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Biology

Um modelo In Vitro para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor induzido por infecção pelo herpesvírus oncogênicos vírus humano herpesvírus-8/KS (HHV-8/KSHV). O modelo de cultura de células endoteliais descrito aqui é especialmente adequado para estudar os mecanismos pelos quais KSHV transforma células hospedeiras.

Abstract

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor incomum composto por proliferação de células fusiformes que é iniciado pela infecção das células endoteliais (CE) com KSHV e desenvolve-se mais frequentemente no cenário de imunossupressão. Apesar de décadas de pesquisa, tratamento ideal de KS permanece mal definido e os resultados clínicos são especialmente desfavoráveis em recursos limitados. Lesões do KS são conduzidas pela angiogênese patológica, inflamação crônica e mixomas, e vários em vitro celular cultura modelos foram desenvolvidos para estudar estes processos. KS surge a partir de células infectadas KSHV de origem endotelial, então CE-linhagem células fornecem os mais apropriado em vitro substitutos do precursor do fuso celular. No entanto, porque CE têm uma duração limitada em vitro , e que os mecanismos oncogênicos empregados pelo KSHV são menos eficientes do que aqueles de outros vírus oncogenicidade, tem sido difícil de avaliar os processos de transformação primária ou telomerase-imortalizada EC. Portanto, foi desenvolvido um modelo de romance cultura baseada em CE que suporta prontamente transformação após infecção com KSHV. Gravidez ectópica expressão dos genes E6 e E7 do vírus do papiloma humano tipo 16 permite a cultura prolongada de idade - e passagem-combinada mock e KSHV-infectados CE e apoia o desenvolvimento de um verdadeiramente transformado (i.e., oncogenicidade) fenótipo em culturas de células infectadas . Este modelo tractable e altamente reprodutível de KS tem facilitado a descoberta de várias vias de sinalização essenciais com elevado potencial para a tradução em ambientes clínicos.

Introduction

Sarcoma de Kaposi (KS) é um tumor de angioproliferativas multi focal afetando sites dérmicas, da mucosa e viscerais que se desenvolve mais comumente na configuração de imunossupressão avançada1. Quatro formas epidemiológicas têm sido descritas: clássico, uma forma indolente que normalmente afeta idosos do património do Mediterrâneo e do Médio Oriente; iatrogênica, resultantes de tratamento com imunossupressores após um transplante de órgão; epidemia, um câncer AIDS-definindo; e endêmicas, uma forma de HIV independente comum em crianças em regiões endêmicas na África. Com o advento dos regimes de drogas anti-retrovirais combinação eficaz para o tratamento do HIV, a epidemia KS é muito menos comumente diagnosticado nos países em desenvolvimento. No entanto, as formas endêmicas e epidêmicas clinicamente agressivas continuam entre os mais comumente diagnosticado câncer em muitos países africanos2,3,4. Portanto, identificação dos medicamentos eficazes patogênese-alvo para o tratamento de KS é uma prioridade de pesquisa.

Histologicamente, as lesões do KS caracterizam-se por neovascularização extensa mas anormal no qual células fusiformes de origem CE formam redes vasculares descontínuos5. Esses vasos anormais ("vasculares fendas") permitem o extravasamento de eritrócitos, que dão lesões sua cor característica. Além disso, lesões contêm numerosos leucócitos que caracterizam a inflamação crônica (ou seja, linfócitos, macrófagos e plasmócitos). Regressão das lesões do KS após reconstituição imunológica tem sido descrita, sugerindo que o KS tem características de uma lesão proliferativa-hiper e um tumor verdadeiro6,7,8,9.

Herpesvírus de KS (KSHV), o agente causador da KS, foi identificado em 199410. Desde então muitos em vitro cultura celular modelos foram desenvolvidos para permitir estudos de patogênese, incluindo células explantados do material de biópsia do tumor e primária ou telomerase-expressando CE infectado com KSHV em vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. nenhum dos modelos atualmente disponíveis totalmente recapitula o microambiente do tumor KS, mas todos contribuíram com valiosos conhecimentos para nosso entendimento sobre o Patobiológico de infecção KSHV. Ao contrário de outro conhecido oncogenicidade herpesvirus humano vírus Epstein - Barr (EBV), KSHV prontamente não transformar células em cultura, seguindo de novo infecção19,20,21, 22. no entanto, esta limitação foi superada pela transducing CE humano primário de um misto de origem linfática ou microvascular com o E6 e E7 genes do vírus do papiloma humano tipo 16 antes da infecção com KSHV23,24 . Expressão de oncogenes estes exógenas aumenta drasticamente o potencial transformador de KSHV em vitro em parte fornecendo mais inibição do retinoblastoma proteína e p5323,24. Este método de transdução CE permitiu vários laboratórios para identificar alterações chaves host de expressão gênica de células que são induzidas pela infecção KSHV e que aparecem para facilitar KS célula sobrevivência e proliferação25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. os protocolos descritos neste documento são simples e altamente reprodutível e resultará na geração de idade - e passagem-combinada CE KSHV infectados e controles infectados por simulação que podem ser cultivadas por mais tempo que as células primárias e serão permitem a investigação de mecanismos oncogênicas empregado pelo KSHV. Embora o protocolo inclui um método para a produção de tipo selvagem KSHV da linha de celular de linfoma primário de efusão BCBL-1, CE E6/E7-imortalizado também são altamente suscetíveis à infecção com BACmid recombinante derivado KSHV-BAC1630. Protocolos para a preparação de BAC16 são descritos em outro lugar33,34.

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Protocol

Nota: todos os procedimentos descritos no presente protocolo devem ser realizados sob condições de BSL-2.

1. preparação de estoque KSHV

  1. buffer de TNE preparar: dissolver 292,24 mg EDTA em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Dissolver 605,7 mg Tris em ddH 2 O, trazer a 225 mL e ajustar o pH 8. Combine as soluções de EDTA e Tris, adicionar 4,38 g NaCl, ajustar volume final de 500 mL, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° C .
  2. Cultura o KSHV-positivo, EBV-negativo efusão primária linfoma célula linha BCBL-1 numa incubadora umidificado em 37 ° C, mais 5% de CO 2 em RPMI suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e antimicrobianos para aproximadamente 1 a 1.2 x 10 6 células / mL.
  3. Para induzir a produção de KSHV, dividir culturas 1:2 com meio fresco e adicione Phorbol Myristate 12 13-acetato (PMA) a uma concentração final de 20 ng/mL e incubar as culturas por 5 dias. Como alternativa, tratar as células com butirato de sódio (NaB; 0,1 mM) por 3 dias para induzir a replicação viral lítica.
  4. Para coletar partículas virais, primeiro centrifugar a cultura sobrenadante a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente para as células de pelotas e transferir sobrenadantes para tubos frescos.
  5. Para esclarecer o sobrenadante por forma a evitar a transferência dos restos celulares, centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    Observação: como alternativa para centrifugação de alta velocidade para esclarecimentos de sobrenadantes de cultura, filtração através de uma estéril 0,45 µm filtro pode ser executado. Temos observado uma queda significativa no título usando filtragem; Portanto, rotineiramente realizamos a segunda etapa de centrifugação em vez disso.
  6. Em seguida, sobreposição de 5 mL de solução de sacarose 25% em tampão TNE com cerca de 30 mL da cultura esclareceu sobrenadante em 6 tubos de se.
  7. Centrífuga equilibrado tubos a 75.000 x g, durante 2 h a 4 ° C, sob vácuo.
  8. Decante o sobrenadante de cultura e borre a borda de cada tubo para remover tanto solução sobrenadante e sacarose quanto possível e, em seguida, Ressuspender o vírus, que pode não ser visível, em 150 µ l de tampão TNE.
  9. Vírus da piscina todas resuspended, misture bem e congelar 25 alíquotas µ l a -80 ° C .

2. Transdução da CE com E6 e E7 Papillomavirus Genes

Nota: rotineiramente utilizamos frascos de cultura de tecido padrão para o cultivo primário EC. No entanto, se crescimento insatisfatório da CE é obtido então o uso de frascos de cultura comercial deve ser considerado.

  1. Cultura primária humana dérmica microvascular ou linfática CE numa incubadora umidificado em 37 ° C, acrescido de 5% de CO 2 em meio de crescimento do CE (EGM; contém CE basal suplementado [EBM] com EGM-2 BulletKit [FBS, que contém Hidrocortisona, fator de crescimento do fibroblasto humano-B, fator de crescimento vascular CE, fator de crescimento semelhante à insulina 1, ácido ascórbico, fator de crescimento epitelial humana, antibióticos e heparina]) num frasco de cultura celular T75 para aproximadamente 50% confluência.
  2. Para transdução, cultura PA317 LXSN 16E6E7 pilhas de 24 , 35 numa incubadora umidificado a 37 ° C mais 5% de CO 2 em DMEM suplementado com 10% FBS e antimicrobianos em um T150 celular cultura balão até que eles são cerca de 90% de Confluencia. Então incubar durante uma noite em 16 mL de meio.
  3. Esclarecer o meio PA317 por centrifugação a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Retirar as células de cultura e sobreposição de CE com 12 mL de meio de PA317 esclareceu a EGM e incubar durante 4 h.
    Nota: Centrifugação 16 mL do meio condicionado a 300 x g, durante 5 min resultados em um sedimento compacto que não é perturbada pela cuidado posterior remoção de 12 mL de sobrenadante clarificado. No entanto, se a transferência de células de 16E6E7 de LXSN de PA317 de culturas primárias de CE é uma preocupação (a linha de celular embalagens rapidamente outgrow CE), em seguida filtração do líquido sobrenadante condicionado através de um filtro de 0,45 µm antes da transferência pode ser realizada.
  5. Substituir 6 mL do meio de PA317 com EGM fresco e incubar durante uma noite.
  6. CE refeed com 12ml EGM fresco e incubar um mais h. 48
  7. Para a subcultura do CE, remover médio e lave com 12 mL de PBS sem cações e adicionar 3 mL de solução de dissociação enzimática comercial (por exemplo, TrypLE) por e incubar a 37 ° C por 3 min.
  8. Transferência de suspensão de células para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Resuspenda o pellet de células resultante em EGM fresco e dividir uniformemente em 3 frascos de x T75 com um volume final de 12 mL EGM por balão.
  9. Para selecionar para CE transfectada com E6 e E7, adicionar G418 para uma concentração final de 200 µ g/mL para duas passagens, após o qual a CE transduzida pode ser chapeada para infecção ou congelada em nitrogênio líquido.

3. Infecção da CE Transduced com KSHV

  1. no dia antes da infecção, colher CE por digestão enzimática, usando a solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima. Resuspenda o pellet de células em 1 mL de EGM. Use 5 µ l de células para preparar uma diluição 1/10 em Trypan azul. Contar as células ao vivo usando um hemocytometer e semente 2,5 x 10 5 células vivas em 2 mL de EGM por bem em 6 pratos bem.
  2. No dia de infecção, remover EGM lavar células com 3 mL de PBS com cálcio e magnésio por bem, e em seguida, adicione 2 mL EBM.
    Nota: É essencial usar EBM, em vez de EGM durante a infecção, como a heparina na EGM inibirá a vinculação de partículas virais para e posterior infecção do destino EC.
  3. Para infectar as células com KSHV, adicione o caldo de vírus de 5 a 20 µ l de cada poço e agite o prato para misturar. Para células infectadas por simulação adicionem igual volume de tampão TNE a cada poço.
  4. Centrifugar as placas a 400 x g durante 30 min à temperatura ambiente e então incubar as placas a 37 ° C por 90 min.
  5. Se o objetivo do estudo é investigar os primeiros eventos que exigem uma síncrona infecção viral, por exemplo, eventos iniciais na infecção de novo, retire o inóculo viral neste ponto. Enxaguar e refeed as células com 2ml EGM fresco. Caso contrário, adicione 2 mL EGM e incubar as culturas durante a noite.
  6. Refeed células com 2ml EGM o dia após a infecção e depois todos os outros dias.
  7. Quando as células são aproximadamente 90% de confluencia, colheita por digestão enzimática, usando solução de dissociação enzimática comercial conforme descrito acima e, em seguida, as células de três poços em um T75, observando o número total de passagem e a passagem da piscina pós-infecção.
  8. Expandir mock e KSHV-infectados CE com divisões de 1:3 pelo menos duas passagens mais, momento em que as células podem ser utilizadas em experiências ou congeladas em nitrogênio líquido.
    Nota: Tal como acontece com a divisão de CE transfectada com E6 e E7, culturas de manutenção de simulação e KSHV-células infectadas por devem ser divididas antes de chegar a confluência (~ 85 a 90%).

4. confirmando infecção com KSHV por imunofluorescência

Nota: deteção do KSHV associada a latência nuclear antígeno (LANA-1/ORF73) fornece uma medida quantitativa confiável da infecção. Anticorpos anti-LANA estão comercialmente disponíveis.

  1. o dia antes da coloração, poços de placa dois, cada um com simulação ou KSHV-infectados CE sobre uma placa de 24 a 1 x 10 5 células por bem em 1 mL EGM e incubar durante uma noite.
  2. Células de lavar duas vezes com 500 µ l de PBS e mais cálcio e magniseum. Lave por 30 s, sobre uma plataforma oscilante.
  3. Em uma coifa externamente-ventillated, consertar as células com 500 µ l de paraformaldeído 4% por 15 min à temperatura ambiente.
  4. Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem (0,1% Triton X-100 mais soro de cabra 0,02% em PBS mais cátions).
  5. Bloquear células com 500 µ l de soro de cabra 2% em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente.
  6. Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.
  7. Etiqueta de um poço de simulação ou KSHV-infectados CE com 200 µ l de anticorpo primário diluído 01:100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um roqueiro. Incubar os restantes dois poços em 200 µ l de tampão de lavagem apenas.
  8. Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.
  9. Rotular todos os quatro poços com 200 µ l de anticorpo secundário diluído 1: 100 em tampão de lavagem durante 30 min à temperatura ambiente em um balancim.
  10. Lavar as células três vezes com 500 µ l de tampão de lavagem.
  11. a cada poço aplicar 20 µ l de montagem DAPI contendo médio e uma lamela e avaliar a mancha usando um microscópio fluorescente invertido.
  12. Determinar a infecção por cento das células infectadas KSHV contando o número de núcleos de LANA-positivo pelo menos 200 células. Infecção com recombinante KSHV-Bac16 também pode ser monitorado através da observação de culturas para a expressão de GFP.

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Representative Results

A morfologia da CE primário é classicamente descrita como "pedra do godo", e esta morfologia não é alterada pela expressão do papilomavírus E6 e E7 genes (figura 1A). Expressão dos genes E6 e E7 sozinhos não induz um fenótipo transformado; assim, as células são suscetíveis a entrar em contato com a inibição e cessarão dividindo ao atingir a confluência na cultura. As células serão no entanto proliferam e regenerar a confluência tripsinização e replating em uma densidade mais baixa, permitindo a manutenção das culturas de idade - e passagem-combinada para uso como controles infectados por simulação.

Infecção da CE E6/E7-transfectadas com KSHV provoca alterações morfológicas dramáticas na cultura que lembram o fenótipo de "células" observado em lesões do KS (figura 1B). Um fenótipo transformado também é induzido ao ser infectado com KSHV, que se manifesta em parte pela perda da inibição de contato quando as células são cultivada pós-confluência (Figura 1) e o crescimento independente de ancoragem em ágar macio (Figura 2). Perda da inibição de contato e interações da matriz extra-celular (fixação) a dependência durante mixomas são duas das marcas registradas da transformação celular36. É importante notar que a CE primário também são suscetíveis à infecção com KSHV e sistemas primários de CE tem sido extremamente valiosos para elucidar diversos aspectos da interação vírus-hospedeiro e suas consequências. Tais estudos estão bem representados na literatura e vários exemplos são citados neste documento37,38,39,40,41,42,43 ,44.

A coloração imunofluorescente demonstra que a morfologia do eixo de células infectadas KSHV está associada a expressão da proteína viral LANA-1/ORF73 (Figura 3A e 3B, vermelho). Como a concentração de vírus em ações pode variar entre preparações, o volume de vírus adicionado por bem deve ser ajustado para que culturas infectadas KSHV atingir > 90% infecção dentro de uma ou duas passagens. Com passagem serial a porcentagem de infecção vai abordar a 100% e será mantida para a duração da cultura (aproximadamente 20 passagens). Menor quantidade de vírus pode ser usada se destina-se um estudo de influências parácrina, ou se as células não infectadas adjacentes são desejáveis como controles (por exemplo, para estudos de imunofluorescência, envolvendo outras proteínas de interesse). Culturas infectadas também oferecem suporte a expressão das proteínas virais líticas, mas, como é observado em lesões do KS, apenas uma minoria das células em cultura espontaneamente vai sofrer reativação lítica (Figura 3B, verde). Células infectadas com KSHV-BAC16, que é marcado com as boas práticas agrícolas, também desenvolveram uma morfologia do eixo (Figura 3 e 3D). Quando KSHV-BAC16 é usado, títulos virais podem ser obtidos por infectar as células com um estoque de vírus concentrado serialmente diluída e avaliando as células para expressão de GFP na infecção de 48 h post usando o fluxo cytometry30.

Para recombinante e vírus WT, genomas virais em preparações de estoque também podem ser medidas pela purificação de DNA de células infectadas, seguido de quantificação de PCR dos níveis de ADN KSHV; no entanto, um não deve presumir que todos os genomas são infecciosas45. Se o estudo do ciclo lítico KSHV destina-se, a reativação do vírus pode ser conseguida estimulando CE com indução de agentes como descrito acima para células BCBL-1, embora a eficiência de reativação é menor23. O ciclo lítico também pode ser induzido por transdução da CE com a proteína liberada KSHV ORF5046. Consistente com resultados de outros modelos de cultura celular de KS, ambos manifestação espontânea e indução química de KSHV líticas genes E6/E7-expressando CE diminui ao longo do tempo, apesar da manutenção de uma infecção latente estável11,16 .

Figure 1
Figura 1: morfologia de simulação - e KSHV infectado EC. (A) exposição de monocamadas CE Mock-infectado o godo clássico pedra aparência por microscópio de contraste de fase vital. Sem as ações dos genes KSHV estas células não são transformadas e serão portanto cessar dividindo e exibem inibição de contato ao atingir a confluência na cultura. (B) células infectadas por KSHV, em contraste, desenvolvem uma morfologia alongada "células" reminiscência de células fusiformes de KS. Este painel mostra a morfologia das células infectadas KSHV no dia 5 PI ao atingir a confluência. (C) células infectadas por em KSHV, grandes mudanças na expressão de gene de pilha de anfitrião levam a transformação celular, que se torna evidente quando células infectadas KSHV são cultivadas sem passagem. Sob tais condições, as células infectadas KSHV continuam proliferando mesmo depois de atingir a confluência, levando ao desenvolvimento de focos de várias camados de células. Este painel mostra a morfologia das células infectadas KSHV no dia 14 PI, cultivada por pós-confluência 9 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: crescimento independente de Anchorage. Sem transformação células normalmente passam por morte celular apoptótica, seguindo a perda de contato com um substrato, um processo chamado anoikis. (A) quando E6/E7-transfectadas mock-infectados CE, que não são transformadas, são suspensas em ágar macio e cultivadas por duas semanas, que eles não formam colônias. (B) CE KSHV infectados, que são vírus-transformadas, são resistente à anoikis e irá formar colônias em ágar macio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: demonstração da expressão da proteína viral. (A), a morfologia do eixo é evidente após infecção com KSHV (ampliação de 40 X). (B) coloração imunofluorescente do mesmo campo mostrado em (A) demonstra que a morfologia do eixo está associada a expressão da proteína viral latência ORF73 (vermelho). Células infectadas oferecer suporte à replicação viral lítica também, como demonstrado por uma pequena percentagem de células expressando o viral processivity factor ORF59 (verde). (A e B modificado da referência26.) A morfologia do eixo de células infectadas com vírus KSHV-BAC16 (C) está associada com a expressão de GFP (D) (ampliação de 20 X). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Mixomas é um processo de várias etapas que contorna precauções importantes dentro de um organismo de36. Como lesões do KS existem ao longo de um espectro de inflamação crônica a verdadeiras sarcomas, elucidação de determinados processos fisiopatológicos mediada por KSHV requer que ser realizados alguns estudos em modelos de cultura de células que suportam transformação9. Note-se que a perda da inibição de contato e crescimento dependente de ancoragem, fenótipos indicativos de transformação celular, não desenvolvem prontamente após a infecção primária CE ou CE imortalizado por exógeno expressão da telomerase. Portanto, enquanto o modelo em vitro de KS descrito aqui não recapitular todos os aspectos do microambiente do tumor KS ou comportamento de células de KS explantados, ele é especialmente adequado para estudar mudanças na expressão de gene de célula hospedeiro induzida por infecção com KSHV que contribuem para a tumorigênese KS.

O primeiro relatou estudo usando o sistema de cultura descrito neste documento de criação de perfil de expressão gênica identificou o c-Kit receptor tirosina quinase como contribuinte para o fenótipo transformado de células infectadas KSHV25. Derrubar de expressão de c-Kit usando siRNA ou inibição de c-Kit sinalização usando um dominante negativa construção ou tirosina quinase inibidor STI-571 (Imatinib) interferiu com a capacidade transformadora do manifesto KSHV pela perda da formação de focos, após uma prolongada cultura de células infectadas. Posterior avaliação clínica de imatinibe demonstrou a eficácia desta droga em pacientes com epidemia KS47,,48,49. Outros potenciais alvos de tratamento também foram identificados, incluindo heme oxigenase-126,50, CXCR727e a beta receptores adrenérgicos28, os quais desempenham um papel no crescimento ou transformação de CE in vitro. Confirmação desses padrões de expressão de gene na primária CE, bem como tecido de biópsia KS confirma a relevância fisiológica deste sistema e ressalta seu valor como um modelo pré-clínico para KS terapêutica25,26, 51,52,53,54,55.

Outra força do sistema de transdução E6/E7 é que o tempo de vida estendido do imortalizado em comparação com primário CE permite a manutenção a longo prazo da idade e células de passagem-combinados controle mock-infectados para avaliação comparativa dos resultados da KSHV infecção. É importante notar que, a fim de maximizar o número de passagens da CE transfectadas com E6 e E7 é crítico para dividir culturas antes de chegar a confluência (~ 85 a 90%). Além disso, estas células toleram condições isento de soro por longos períodos de tempo. CE primária rapidamente submetido a morte celular programada após retirada do fator de crescimento e, portanto, não pode ser cultivada por longos períodos sem soro ou fatores de crescimento recombinante56,57. Esta dependência torna autócrina vias induzidas por infecção com KSHV difíceis de identificar e estudar, como antes da transformação completa de células infectadas KSHV também passará por morte celular programada após retirada do fator de crescimento (inédita de sinalização Observação). A presença das proteínas E6 e E7 neste modelo, no entanto, impedir a morte celular programada após retirada do fator de crescimento e permitir a prolongada (por exemplo, 48 h) cultura em baixo soro ou soro livre médio25,26 , 28.

KS é uma doença complexa e incomum com características da inflamação crônica e transformação celular. A necessidade clínica de novas estratégias terapêuticas é grande, e o modelo de cultura celular aqui descrito tem propriedades únicas que permitem a avaliação do candidato alvos de drogas.

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Disclosures

Nenhum.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo HD068322 K12 (SCM); R01-CA179921 e OD011092 P51 (AVM); e o prêmio 14PRE20320014 de associação de coração da América (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

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Biologia do câncer edição 126 sarcoma de Kaposi linfoma de efusão primária KSHV transformação mixomas célula endotelial
Um modelo <em>In Vitro </em>para o estudo transformação celular por Herpesvirus Sarcoma de Kaposi
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