Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore indotto tramite l'infezione con il virus oncogeno herpesvirus-8/KS il herpesvirus umano (HHV-8/KSHV). Il modello di coltura delle cellule endoteliali descritto qui è specificatamente concepito per studiare i meccanismi da cui KSHV trasforma le cellule ospite.

Abstract

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore insolito composto di proliferazione delle cellule dell'alberino che è iniziato da infezione delle cellule endoteliali (CE) con KSHV e si sviluppa più spesso nella regolazione di immunosoppressione. Nonostante decenni di ricerca, il trattamento ottimale di KS rimane definito male e gli esiti clinici sono particolarmente sfavorevoli nelle impostazioni di risorse limitate. Le lesioni KS sono guidate da angiogenesi patologica, infiammazione cronica e oncogenesi e vari in vitro modelli di coltura cellulare sono stati sviluppati per studiare questi processi. KS deriva dalle cellule di KSHV-infettati di origine endoteliale, così le cellule CE-stirpe di fornire i più appropriati in vitro surrogati del precursore delle cellule dell'alberino. Tuttavia, perché CE hanno una durata limitata in vitro , e come i meccanismi oncogenici impiegati da KSHV sono meno efficaci di quelli di altri virus cancerogeno, è stato difficile valutare i processi di trasformazione primaria o telomerase-immortalized EC. Di conseguenza, è stato sviluppato un modello di romanzo cultura basata su CE che prontamente supporta la trasformazione dopo l'infezione con KSHV. Espressione ectopica dei geni E6 ed E7 del papillomavirus umano di tipo 16 consente estesa cultura di pari età e passaggio mock - e KSHV-infettati CE e supporta lo sviluppo di un veramente trasformato (cioè, cancerogeno) fenotipo in colture di cellule infette . Questo modello altamente riproducibile e trattabile di KS ha facilitato la scoperta di diverse vie di segnalazione essenziale ad alto potenziale per la traduzione in contesti clinici.

Introduction

Sarcoma di Kaposi (KS) è un tumore di angioproliferative multi-focale che interessano siti cutanei, mucosi e viscerali che si sviluppa più comunemente nella cornice di soppressione immune avanzata1. Sono state descritte quattro forme epidemiologiche: classic, una forma indolent che colpisce in genere persone anziane del patrimonio Mediterraneo e del Medio Oriente; iatrogena, derivando dal trattamento con farmaci immunosoppressori dopo trapianto dell'organo; epidemia, un cancro didefinizione; ed endemiche, una forma di HIV-indipendente comune nei bambini nelle regioni endemiche in Africa. Con l'avvento dei regimi della droga anti-retrovirale combinazione efficace per il trattamento dell'HIV, KS epidemica è molto meno comunemente diagnosticato in paesi in via di sviluppo. Tuttavia, le forme clinicamente aggressive endemiche ed epidemiche rimangono tra i più comunemente cancri diagnosticati in molti paesi africani2,3,4. Pertanto, l'identificazione di farmaci mirati a patogenesi efficaci per il trattamento di KS è una priorità di ricerca.

Istologicamente, KS lesioni sono caratterizzate da neovascolarizzazione abbondante ma anormali, per cui le cellule dell'alberino di origine CE formano reti vascolari discontinuo5. Questi vasi anomali ("fessure vascolari") consentono lo stravaso di eritrociti, che danno lesioni loro colore caratteristico. Inoltre, le lesioni contengono numerosi leucociti che caratterizzano l'infiammazione cronica (cioè, linfociti, macrofagi e plasmacellule). Regressione delle lesioni KS dopo ricostituzione immunitaria è stata descritta, suggerendo che KS ha caratteristiche di una lesione iper-proliferative sia un vero tumore6,7,8,9.

Il herpesvirus KS (KSHV), l'agente causativo di KS, è stato identificato nel 199410. Da allora molti in vitro coltura cellulare sono stati sviluppati modelli per attivare studi di patogenesi, comprese le cellule espiantati da materiale di biopsia del tumore e primaria o CE esprimendo la telomerasi è infettato da KSHV in vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nessuno dei modelli attualmente disponibili completamente ricapitola il microambiente tumorale di KS, ma tutti hanno contribuito conoscenze preziose per la nostra comprensione del pathobiology dell'infezione di KSHV. A differenza del altri noto cancerogeno herpesvirus umano virus di Epstein - Barr (EBV), KSHV non prontamente trasforma le cellule in cultura seguendo de novo infezione19,20,21, 22. Tuttavia, questa limitazione è stata superata da transducing CE primaria umana del mescolato origine microvascolare o linfatico con la E6 ed E7 geni da papillomavirus umano tipo 16 prima dell'infezione con KSHV23,24 . Espressione di questi oncogeni esogeni aumenta notevolmente il potenziale trasforma di KSHV in vitro in parte fornendo ulteriore inibizione del retinoblastoma proteina e p5323,24. Questo metodo di trasduzione CE ha permesso più laboratori di identificare le alterazioni chiave nell'host espressione genica delle cellule che sono indotte dall'infezione di KSHV e che sembrano facilitare KS cella sopravvivenza e proliferazione25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. i protocolli descritti nel presente documento sono semplici e altamente riproducibile e comporterà la generazione di pari età e passaggio CE KSHV-infettati e controlli mock-infettati che possono essere coltivati per lontano più di cellule primarie e saranno consentire per l'indagine sui meccanismi oncogenici impiegato da KSHV. Anche se il protocollo include un metodo per la produzione di tipo selvaggio KSHV dalla linea cellulare linfoma primario di effusione BCBL-1, CE E6/E7-immortalata anche sono altamente suscettibili di infezione con BACmid ricombinante derivato KSHV-BAC1630. Protocolli per la preparazione di BAC16 sono descritti altrove33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Nota: tutte le procedure descritte in questo protocollo devono essere eseguite in condizioni di BSL-2.

1. preparazione di KSHV Stock

  1. buffer di preparare TNE: sciogliere 292,24 mg di EDTA in ddH 2 O, portare a 225 mL e regolare a pH 8. Sciogliere mg 605,7 Tris in ddH 2 O portare a 225 mL e regolare a pH 8. EDTA e Tris soluzioni combinate, aggiungere 4,38 g NaCl, regolare il volume finale di 500 mL, filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C .
  2. Cultura il KSHV-positivo, la linea EBV-negativi di cellule di linfoma primario di effusione BCBL-1 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in RPMI completato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) e antimicrobici per circa 1 a 1.2 x 10 6 cellule per mL.
  3. Per indurre la produzione di KSHV, dividere Culture 1:2 con mezzo fresco e aggiungere Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) a una concentrazione finale di 20 ng/mL e incubare le colture per 5 giorni. In alternativa, trattare le cellule con butirrato del sodio (NaB; 0,1 mM) per 3 giorni per indurre la replicazione litica.
  4. Per raccogliere le particelle virali, prima di centrifugare il surnatante a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule e trasferire i surnatanti in provette di freschi della cultura.
  5. Per chiarire ulteriormente il supernatante in modo da evitare il trasferimento di detriti cellulari, centrifugare a 2.500 x g per 10 min a 4 ° C.
    Nota: in alternativa alla centrifugazione ad alta velocità per la chiarifica dei surnatanti, filtrazione attraverso una sterile 0,45 µm filtro possa essere eseguita. Abbiamo osservato un calo significativo nel titolo mediante filtrazione; di conseguenza, eseguiamo regolarmente la seconda fase di centrifugazione invece.
  6. Successivamente, sovrapposizione di 5 mL di soluzione di saccarosio di 25% nel buffer di TNE con circa 30 mL di surnatante in 6 tubi di ultracentrifuga della cultura chiarificato.
  7. Centrifuga equilibrato tubi a 75.000 x g per 2 ore a 4 ° C sotto vuoto.
  8. Decantare il supernatante di coltura e macchia il bordo di ogni tubo per rimuovere quanto più soluzione supernatante e saccarosio come possibile, quindi risospendere il pellet di virus, che potrebbe non essere visibile, in 150 µ l di tampone TNE.
  9. Virus in piscina tutti risospesa, mescolare bene e congelare 25 aliquote di µ l a -80 ° C .

2. Trasduzione della CE con E6 ed E7 Papillomavirus Genes

Nota: usiamo ordinariamente matracci di cultura del tessuto standard per la coltivazione EC. primaria Tuttavia, se insoddisfacente crescita della CE si ottengono quindi l'uso di matracci di cultura commerciale dovrebbe essere considerato.

  1. Cultura primaria umana dermico microvascolare o linfatico CE in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 nel mezzo di crescita CE (EGM; contiene sostanza basale di CE [EBM] completato con EGM-2 BulletKit [contenente FBS, idrocortisone, fattore di crescita del fibroblasto umano-B, fattore di crescita vascolare CE, fattore di crescita insulino-simile-1, acido ascorbico, fattore di crescita epiteliale umano, antibiotici ed eparina]) in un matraccio di cultura cellulare T75 a circa 50% confluenza.
  2. Per trasduzione, cultura PA317 LXSN 16E6E7 cellule 24 , 35 in un incubatore a 37 ° C più 5% CO 2 in DMEM completati con 10% FBS e antimicrobici in un Matraccio di cultura cellulare T150 fino a quando essi sono circa 90% confluenti. Quindi incubare per una notte in 16 mL di terreno.
  3. Chiarire il mezzo PA317 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere la EGM dalle cellule EC cultura e sovrapposizione con 12 mL di terreno PA317 chiarificato e incubare per 4 h.
    Nota: Centrifugazione 16 mL di medium condizionato a 300 x g per 5 min risultati in una compatta a pellet che non è disturbato dalla successiva rimozione accurata di 12 mL di surnatante chiarificato. Tuttavia, se il trasferimento delle PA317 LXSN 16E6E7 cellule di colture primarie di CE è una preoccupazione (la linea cellulare di imballaggio rapidamente diventerà troppo grande per CE), filtrazione del surnatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può eseguire.
  5. Sostituire 6 mL di terreno PA317 con EGM fresco e incubare per una notte.
  6. Refeed CE con 12 mL EGM fresco e incubare un ulteriore 48 h.
  7. Per sub-cultura della CE, rimuovere il mezzo e lavare con 12 mL di PBS senza cationi e aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica commerciale (ad esempio, TrypLE) di e incubare a 37 ° C per 3 min.
  8. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare risultante in EGM fresco e dividere in modo uniforme in 3 x T75 boccette con un volume finale di 12 mL EGM per fiaschetta.
  9. Per selezionare per CE trasformata con E6 ed E7, aggiungere G418 ad una concentrazione finale di 200 µ g/mL per due passaggi, dopo il quale la CE trasdotte può essere placcata per infezione o congelata in azoto liquido.

3. Infezione della CE trasdotte con KSHV

  1. il giorno prima dell'infezione vendemmia CE a digestione enzimatica utilizzando la soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra. Risospendere le cellule in 1 mL di EGM. Utilizzare 5 µ l di cellule per preparare una diluizione 1/10 in blu di Trypan. Contare celle in tensione utilizzando un emocitometro e seme 2,5 x 10 5 cellule vive in 2 mL di EGM per pozzetto in piastre a pozzetti 6.
  2. Il giorno di infezione, EGM di rimuovere e lavare le cellule con 3 mL di PBS con calcio e magnesio per pozzetto e quindi aggiungere 2 mL EBM.
    Nota: È indispensabile utilizzare EBM anziché EGM durante l'infezione, poiché l'eparina in EGM inibiscono la associazione di particelle virali per e successiva infezione di destinazione EC.
  3. Di infettare le cellule con KSHV, aggiungere brodo di virus di 5 a 20 µ l a ciascun pozzetto e ricciolo piatto per mescolare. Per cellule infettate da mock, aggiungere un volume equivalente di tampone TNE in ciascun pozzetto.
  4. Centrifugare le piastre a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente e poi incubare le piastre a 37 ° C per 90 min.
  5. Se l'obiettivo dello studio è di indagare gli eventi iniziali che richiedono un'infezione virale sincrona, ad esempio, eventi precoci nell'infezione de novo, rimuovere l'inoculo virale a questo punto. Sciacquare e le cellule con 2 mL di refeed EGM fresco. In caso contrario, aggiungere 2 mL EGM e incubare le colture durante la notte.
  6. Refeed cellule con 2 mL EGM il giorno dopo l'infezione e quindi ogni altro giorno.
  7. Quando le cellule sono circa 90% confluenti, vendemmia a digestione enzimatica con soluzione di dissociazione enzimatica commerciale come descritto sopra, quindi le cellule da tre pozzi in un T75, rilevando il numero di passaggio totale e il passaggio della piscina post-infezione.
  8. Espandere mock - e KSHV-infettato CE 1:3 divisioni per almeno due passaggi ulteriori, momento in cui le cellule possono essere utilizzate in esperimenti o congelate in azoto liquido.
    Nota: Come con la scissione della CE trasformata con E6 ed E7, culture di manutenzione delle cellule infettate di derisione e KSHV dovrebbero essere diviso prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%).

4. confermando l'infezione con KSHV dall'immunofluorescenza

Nota: rilevamento di KSHV latenza-collegata nucleare antigene (LANA-1/ORF73) fornisce una misura quantitativa affidabile di infezione. Gli anticorpi anti-LANA sono disponibili in commercio.

  1. Il giorno prima della colorazione, piastra due pozzetti ciascuna con mock - o KSHV-infettati CE su una piastra a 24 pozzetti a 1 x 10 5 cellule per bene in 1 mL EGM e incubare per una notte.
  2. Cellule di lavare due volte con 500 µ l di PBS più calcio e magniseum. Lavare per 30 s su una piattaforma oscillante.
  3. In un di cappa esternamente-Refriggerato, fissare le cellule con 500 µ l di paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente.
  4. Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio (0,1% Triton X-100 plus siero di capra 0,02% in PBS più cationi).
  5. Bloccare le cellule con 500 µ l di siero di capra del 2% in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente.
  6. Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.
  7. Etichetta un pozzetto di mock - o KSHV-infettati CE con 200 µ l di anticorpo primario diluito 01:100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker. Incubare i rimanenti due pozzi a 200 µ l di tampone di lavaggio solo.
  8. Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.
  9. Etichetta tutti i quattro pozzi con 200 µ l di anticorpo secondario diluito 1: 100 in tampone di lavaggio per 30 min a temperatura ambiente su un rocker.
  10. Lavare le cellule tre volte con 500 µ l di tampone di lavaggio.
  11. Ad ogni pozzetto applicare 20 µ l di montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti e valutare che macchia usando un microscopio a fluorescenza invertito.
  12. Determinare l'infezione percentuale di cellule infettate da KSHV contando il numero di nuclei di LANA-positivi in almeno 200 cellule. Infezione con ricombinante KSHV-Bac16 può essere monitorato anche tramite osservazione di culture per l'espressione della GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La morfologia della primaria CE è classicamente descritto come "ciottoli", e questa morfologia non è alterata dall'espressione del papillomavirus E6 ed E7 geni (Figura 1A). Espressione dei geni E6 ed E7 da solo non induce un fenotipo trasformato; così, le cellule sono suscettibili di contattare inibizione e cesseranno dividendo dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. Le cellule saranno tuttavia proliferare e ricrescere alla confluenza su trypsinization e ricromatura ad una densità inferiore, consentendo per il mantenimento delle culture di passaggio-abbinato e dell'età per l'uso come controlli mock-infettati.

Infezione della CE E6/E7-trasdotte con KSHV causa drammatici cambiamenti morfologici nella cultura che ricordano il "delle cellule dell'alberino" fenotipo osservato nelle lesioni KS (Figura 1B). Un fenotipo trasformato è anche indotto a seguito di infezione con KSHV, che si manifesta in parte dalla perdita di inibizione da contatto quando le cellule sono coltivata post-confluenza (Figura 1) e la crescita ancoraggio-indipendente in agar molle (Figura 2). Perdita di inibizione da contatto e la dipendenza delle interazioni matrice extra-cellulare (ancoraggio) durante oncogenesi sono due delle caratteristiche di trasformazione cellulare36. È importante notare che il primario CE sono anche suscettibili di infezione con KSHV e sistemi primari CE sono stati estremamente utili per chiarire diversi aspetti dell'interazione virus-ospite e le sue conseguenze. Tali studi sono ben rappresentati nella letteratura e diversi esempi sono citati nel presente documento37,38,39,40,41,42,43 ,44.

Macchiatura immunofluorescente dimostra che la morfologia dell'alberino di cellule infettate da KSHV è associata con l'espressione della proteina virale LANA-1/ORF73 (Figura 3A e 3B, rosso). Come la concentrazione di virus nelle scorte varierà tra le preparazioni, il volume del virus aggiunto per pozzetto deve essere regolato in modo che raggiungono culture KSHV-infettati > 90% infezione entro uno o due passaggi. Con passaggio seriale la percentuale di infezione si avvicinerà a 100% e verrà mantenuta per tutta la durata della coltura (circa 20 passaggi). Minore quantità di virus può essere utilizzato se uno studio delle influenze di paracrine è destinato, o se le celle adiacenti non infette sono desiderabili come controlli (ad esempio, per gli studi di immunofluorescenza che coinvolgono altre proteine di interesse). Colture infettate supportano anche l'espressione delle proteine virali litiche ma, come si osserva nelle lesioni di KS, solo una minoranza delle cellule nella cultura spontaneamente subirà litica riattivazione (Figura 3B, verde). Le cellule infettate con KSHV-BAC16, etichettato con GFP, anche sviluppano una morfologia dell'alberino (Figura 3 e 3D). Quando viene utilizzato KSHV-BAC16, sono ottenibili infettare le cellule con uno stock di virus concentrati diluiti in serie e valutando le cellule per l'espressione della GFP a 48h post di infezione usando flusso cytometry30titoli virali.

Per antivirus WT e ricombinante, genomi virali nelle preparazioni d'archivio possono anche essere misurati di purificazione del DNA da cellule infette, seguita dalla quantificazione di PCR dei livelli di KSHV DNA; Tuttavia, uno non deve presupporre che tutti i genomi sono infettive45. Se lo studio del ciclo litico KSHV è destinato, la riattivazione del virus può essere ottenuta stimolando CE con agenti che inducono come descritto sopra per le cellule BCBL-1, anche se l'efficienza di riattivazione è inferiore23. Il ciclo litico può anche essere indotta da trasduzione della CE con la proteina di transactivator KSHV ORF5046. Coerente con i risultati in altri modelli di coltura cellulare di KS, sia espressione spontanea e induzione chimica di KSHV geni virali E6/E7-esprimendo CE diminuisce nel tempo nonostante la manutenzione di un'infezione latente stabile11,16 .

Figure 1
Figura 1: morfologia del mock - e KSHV infettati EC. (A) CE Mock-infettati monostrati esibire il classico cobble pietra aspetto di microscopia di contrasto di fase vitale. Senza le azioni dei geni KSHV queste cellule non vengono trasformate e saranno pertanto cessare dividendo e presentano inibizione da contatto dopo aver raggiunto la confluenza nella cultura. (B) cellule infettate da KSHV, al contrario, sviluppano una morfologia allungata "delle cellule dell'alberino" che ricorda delle cellule dell'alberino di KS. Questo pannello mostra la morfologia delle cellule infettate da KSHV giorno 5 PI giunti a confluenza. (C) cellule In KSHV-infettate, vasti cambiamenti nell'espressione genica delle cellule di host conducono alla trasformazione cellulare, che diventa evidente quando KSHV-infettate le cellule sono coltivate senza passaggio. In tali condizioni, cellule infettate da KSHV continuano anche dopo il raggiungimento di confluenza che conduce allo sviluppo dei fuochi a più strati delle cellule di proliferazione. Questo pannello mostra la morfologia delle cellule infettate da KSHV al giorno 14 PI, coltivate per post-confluenza 9 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: crescita indipendente Anchorage. Cellule non trasformate in genere subiscono apoptosi dopo la perdita di contatto con un substrato, un processo chiamato anoikis. (A) quando E6/E7-trasdotte mock-infettati CE, che non vengono trasformate, sono sospesi in agar molle e coltivate per due settimane che non formano colonie. (B) affetti da KSHV CE, che sono virus-ha trasformato, sono resistenti all'anoikis e formeranno colonie in agar molle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: dimostrazione dell'espressione della proteina virale. (A), la morfologia del mandrino è evidente a seguito di infezione con KSHV (ingrandimento 40x). (B) la macchiatura immunofluorescente del campo stesso mostrato in (A) dimostra che la morfologia del mandrino è associata con l'espressione della proteina virale latenza ORF73 (rosso). Cellule infette supportano replicazione litica pure, come dimostrato da una piccola percentuale di cellule che esprimono il pro viralecessivity fattore ORF59 (verde). (A e B per l'ultima volta da riferimento26.) La morfologia dell'alberino di cellule infettate con il virus di KSHV-BAC16 (C) è associata con l'espressione della GFP (D) (20 ingrandimenti). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oncogenesi sono un processo multifasico che aggira precauzioni importanti all'interno di un organismo36. Come lesione KS esistano lungo uno spettro di infiammazione cronica al veri sarcomi, delucidazione di alcuni processi patofisiologici mediata da KSHV richiede che alcuni studi condotti in modelli di coltura cellulare che supportano la trasformazione9. Va notato che la perdita di inibizione da contatto e la crescita ancoraggio-dipendente, fenotipi indicativi di trasformazione cellulare, non si sviluppano prontamente dopo l'infezione primaria CE o CE immortalata dall'espressione esogena della telomerasi. Pertanto, mentre il modello in vitro di KS qui descritto non ricapitolare tutti gli aspetti del microambiente tumorale KS o il comportamento di cellule KS espiantate, è specificatamente concepita per studiare i cambiamenti nell'host cella espressione genica indotta tramite l'infezione con KSHV che contribuiscono al tumorigenesis KS.

Il primo ha segnalato l'espressione genica Studio utilizzando il sistema di cultura descritto nel presente documento identificato il recettore tirosina chinasi c-Kit come collaboratore per il fenotipo trasformato di cellule infettate KSHV25. Abbattere di espressione di c-Kit utilizzando siRNA o inibizione di c-Kit segnalazione utilizzando che un dominante negativo costrutto o tirosina chinasi inibitore STI 571 (Imatinib) ha interferito con la capacità trasforma del manifesto KSHV da perdita di formazione di fuochi dopo prolungato cultura delle cellule infettate. Successiva valutazione clinica dell'Imatinib ha dimostrato l'efficacia di questo farmaco in pazienti con epidemia KS47,48,49. Altri potenziali obiettivi di trattamento inoltre sono state identificate, compreso del heme oxygenase-126,50, CXCR727e la beta adrenergici28, che svolgono un ruolo nella crescita o trasformazione di CE in vitro. Conferma di questi pattern di espressione genica in primaria CE così come il tessuto di biopsia KS conferma la rilevanza fisiologica di questo sistema e sottolinea il suo valore come un modello pre-clinico per KS terapeutica25,26, 51,52,53,54,55.

Altro punto di forza del sistema di trasduzione E6/E7 è che la durata di vita estesa immortalato rispetto al primario CE consente il mantenimento a lungo termine di età e cellule di passaggio-abbinati di controllo mock-infettati per valutazione comparativa dei risultati di KSHV infezione. È fondamentale notare che, al fine di massimizzare il numero di passaggi della CE trasformata con E6 ed E7 è fondamentale per dividere culture prima di raggiungere la confluenza (~ 85-90%). Inoltre, queste cellule tollerano condizioni privo di siero per periodi prolungati di tempo. CE primario rapidamente subire la morte programmata delle cellule al momento del ritiro del fattore di crescita e pertanto non può essere colta per lunghi periodi senza siero o fattori di crescita ricombinanti56,57. Questa dipendenza rende autocrino indotte tramite l'infezione con KSHV difficili da identificare e studiare, come prima della completa trasformazione cellule infettate da KSHV anche subirà la morte programmata delle cellule al momento del ritiro del fattore di crescita (dati non pubblicato di vie di segnalazione osservazione). La presenza delle proteine E6 ed E7 in questo modello, tuttavia, impedire la morte programmata delle cellule dopo ritiro di fattore di crescita e consentire per prolungato (ad es., 48h) cultura in basso del siero o del siero libero medio25,26 , 28.

KS è una malattia complessa e insolita con le caratteristiche di infiammazione cronica e di trasformazione cellulare. La necessità clinica di nuove strategie terapeutiche è ottima, e il modello della coltura cellulare qui descritto ha proprietà uniche che consentono la valutazione del candidato bersagli farmacologici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nessuno.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da K12 HD068322 (SCM); CA179921 R01 e P51 OD011092 (AVM); e premio 14PRE20320014 da America Heart Association (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Biologia del tumore numero 126 sarcoma di Kaposi linfoma primario di effusione KSHV trasformazione oncogenesi delle cellule endoteliali
Un modello <em>In Vitro </em>per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter