienter med epidemiske KS47,48,49. Andre potentielle behandling mål er også blevet identificeret, herunder hæm oxygenase-126,50, CXCR727, og den beta adrenerge receptorer28, som alle spiller en rolle i vækst eller omdannelse af EF in vitro-. Bekræftelse af disse gen expression mønstre i primære EF såvel som KS biopsi væv bekræfter fysiologisk relevansen af dette system og understreger sin værdi som en præ-klinisk model for KS therapeutics25,26, 51,52,53,54,55.

En anden styrke af E6/E7 transduktion system er at forlænget levetid af udødeliggjort i forhold til primære EF giver den langsigtede vedligeholdelse af alder og passage-matchede mock-inficerede kontrol celler for sammenlignende evaluering af resultaterne af KSHV infektion. Det er vigtigt at bemærke, at for at maksimere antallet af passager af EF transduced med E6 og E7 er det kritisk at opdele kulturer før sammenløbet (~ 85-90%). Desuden, disse celler tolerere serumfrit betingelser for længere perioder. Primære EF gennemgå hurtigt programmeret celledød ved vækstfaktor udbetaling og derfor ikke kan være kulturperler i lange perioder uden serum eller rekombinant vækstfaktorer56,57. Denne afhængighed gør autocrine signalering veje forårsaget af infektion med KSHV vanskeligt at identificere og studere, som før fuld transformation KSHV-inficerede celler vil også gennemgå programmeret celledød ved vækstfaktor udbetaling (upubliceret observation). Tilstedeværelsen af E6 og E7 proteinerne i denne model, men forhindre programmeret celledød efter vækstfaktor tilbagetrækning og giver mulighed for længere tids (f.eks.48 h) kultur i lavt serum eller serum gratis medium25,26 , 28.

KS er en kompleks og usædvanlig sygdom med funktioner af både kronisk inflammation og cellulær transformation. Den kliniske behov for nye terapeutiske strategier er stor, og celle kultur model beskrevet heri har unikke egenskaber, der tillader vurdering af kandidat drug mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af K12 HD068322 (SCM); R01 CA179921 og P51 OD011092 (AVM); og tildele 14PRE20320014 fra Amerika Heart Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Kræft biologi sag 126 Kaposis sarkom primære effusion lymfom KSHV transformation oncogenesis endotel celle
En <em>In Vitro </em>Model til at studere cellulær Transformation af Kaposis sarkom Herpesvirus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter