Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

В Vitro модель для изучения клеточных трансформации, саркома Капоши герпеса

Published: August 25, 2017 doi: 10.3791/54828
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2
1Division of Pediatric Infectious Diseases, University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute, Oregon Health and Science University

Summary

Саркома Капоши (KS) представляет собой опухоль, вызванных инфекцией с онкогенный вирус герпеса человека герпеса-8/KS (HHV-8/KSHV). Описанная здесь модель культуры эндотелиальных клеток однозначно подходит для изучения механизмов, которыми KSHV трансформирует клетки хозяина.

Abstract

Саркома Капоши (KS) является необычным опухоли, состоящий из пролиферирующих клеток шпинделя, инициируется инфекции эндотелиальных клеток (EC) с KSHV и чаще всего развивается в параметре иммуносупрессии. Несмотря на десятилетия исследований оптимальное лечение KS остается плохо определены и клинические исходы, особенно неблагоприятных в условиях ограниченных ресурсов. KS поражения движет патологический ангиогенез, хроническое воспаление и онкогенеза, и были разработаны различные в пробирке клеток культуры модели для изучения этих процессов. KS возникает от KSHV-инфицированных клеток эндотелия происхождения, поэтому EC-линии клетки обеспечивают наиболее подходящим в vitro суррогаты шпинделя клеток прекурсора. Однако, потому что ЕС имеют срок действия ограниченной в пробирке , и как онкогенных механизмов, используемых KSHV менее эффективны, чем другие онкогенной вирусов, это было трудно оценить процессы трансформации в начальной или Теломераза увековечен EC. Таким образом, что легко поддерживает преобразование после инфекции с KSHV была разработана модель Роман культуры, основанной на ЕС. Эктопическая выражение генов E6 и E7 вирусом папилломы человека типа 16 позволяет расширенный культуры из соответствует возрасту и проход макета и KSHV инфицированных - EC и поддерживает развитие действительно превращается (т.е. онкогенной) фенотип в зараженных клеточных культур . Эта шансов справиться с возникающими и высокую воспроизводимость модель KS способствовало открытие нескольких основных сигнальных путей с высоким потенциалом для перевода на клинических параметров.

Introduction

Саркома Капоши (KS) является мульти фокуса angioproliferative опухоли, затрагивающих дермы, слизистых оболочек и висцеральных сайты, которые чаще всего развивается в условиях современных иммуносупрессия1. Были описаны четыре эпидемиологических формы: классика, праздного форма, которая обычно затрагивает пожилых людей наследия Средиземноморья и Ближнего Востока; Ятрогенные, приводя к от лечения с иммуносупрессивных препаратов, после трансплантации; эпидемия СПИДа определение рака; и эндемичные, ВИЧ независимые формы, часто встречается у детей в эндемичных регионах в Африке. С появлением эффективного сочетания схем антиретровирусного препарата для лечения ВИЧ эпидемии KS гораздо менее часто диагностируется в развивающихся странах. Однако клинически агрессивные формы эндемических и эпидемических остаются среди наиболее часто диагноз рака в многих африканских стран2,,3-4. Таким образом определение эффективных ориентированных на патогенез препаратов для лечения KS является приоритетом исследования.

Гистологически KS поражений характерны обширные но ненормальное неоваскуляризация, whereby шпинделя клетки ЕС происхождения формируют разрывными сосудистой сети5. Эти аномальные судов («сосудистые прорезями») позволяют экстравазации эритроцитов, которые дают поражения их характерный цвет. Кроме того поражения содержат многочисленные лейкоцитов, которые характеризуют хронического воспаления (т.е., лимфоцитов, макрофагов и плазматические клетки). Был описан регрессия новообразований KS, после восстановления иммунитета, предполагая, что KS имеет черты как гипер Пролиферативная поражения и истинный опухоли6,,78,9.

KS герпеса (KSHV), возбудителя KS, была определена в 1994 году10. С затем многие в vitro клеточной культуры модели были разработаны чтобы включить исследования патогенеза, включая клетки описаны от опухоли биопсийного материала и начальной или теломеразы выражая EC инфицированных KSHV в vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ни одно из имеющихся в настоящее время модели полностью повторяет KS микроокружения опухоли, но все внесли ценные знания для нашего понимания pathobiology KSHV инфекции. В отличие от других известных онкогенной человеческого герпеса вирус Эпштейна - Барр (EBV), KSHV не легко превратить клетки в культуре, после de novo инфекции19,20,21, 22. Тем не менее, это ограничение было преодолено путем преобразования первичного человека ЕС либо смешанные микрососудистой или лимфатическую происхождения с E6 и E7 гены от вируса папилломы человека типа 16 до инфекции с KSHV23,24 . Выражение этих внешних онкогенов резко увеличивает преобразование потенциал KSHV в пробирке в части путем создания дополнительных ингибирование ретинобластомы белка и p5323,24. Этот метод трансдукции ЕС позволило несколько лабораторий для выявления ключевых изменений в принимающей ячейки экспрессии генов, вызванных KSHV инфекции и что, как представляется, облегчения KS ячейку выживания и распространения25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. протоколы, описанные здесь, являются простыми и высокую воспроизводимость и приведет к генерации соответствует возрасту и проход KSHV-инфицированных EC и инфицированных макет элементов управления, которые могут быть культивировали гораздо дольше, чем первичные элементы и будет возможность для расследования онкогенных механизмов, используемых KSHV. Хотя протокол включает метод для производства дикого типа KSHV от первичного выпота Лимфома клетки линии BCBL-1, Е6, Е7 увековечено EC также очень восприимчивы к инфекции с рекомбинантным BACmid производные KSHV-BAC1630. Протоколы для приготовления BAC16 описаны в других местах33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: все процедуры, описанные в настоящем протоколе должны выполняться в условиях BSL-2.

1. Подготовка KSHV фондовая

  1. подготовить TNE буфера: распустить 292.24 мг ЭДТА в ddH 2 O, довести до 225 мл и приспособиться к рН 8. Растворяют 605.7 мг трис ddH 2 O, довести до 225 мл и приспособиться к рН 8. Объединить решения ЭДТА и трис, добавить 4.38 г NaCl, окончательного громкость до 500 мл, фильтрации стерилизации и хранить при 4 ° C .
  2. Культура KSHV-позитивных, EBV-отрицательных первичной выпота лимфомы клеток линии BCBL-1 в увлажненные инкубатора при 37 ° C плюс 5% CO 2 в RPMI, дополненная 10% тепло инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС) и противомикробных препаратов для примерно 1 1,2 х 10 6 клеток / мл.
  3. Чтобы заставить KSHV производства, Сплит культур 1:2 с свежим среднего и добавить Phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) до конечной концентрации 20 нг/мл и инкубировать культур на 5 дней. В качестве альтернативы лечения клетки с натрия бутират (NaB; 0,1 мм) на 3 дня побудить литические вирусной репликации.
  4. Урожай вирусных частиц, сначала центрифуга супернатант в 300 g x 5 мин при комнатной температуре Пелле клетки и передать свежие трубы supernatants культуры.
  5. Для дальнейшего уточнения супернатант во избежание передачи сотовой мусора, центрифуги на 2500 x g 10 мин на 4 ° C.
    Примечание: в качестве альтернативы для высокая скорость центрифугирования для разъяснения supernatants культуры, фильтрация через стерильную 0,45 мкм фильтром может выполняться. Мы наблюдали значительное падение в титре, с помощью фильтрации; Таким образом, мы регулярно выполнять второй шаг центрифугирования вместо.
  6. Следующая, наложение 5 мл 25% раствора сахарозы в TNE буфер с примерно 30 мл осветленный культуры супернатант в 6 трубок ультрацентрифугирования.
  7. Центрифуг сбалансированный трубы на 75 000 x g втечение 2 ч при температуре 4 ° C под вакуумом.
  8. Сцеживаться культуры супернатанта и промокните края каждой трубы, чтобы удалить столько супернатант и сахароза решение как можно скорее, а затем Ресуспензируйте Пелле вирус, который может быть не видна, то в 150 мкл буфера TNE.
  9. Пула все высокомобильна вирус, перемешать и заморозить 25 мкл аликвоты -80 ° c .

2. Трансдукция EC с E6 и E7 папилломы генов

Примечание: мы обычно используют стандартные культуры ткани колбы для выращивания основных EC. Однако, если получен неудовлетворительный роста ЕС затем использование коммерческой культуры фляги должны рассматриваться.

  1. Культуры первичного человеческого кожного микрососудистой или лимфатическую ЕС в увлажненные инкубатора при 37 ° C плюс 5% CO 2 в среде EC роста (EGM; содержит EC базальной среднего [EBM] ДОПОЛНЕНО BulletKit ЭГМ-2 [содержащие FBS, гидрокортизон, фактор роста фибробластов человека-B, сосудистый фактор роста ЕС, инсулиноподобный фактор роста-1, аскорбиновая кислота, человеческого эпителиального фактора роста, антибиотики и гепарин]) в колбе культуры клеток T75 до приблизительно 50% слияния.
  2. Для трансдукции, культуры PA317 LXSN 16E6E7 клеток 35 24 , в увлажненные инкубатора при 37 ° C плюс 5% CO 2 в DMEM, дополненная 10% FBS и противомикробных препаратов в T150 клетки культуры колбе до тех пор, пока они являются около 90% притока. Затем на ночь инкубировать в 16 мл среды.
  3. Уточнить PA317 среднего центрифугированием при 300 g x 5 мин при комнатной температуре.
  4. Удалить EGM EC культуры и наложение ячеек с 12 мл осветленный PA317 среды и проинкубируйте 4 х.
    Примечание: Центрифугирование 16 мл кондиционером среды на 300 g x 5 мин результатов в компактный Пелле, который не нарушается путем тщательного последующего удаления 12 мл осветленный супернатант. Однако, если передачи PA317 LXSN 16E6E7 клеток первичной EC культур является проблемой (клеточная линия упаковки быстро перерастет EC), затем фильтрация кондиционером супернатант через фильтр 0,45 мкм до перевода может производиться.
  5. Заменить свежим EGM 6 мл PA317 среды и инкубировать на ночь и.
  6. Refeed EC с 12 мл свежего EGM и инкубировать еще 48 ч.
  7. К югу культуры ЕС, удалите среднего и мыть с 12 мл PBS без катионов и добавить 3 мл раствора коммерческих ферментативные диссоциации (например, трехкратная) и инкубировать при 37 ° C на 3 мин
  8. Передавать Конические трубки 15 мл суспензии клеток и центрифуги на 300 x g 5 мин при комнатной температуре. Ресуспензируйте результирующий Пелле клеток в свежих EGM и равномерно разделить на 3 x T75 колбы с окончательный объем 12 мл EGM за флакон.
  9. Для выбора для EC преобразованы с E6 и E7, добавить G418 в конечной концентрации 200 мкг/мл для двух ходов, после чего transduced EC могут быть покрытием для инфекции или замороженные в жидком азоте.

3. Инфекция преобразованы EC с KSHV

  1. в день до инфекции урожай ЕС путем ферментативного пищеварения, используя коммерческие ферментативные диссоциации решение, как описано выше. Ресуспензируйте Пелле клеток в 1 мл EGM. Используйте 5 мкл клеток подготовить 1/10 разрежения в Трипановый синий. Количество живых клеток с помощью Горяева и семян 2,5 x 10 5 живых клеток в 2 мл EGM на скважину в 6 хорошо пластин.
  2. В день инфекции, удалите внеочередного общего собрания акционеров и вымыть клетки с 3 мл PBS с кальция и магния в колодец, а затем добавьте 2 мл дм.
    Примечание: Важно использовать EBM, вместо того, чтобы EGM во время инфекции, как гепарин в Собрании будет тормозить привязки вирусных частиц и последующего заражения целевой EC.
  3. Заразить клетки с KSHV, добавить 5 до 20 мкл вирус запасов для каждой скважины и вихрем пластины для смешивания. Макет инфицированные клетки добавить равное количество TNE буфера для каждой скважины.
  4. Центрифуга для плит на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре и затем инкубировать пластины при 37 ° C 90 мин
  5. Если цель исследования — расследовать ранних событий, требующих синхронного вирусной инфекции, например, ранние события в de novo инфекции, удалите вирусный посевным материалом на данный момент. Ополосните и refeed клетки с 2 мл свежего EGM. В противном случае, добавить 2 мл внеочередного общего собрания акционеров и инкубировать культур на ночь и.
  6. Refeed клетки с 2 мл EGM день после инфекции и затем каждый день.
  7. Когда клетки являются около 90% притока, урожай путем ферментативного пищеварения с использованием коммерческих ферментативные диссоциации решение, как описано выше, а затем объединить клетки с трех скважин в T75, отмечая числа общей проход и проезд послеоперационные инфекции.
  8. Разверните узел Макет - и KSHV-инфицированных ЕС с 1:3 разбиений для по крайней мере два больше проходы, в котором время клетки могут быть использованы в экспериментах или замороженные в жидком азоте.
    Примечание: Как с расщепление EC преобразованы с E6 и E7, культуры обслуживания макет - и KSHV-инфицированных клеток должна быть разделена в до достижения слияния (~ 85-90%).

4. подтверждения инфекции с KSHV, иммунофлюоресценции

Примечание: обнаружение KSHV задержка связанные ядерного антигена (Лана-1/ORF73) обеспечивает надежную количественную оценку инфекции. Анти-Лана антитела являются коммерчески доступными.

  1. За день до окрашивания, лунках два друг с макет - или KSHV-инфицированных ЕС на пластине 24-ну 1 х 10 5 клеток за хорошо в 1 мл внеочередного общего собрания акционеров и инкубировать на ночь.
  2. Клетки мыть дважды с 500 мкл PBS плюс кальция и magniseum. Стирка для 30 s на качающейся платформе.
  3. В внешне ventillated Зонта, исправить клетки с 500 мкл параформальдегида 4% за 15 мин при комнатной температуре.
  4. Мыть клетки три раза с 500 мкл буфера мытья (0,1% тритон X-100 плюс 0,02% козьего сыворотки в PBS плюс катионов).
  5. Блок клеток с 500 мкл 2% козьего сыворотки в буфере мыть за 30 мин при комнатной температуре.
  6. Мыть клетки три раза с 500 мкл буфера мытья.
  7. Этикетка одной скважины в макет или KSHV инфицированных - EC с 200 мкл основное антитело разводят 1:100 в буфере мыть за 30 мин при комнатной температуре на рокер. Инкубировать оставшиеся две скважины в 200 мкл мыть только буфера.
  8. Мыть клетки три раза с 500 мкл буфера мытья.
  9. Этикетка все четыре скважины с 200 мкл вторичное антитело разводят 1: 100 в буфере мыть за 30 мин при комнатной температуре на рокер.
  10. Мыть клетки три раза с 500 мкл буфера мытья.
  11. Каждой скважины применяют 20 мкл монтажа средних содержащие DAPI и coverslip и оценивать окрашивание с помощью инвертированного микроскопа флуоресцентные.
  12. Определить процент инфекции KSHV-инфицированных клеток путем подсчета числа ядер Лана положительным в по крайней мере 200 клеток. Инфекции с рекомбинантной KSHV-Bac16 может также контролироваться через наблюдение культур для выражения гена GFP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Морфология первичных EC классически описал как «булыжник камень», и этот морфология не изменено выражением папилломы E6 и E7 генов (рис. 1A). Экспрессии генов E6 и E7, только не побудить преобразованной фенотип; Таким образом клетки подвержены связаться торможение и прекратит деления дойдя до впадения в культуре. Клетки будут однако пролиферировать и вырастить до слияния trypsinization и replating в более низкую плотность, позволяя для поддержания культур соответствует возрасту и проход для использования как инфицированных макет элементов управления.

Заражения E6/E7-преобразованы EC с KSHV драматические морфологические изменения в культуре, которые напоминают «шпинделя cell» фенотипа, наблюдается в KS поражения (рис. 1B). Преобразованные фенотип также индуцированной после инфекции с KSHV, которая проявляется в части по потере контакта ингибирование когда клетки культивировали после слияния (рис. 1 c) и Анкоридж независимые роста в мягкой агар (рис. 2). Потеря контакта ингибирования и зависимость от внеклеточных матрица взаимодействия (Анкоридж) во время онкогенеза являются двумя отличительными чертами сотовой преобразование36. Важно отметить, что основной ЕС также чувствительны к инфекции с KSHV и первичной системы ЕС были чрезвычайно ценными для выяснения различных аспектов взаимодействия вируса хозяин, и его последствий. Такие исследования являются хорошо представлены в литературе, и здесь приводится несколько примеров37,,3839,40,,4142,43 ,-44.

Immunofluorescent окрашивание демонстрирует, что шпинделе морфология KSHV-инфицированных клеток связано с выражением вирусного белка Лана-1/ORF73 (Рисунок 3А и 3Б, красный). Как концентрацию вируса в акции будет варьироваться между препараты, объем вирусов, добавленных в хорошо должны корректироваться таким образом, чтобы достичь KSHV-инфицированных культур > инфекции 90% в течение одного или двух проходов. С последовательный проход процент инфекции будет приближаться к отметке 100% и будет поддерживаться в течение всего культуры (примерно 20 проходов). Нижнюю вируса может использоваться, если исследование влияния паракринными предназначен или прилегающих неинфицированных клеток желательно как элементы управления (например, иммунофлюоресценции исследований с участием других протеинов интереса). Зараженных культур также поддерживает выражение литические вирусных белков, но, как наблюдается в KS поражений, только небольшая часть клеток в культуре спонтанно будут проходить литические реактивации (рис. 3Б, зеленый). Клетки, инфицированные KSHV-BAC16, который является меткой с GFP, также развиваются шпинделе морфология (рис. 3 c и 3D). Когда используется KSHV-BAC16, вирусный титры можно получить путем заражения клеток с запасом серийно разводили концентрированной вирус и оценки клетки для экспрессия гена GFP в 48 h пост инфекции с помощью потока цитометрии30.

Для рекомбинантных и WT вирусов вирусных геномов в складе препаратов также может быть измерена очищая ДНК от инфицированных клеток, следуют количественной ПЦР ДНК KSHV уровней; Однако не следует предполагать, что все геномов являются инфекционные45. Если исследование KSHV литические цикла предназначен, реактивации вируса может быть достигнуто путем стимулирования EC с вызывая агентов, как описано выше для клеток BCBL-1, хотя эффективность повторной активации ниже23. Литических цикла также может быть вызвана трансдукции EC с KSHV transactivator белка ORF5046. В соответствии с выводами в другие клетки культуры модели СК, спонтанное выражение и химической индукции KSHV литические генов E6/E7-выражая EC уменьшается с течением времени несмотря на поддержание стабильной латентной инфекции11,16 .

Figure 1
Рисунок 1: морфология макет - и KSHV инфицированных ЕС (A) макет инфицированных EC монослои экспонат Классические мощеные каменные появление фазово-контрастной микроскопии жизненно. Без действия KSHV генов эти клетки не преобразуются и поэтому перестанет деления и выставку контакт ингибирование дойдя до впадения в культуре. (B) KSHV-инфицированных клеток, напротив, развивать вытянутых «шпинделя ячейки» морфология напоминает KS шпинделя клеток. Эта панель показывает морфология KSHV-инфицированных клеток на 5 день Пи по достижении слияния. (C) в KSHV-инфицированных клеток, обширные изменения в экспрессии генов клеток принимающих привести к сотовой трансформации, который становится очевидным, когда KSHV-инфицированные клетки культивировали без прохода. В таких условиях KSHV-инфицированные клетки продолжают пролиферирующих даже после достижения слияния, ведущих к развитию многоуровневой очагов клеток. Эта панель показывает морфология KSHV-инфицированных клеток на 14 день PI, культивированный за 9 дней после слияния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Анкоридж независимого роста. Подвергнутый клетки обычно проходят смерть клетки apoptotic после потери контакта с подложки, этот процесс называется anoikis. (A) когда Е6 и Е7 преобразованы макет инфицированных ЕС, которые не были преобразованы, приостановлено в мягкой агар и культивировали на две недели, они не образуют колоний. (B) KSHV-инфицированных ЕС, который превратил вирус, устойчивы к anoikis и сформирует в мягкой агаре колонии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: демонстрация экспрессии вирусных белков. (A) шпинделе морфология является очевидным после инфекции с KSHV (40 кратном). (B) Immunofluorescent окрашивание же поля в (A) демонстрирует что шпинделе морфология связан с выражением вирусный задержка белка ORF73 (красный). Инфицированные клетки поддерживают литические вирусной репликации, так как показал небольшой процент клеток, выражая вирусный proфактор cessivity ORF59 (зеленый). (A и B изменение ссылки26.) Шпинделе морфология клеток, инфицированных вирусом KSHV-BAC16 (C) связано с выражением GFP (D) (20 X увеличение). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Онкогенеза это многоэтапный процесс, который обходит важные гарантии внутри организма36. Как KS поражений существуют вдоль спектра хронического воспаления в истинной саркомы, разъяснение некоторых патофизиологических процессов при посредничестве KSHV требует провести некоторые исследования в моделях культуры клеток, которые поддерживают преобразование9. Следует отметить, что потеря контакта ингибирования и Анкоридж-зависит от роста, фенотипы ориентировочного Сотовый трансформации, легко не развиваются после инфекции первичной EC или ЕС, увековечено экзогенных выражением теломеразы. Таким образом в то время как в vitro модель KS, описанные здесь не резюмировать все аспекты микроокружения опухоли KS или поведение описаны KS клеток, это однозначно подходит для изучения изменения в экспрессии генов принимающей ячейки, вызванных инфекцией с KSHV, которые способствуют KS tumorigenesis.

Первый сообщили, что выражение гена профилируя исследования с использованием системы культуры, описанной здесь определены рецепторов тирозин киназы c комплект как вкладчик к преобразованные фенотип KSHV-инфицированных клеток25. Сбить c комплект выражения с использованием малых интерферирующих РНК или ингибирование c комплект сигнализации с помощью доминирующей негативных конструкция или тирозин ингибитора киназы STI 571 (Imatinib) вмешивается преобразовывая способность KSHV манифеста потери очагов формирования после продолжительного Культура инфицированных клеток. Последующие клиническая оценка Imatinib продемонстрировал эффективность этого препарата у больных с эпидемии KS47,,48-49. Также были выявлены другие потенциальные цели лечения, включая гема циклооксигеназы-126,50, CXCR727и бета адренергических рецепторов28, все из которых играют роль роста или преобразования EC в пробирке. Подтверждение этих картин выражения гена в первичной ЕС а также KS биопсия тканей подтверждает физиологическая значимость этой системы и подчеркивает ее значение как доклинические модель для KS терапии25,26, 51,52,53,54,55.

Еще одной сильной системы трансдукции Е6 и Е7 является расширенный срок службы увековечен по сравнению с первичной EC включает долгосрочные поддержания возраста и соответствием проход управления макет инфицированных клеток для сравнительной оценки итогов KSHV инфекции. Важно отметить, что для того, чтобы максимально увеличить количество проходов EC преобразованы с E6 и E7, важно, чтобы разделить культур до достижения слияния (~ 85-90%). Кроме того эти клетки переносят сыворотки свободных условий для длительных периодов времени. Основная ЕС быстро пройти запрограммированная смерть клетки после вывода фактор роста и поэтому не может быть культивировали для длительных периодов без сыворотки или рекомбинантных факторов роста56,57. Эта зависимость делает Аутокринный сигнальные пути, вызванных инфекцией с KSHV трудно выявить и изучить, как до полной трансформации KSHV-инфицированные клетки также будут проходить запрограммированная смерть клетки после вывода фактор роста (неопубликованные наблюдение). Наличие E6 и E7 белков в этой модели, однако, предотвратить запрограммированная смерть клетки после вывода фактор роста и позволяют для длительных (например, 48 ч) культуры в низкой сыворотки или сыворотка бесплатно средний25,26 , 28.

KS – сложные и необычные заболевание с особенностями хроническое воспаление и клеточных преобразования. Клинической необходимости роман терапевтических стратегий велик, и модель культуры клеток, описываемые обладает уникальными свойствами, которые позволяют оценку кандидата лекарственных препаратов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана на HD068322 K12 (SCM); R01 CA179921 и P51 OD011092 (АВМ); и награда 14PRE20320014 из Америки ассоциации сердца (SB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi's sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi's sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi's sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266 (5192), New York, N.Y. 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi's sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi's sarcoma? Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi's sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi's sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi's Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi's sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi's sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3'-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder,, Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

Биологии рака выпуск 126 саркома Капоши выпот в первичной лимфомы KSHV трансформации онкогенеза эндотелиальных клеток
<em>В Vitro </em>модель для изучения клеточных трансформации, саркома Капоши герпеса
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McAllister, S. C., Hanson, R. S.,… More

McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter