Abstract
وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة عن أكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة يحتمل. وقد عرض الأغشية الحيوية والتسامح عالية بشكل استثنائي للعلاج الكيميائي، والتي يعتقد أن تكون سياقاتها. على سبيل المثال، توفر مصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. على الأرجح، تنشأ بيوفيلم مرونة من مزيج من هذه وغيرها من الآليات، غير معروف حتى الآن. وقد وضعت كل من المضادات الحيوية الموجودة حاليا ضد خلايا واحدة (العوالق) البكتيريا. لذلك، حتى الآن، ذخيرة محدود جدا من جزيئات موجودة التي يمكن أن تعمل بشكل انتقائي على الأغشية الحيوية ناضجة. وقد أدى هذا الوضع تحولا تدريجيا في اكتشاف المخدرات، الذي تم حث البحث عن معاداة الأغشية الحيوية لتحتل مكانا أكثر بروزا. تحديا إضافيا هو أن هناكعدد من أساليب موحدة للبحوث بيوفيلم، وخاصة تلك التي يمكن أن تستخدم لفحص-إنتاجية كبيرة من المكتبات الكيميائية محدودة للغاية. هنا، يتم تقديم منصة لمكافحة بيوفيلم تجريبية لفحص الكيميائي. تلطيخ ويستخدم ثلاثة فحوصات لقياس قابلية بيوفيلم (مع تلطيخ ريسازورين)، إجمالي الكتلة الحيوية (مع تلطيخ الكريستال البنفسجي)، ومصفوفة بيوفيلم (باستخدام راصة جنين القمح، استنادا WGA مضان للبولي N -acetyl الجلوكوزامين، PNAG ، جزء). وقد وضعت جميع المقايسات باستخدام المكورات العنقودية الذهبية حيث تكون البكتيريا نموذج. وقدم أمثلة لكيفية منصة يمكن استخدامها لغربلة أولية فضلا عن التوصيف الوظيفي ليضرب المضادة للبيوفيلم التي تم تحديدها. يسمح هذا التسلسل التجريبي كذلك إلى تصنيف يضرب استنادا إلى نهاية نقاط قياس. كما يوفر معلومات عن طريقة عملها، وخصوصا على المدى الطويل مقابل آثار العلاج الكيميائي على المدى القصير. وبالتالي، فمن أدفا جداntageous لسرعة تحديد المركبات ضرب عالية الجودة التي يمكن أن تكون نقطة لانطلاق لمختلف التطبيقات الطبية الحيوية.
Introduction
يمكن للبكتيريا التبديل بين اثنين من أنماط الحياة المختلفة جدا، العوالق واطئة، منها بيوفيلم هو المثال الأكثر شيوعا. في الأغشية الحيوية، والبكتيريا تشكل المجتمعات تنظيما جزءا لا يتجزأ من الذات المنتجة مصفوفة 1. هذه المصفوفة الذات المنتجة هي الحاجز بين البكتيريا والبيئة الخارجية، وأنه يحمي الخلايا الميكروبية، وحفظ لهم على مقربة. تكوين مصفوفة بيوفيلم يختلف بين وحتى داخل الأنواع، ولكنها تتكون في معظمها من شبكة محكمة من عديدات سكر شحمية، والحمض النووي خارج الخلية، والبروتينات. تخدم مصفوفة بمثابة حاجز مادي يحول دون دخول عوامل ضارة، ولكنه يحمي أيضا بيوفيلم من الجفاف وتمنع المواد المغذية من الهرب الخلية 2.
وتعتبر الأغشية الحيوية باعتبارها واحدة من أكثر الموضوعات الصعبة المتمثلة في الطب الحيوي الحديث، وأنها هي المسؤولة يزعم لأكثر من 80٪ من حالات العدوى للمضادات الحيوية متسامحة 3. أنها يمكن التخلصوضع والتسامح عالية بطبيعتها ضد التهديدات الخارجية: الرطوبة والضغط الاسموزي، إجهاد 4، الحرارة، الأشعة فوق البنفسجية 5 والمطهرات والعوامل المضادة للجراثيم، والمضيف نظام المناعة 1. على سبيل المثال، فقد تبين أن تركيز عامل مضاد للميكروبات المطلوبة اللازمة لقتل بيوفيلم إلى أن تكون أعلى ما يصل إلى 1،000 مرات في مقارنة إلى ما هو مطلوب لقتل البكتيريا العوالق. يبدو أن تفسير لهذا التسامح العالي ليكون سياقاتها. وتقدم المصفوفة حاجز مادي أن يقلل من تغلغل المضادات الحيوية في بيوفيلم. أيضا، وخلايا داخل الأغشية الحيوية متنوعة ظاهريا. انتقالهم بين الدول الأيض المختلفة بسبب الانحدار الحالية من الأكسجين والمغذيات، والأيض بين الأجزاء الداخلية والخارجية للبيوفيلم 6. وبالتالي، في بعض المناطق بيوفيلم، مثل القلب، ويحرمون البكتيريا من الأوكسجين والمواد المغذية والعيش في أقل نشاطا أيضي أو حالة سبات تماما
من منهجيهمنظور كال، تحديات إضافية موجودة، كما لم توضع إلا لعدد محدود من وسائل بيوفيلم من قبل منظمات وضع المعايير، وخاصة تلك التي تنطبق على فحص عالية الإنتاجية من المكتبات الكيميائية. وتستند جميع المقايسات الموحدة (مع استثناء واحد فقط) على المفاعلات بيوفيلم، وهذه الأساليب تتطلب كميات عاملة كبيرة وكميات كبيرة من المركبات لفحصها، والتي عادة ما تكون غير متوفرة أثناء مرحلة الفحص المبكر 9-12. وموحد فحص الفرز ينطبق إلا الحالية هو ما يسمى جهاز كالجاري بيوفيلم، والتي وضعت المتوفرة تجاريا الحد الأدنى بيوفيلم القضاء على تركيز (MBEC) نظام 13-15. ومع ذلك، فإن الحد من هذا الاختبار هو أن الأغشية الحيوية تزرع على أوتاد، وليس كل الأنواع البكتيرية أو حتى سلالات داخل نفس النوع قادرون على تشكيل الأغشية الحيوية على هذا الجهاز. وعلاوة على ذلك، الأساليب التي يمكن تطبيقها بشكل خاص لاستكشاف المركبات الطبيعيةبحاجة. وكانت منتجات الطبيعية مصدرا رئيسيا للابتكار في اكتشاف الأدوية المضادة للميكروبات خلال القرن الماضي 16. أنها يمكن أن توفر مركبات جديدة لمكافحة بيوفيلم مع آليات فريدة من الإجراءات التي يمكن أيضا أن تكون فعالة ضد خلايا persister. وهكذا، واستكشاف المكتبات الطبيعية ومستوحاة بشكل طبيعي لديها فرص كبيرة لإنتاج الخيوط واعدة وفريدة من نوعها لمكافحة بيوفيلم.
هنا، نقدم تفاصيل التجريبية من منصة المقايسات التي تم تطويرها لفحص المواد الكيميائية من المركبات المضادة للبيوفيلم باستخدام ثلاثة فحوصات لقياس الآثار المترتبة على قدرتها على البقاء، إجمالي الكتلة الحيوية، ومصفوفة الأغشية الحيوية المكورات العنقودية الذهبية. الفحص الأول يقيس قابلية بيوفيلم، ويستند على تلطيخ ريسازورين. ريسازورين هو وصمة عار الأكسدة التي هي الأزرق وغير الفلورسنت في حالته تتأكسد وتتحول إلى اللون الوردي، resorufin الفلورسنت للغاية عندما خفضت من النشاط الأيضي للبكتيريا. وهو م بسيط جدا وسريعethod مناسبة للعروض الأولية 17-20. الفحص الثاني، على أساس الكريستال البنفسجي تلطيخ، ويقيس مجموع كتلة بيوفيلم. الكريستال البنفسجي هو وصمة عار استخداما لدراسة البكتيريا والبكتيريا في الأغشية الحيوية 19،21-23. ويستند هذا الفحص على الكواشف غير مكلفة ولها بسيطة القراءة الامتصاصية نقطة النهاية. وأخيرا، وفحص ثالث يستهدف مادة البوليمر (EPS) -matrix خارج الخلية من بيوفيلم عبر راصة جنين القمح (WGA)، الذي يربط خصيصا لبولي N مخلفات -acetyl الجلوكوزامين (PNAG) الموجودة في مصفوفة من الأغشية الحيوية العنقوديات 24. ويضاف إلى WGA مع fluorophore التي يمكن الكشف عنها باستخدام القراء كثافة مضان 25. نقدم هنا المنطق وتفاصيل منصة وضعنا، بما في ذلك أمثلة من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تزايد البكتيريا
- قبل ثقافة البكتيريا بين عشية وضحاها في مرق الصويا زيتية (TSB) عند 37 درجة مئوية مع 220 دورة في الدقيقة تهتز (16-18 ساعة).
- تمييع ما قبل الثقافة 100-1،000 مرات (اعتمادا على معدل نمو البكتيريا، وهنا، يتم استخدام 1000 مرات للبكتريا المكورة العنقودية البرتقالية) في TSB الطازجة وتركها تنمو عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة للوصول إلى النمو المتسارع (البصرية كثافة في 595 نانومتر (OD 595) بين 0.2 و 0.6).
ملاحظة: هذه الخطوة تتطلب تحسين سلالة معينة.
2. تشكيل بيوفيلم: قبل وبعد التعرض
- تمييع نمت باطراد الثقافة 100 مرة (وهذا يساوي تقريبا 10 6 وحدات تشكيل مستعمرة في الملليمتر الواحد (كفو / مل)).
- بروتوكول قبل التعرض
- للحصول على عينات ضابطة، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر من معقمة لوحة 96-microwell.
- إضافة 4 ميكرولتر من مركب اختبار أو عنصر تحكمالمضادات الحيوية (حل 50X الأسهم) و 196 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر.
- احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم.
- بروتوكول بعد التعرض
- لجميع العينات، إضافة 200 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية المخفف لكل بئر من معقمة لوحة 96-microwell.
- احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة.
ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم. - إزالة حل العوالق بأكمله بعناية، دون لمس بيوفيلم، وذلك باستخدام ماصة الأقنية.
- إضافة 4 ميكرولتر من مركب اختبار أو مضاد حيوي التحكم (50X حل سهم) و 196 ميكرولتر مكتب تقييس الاتصالات لكل بئر.
- احتضان ذلك عند 37 درجة مئوية على شاكر لوحة في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة إضافية.
ملاحظة: هنا نستخدم شاكر مع مدار 2 مم.
3. ريسازورين تلطيخ Protocoل لتقييم قابلية الأغشية الحيوية
- يعد حل الأسهم من 0.1 ملغ / مل ريسازورين (0.4 ملم) في برنامج تلفزيوني العقيمة. الحفاظ على هذا المخزون العقيمة، وحمايتها من التعرض للضوء، وعند 4 درجات مئوية.
- تمييع الأسهم ريسازورين 01:50 في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لتحقيق تركيز النهائي من 20 ميكرومتر.
- نقل الحل العوالق كامل (ترك الأغشية الحيوية في الآبار) بعناية، دون لمس الأغشية الحيوية أو خلق فقاعات الهواء، لوحة منفصلة، نظيفة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية.
- غسل الأغشية الحيوية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وذلك بإضافة 200 ميكرولتر لكل بئر، وإزالته بعناية باستخدام ماصة الأقنية.
- إضافة 200 ميكرولتر من ريسازورين المخفف لكل بئر من لوحة بيوفيلم باستخدام ماصة الأقنية.
- احتضان في الظلام، في درجة حرارة الغرفة (RT)، و 200 دورة في الدقيقة، والهز لحوالي 20 دقيقة حتى الضوابط بيوفيلم غير المعالجة هي بالتساوي الوردي.
- قياس مضان فيλ مريض بالحب = 560 نانومتر، وλ م = 590 نانومتر مع قارئ لوحة (رأس القراءة).
4. كريستال البنفسج بروتوكول تلطيخ عن الكتلة الحيوية الكمي من الأغشية الحيوية باستخدام نفس اللوحة كما في الخطوة 3
- إزالة وصمة عار ريسازورين بعناية من الآبار باستخدام ماصة الأقنية.
- إصلاح الأغشية الحيوية مع 200 ميكرولتر من الميثانول لمدة 15 دقيقة.
- السماح لوحة الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
- إضافة 190 ميكرولتر من 0.02٪ (المجلد / المجلد، مخففة في منزوع الأيونات الماء) حل الكريستال البنفسجي، بعناية باستخدام ماصة الأقنية. تجنب لمس الجانبين من الآبار مع وصمة عار في حين pipetting لومنع تشكيل فقاعات الهواء من خلال عدم الضغط على ماصة لاستكمال ضربة المغادرة.
- احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
- إزالة وصمة عار بعناية، وذلك باستخدام ماصة الأقنية.
- يغسل مرتين مع الماء منزوع الأيونات (200 ميكرولتر في كل مرة).
- السماح الآبار تجف لمدة 5 دقائق على RT وحل وصمة عار المتبقيةفي 96٪ من الإيثانول أو حامض الخليك 33٪.
- احتضان لمدة 1 ساعة على RT وقراءة الامتصاصية في 595 نانومتر.
5. تقييم تأثير مبيد للجراثيم على البكتيريا العوالق باستخدام لوحة عينة نفسها بالنسبة للالأغشية الحيوية
- قياس العكارة في 595 نيوتن متر من لوحة مع الحل العوالق من 3.3.
- وصمة عار على البكتيريا العوالق مع ريسازورين بإضافة 10 ميكرولتر من الأسهم ريسازورين لكل بئر. تخلط جيدا من قبل pipetting.
- احتضان في الظلام في RT لمدة 5 دقائق تقريبا، حتى علاج الضوابط هي بالتساوي الوردي.
- قياس مضان في λ مريض بالحب = 560 نانومتر، وλ م = 590 نانومتر.
6. جرثومة القمح الملزن تلطيخ لمصفوفة الكمي ومضان المجهر التصوير من الأغشية الحيوية
- مصفوفة الكمي
- إعداد محلول / مل 5 ميكروغرام من التحقيق WGA في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- استخدام عينة جيش التحرير الشعبي الصيني الموازيالشركة المصرية للاتصالات لهذا تلطيخ. إزالة حل العوالق من الآبار ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر)، بعناية باستخدام ماصة الأقنية دون لمس الأغشية الحيوية.
- إضافة 200 ميكرولتر من حل WGA لكل بئر لتكون ملطخة.
- احتضان في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إزالة وصمة عار غير منضم عن طريق غسل الآبار مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
- السماح لوحة جافة لمدة 15 دقيقة في RT.
- حل وصمة عار المربوطة في حامض الخليك 33٪، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر.
- اغلاق الآبار مع قبعات الشريط ويصوتن لهم باستخدام sonicator حمام الماء لمدة 30 ثانية في RT و 40 كيلو هرتز.
- احتضان لوحة لمدة 1 ساعة على RT.
- كرر الخطوة صوتنة. يمكن أن تبقى الآبار مختومة بين الخطوات صوتنة.
- قياس مضان في λ السابق = 495 نانومتر، وλ م = 520 نانومتر مع قارئ لوحة (رأس القراءة).
- تصور المصفوفة معالمجهر مضان
- استخدام نفس البروتوكول على النحو الوارد أعلاه حتى خطوة 6.1.6.
- بعد خطوة التجفيف، وتصور العينات باستخدام المجهر مضان، وذلك باستخدام فلتر FITC (أو مناسبة مرشح الإثارة الأخضر آخر).
7. تلطيخ خلايا قابلة للحياة والميت داخل الأغشية الحيوية للتصوير مع مضان المجهر والكمي لالإشارة لوالخضر إلى الأحمر نسبة (G / R)
- التصوير مع المجهر مضان
- يعد حل من كل مسبار (خلايا قابلة للحياة تلطيخ واحد وغيرها من الخلايا الميتة تلطيخ واحد)، وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
- إزالة حل العوالق من الآبار ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر) باستخدام ماصة الأقنية.
- إضافة 6 ميكرولتر من الحل تلطيخ لكل بئر.
- احتضان لوحة في الظلام لمدة 15 دقيقة.
- قبل المجهر، وإزالة فائض السائل مanually باستخدام ماصة الأقنية.
- التقاط الصور باستخدام المجهر مضان، وذلك باستخدام مثلا مرشح FITC (لمخضر، خلايا قابلة للحياة) أو مرشح TRITC (مضان أحمر والخلايا الميتة).
- الكمي للإشارة كنسبة الأخضر إلى الأحمر ومضان (G / R)
- اتبع نفس البروتوكول كما هو الحال في الخطوات 7.1.1 و7.1.2.
- إضافة 200 ميكرولتر من الحل تلطيخ لكل بئر واحتضان لهم لمدة 15 دقيقة في الظلام.
- قياس مضان مع قارئ لوحة في إثارة موجات / الانبعاثات 485/535 نانومتر و 485/635 لمضان الأخضر والأحمر على التوالي (القراءة العليا).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في المنبر المقترح، وكمية من آثار على الجدوى، والكتلة الحيوية، ومصفوفة بيوفيلم. في تسلسل العمل (الشكل 1)، اتسخت واحدة لوحة عينة مع ريسازورين وفي وقت لاحق مع البنفسجي وضوح الشمس في وقت واحد لتقييم الآثار المترتبة على بقاء التجمعات البكتيرية وعلى إجمالي الكتلة الحيوية بيوفيلم. كلا المقايسات لا يمكن أن يؤديها على التوالي في نفس اللوحة لأنه ثبت في وقت سابق ان تلطيخ الأول مع ريسازورين لم يكن له تأثير ذو دلالة إحصائية على نتيجة الكريستال البنفسجي تلطيخ (ع = 0.4149 للمقارنة بين وحدات إشارة الامتصاصية القصوى بين لوحات الكريستال البنفسجي ملطخة بشكل منفصل أو بعد ريسازورين تلطيخ، ن = 20) 26. تأثير على البكتيريا العوالق يمكن تقييمها في وقت واحد.
عندما يتم تحديد الزيارات من أي جدوى أو الفحص القائمة على الكتلة الحيوية، لوحة الثانية هي شارع ained مع لجنة التحقيق WGA لقياس تأثير هذه المركبات على عنصر السكاريد (PNAG) من مصفوفة بيوفيلم. هذا العمل يمكن تطبيقها على فحص المكتبات الكيميائية، فضلا عن دراسات المتابعة الفنية لقياس فعالية من المركبات ضرب، كما يتضح أدناه.
الشكل 1: سير العمل من منصة ثلاثة الفحص. التمثيل التخطيطي لسير العمل الجمع بين المقايسات ثلاثة على عينات بيوفيلم. تتضمن منصة تلطيخ للتأثير على قدرتها على البقاء، والكتلة الحيوية، وطبقة EPS. التصوير باستخدام المجهر مضان. وتقييم تأثير على مرحلة العوالق. "A" و "NA" الوقوف ل "نشط" و "غير نشط"، على التوالي. تعديل من Skogman وآخرون. 26JPG "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أداء منهاج ثلاثة الفحص لأغراض الفحص
هنا، يتم عرض اثنان أشواط فحص كنتائج تمثيلية من أداء المنصة. في الحملة الأولى (الشكل 2A)، تم عرض مكتبة صغيرة للمشتقات قلويد الكينا للنشاط مضاد للبيوفيلم ضد المكورات الأغشية الحيوية 27، بينما في المثال الثاني (الشكل 2B)، مكتبة الطبيعية ومستوحاة بشكل طبيعي من abietane من نوع وجرى استكشاف diterpenoids ومشتقاتها 28،29. تم تحديد الزيارات النشطة باستخدام حدود ضرب محسوبة (العتبات؛ معادلة 6، الجدول 1). في كل دراسة الفحص، نتائج فحوصات الأولين المترابطة بشكل جيد للغاية. كانت الضربات كل قادرة على الحد من قابلية والكتلة الحيوية بيوفيلم، ثhile أظهرت مركبات خاملة أي تأثير على أي فحص. ثم تم اختبار جميع الزيارات التي تم تحديدها على (WGA) فحص الثالث، ولكن لم يكن لديهم آثار مصفوفة التفكيك (أو مصفوفة مهينة) (النتائج غير معروضة).
الشكل 2: ممثل نتائج حملات الفحص باستخدام منصة مع الأغشية الحيوية العنقودية الذهبية. مثالين من شاشات التحقق من صحة إثبات صحة مفهوم أداء باستخدام منصة الفحص. يتم عرض نتائج كنسبة مئوية من السيطرة بيوفيلم غير المعالجة، وأشار المركبات ضرب باللون الأحمر، وخطوط تمثل حدود ضرب محسوبة. (أ) حدد فحص مكتبة مشتقة-الكينا قلويد مجمع واحد نشط. (ب) فحص مكتبة diterpenoids abietane من نوع ومشتقاتها حددت خمسة الفعلمركبات إيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
أداء منهاج ثلاثة فحص للدراسات المتابعة
ويمكن ملاحظة نتائج ممثلة في الشكل 3، حيث تم اختبار اثنين من المضادات الحيوية المعروفة على نطاق واسع جدا من تركيزات (0.5 نانومتر 5 ملم) ضد الأغشية الحيوية العنقودية الذهبية. الحد الأدنى للقيم تركيز مثبط (MIC) من المركبات إشارة ضد البكتيريا العوالق (إما من الأدب أو أجريت في المختبر) بمثابة مبادئ توجيهية لاختيار تركيز لاختبار ضد الأغشية الحيوية من نفس النوع. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمعرفة القيم التركيز الذي لم يتم الكشف عن السمية الخلوية في خلايا الثدييات أيضا أن يساعد في اختيار تركيز لاختبار لمكافحة بيوفيلم المتابعة. من الناحية المثالية،إذا كانت كل من البيانات المضادة للميكروبات والسمية الخلوية لمركب معين المتاحة، معلمة المعروفة باسم "مؤشر توافق مع الحياة" (BI) ويمكن حساب، على النحو المحدد من قبل مولر وكريمر 30. هنا، تم تحديد القيم هيئة التصنيع العسكري ضد العوالق العنقودية الذهبية للبنسلين وسيبروفلوكساسين لتكون 0.04 ميكرومتر و 6 ميكرومتر، على التوالي (النتائج غير معروضة). وبالتالي، تراوحت فترة الاعتقال من ما يقرب من 10 5 × MIC إلى 10 -2 س MIC و 10 3 × MIC إلى 10 -4 العاشر هيئة التصنيع العسكري لالبنسلين وسيبروفلوكساسين، على التوالي. كل من المضادات الحيوية يمكن أن تقلل بشكل كبير من المحتوى PNAG الجدوى، والكتلة الحيوية، وبيوفيلم مصفوفة عندما تعرضوا لبكتيريا وحيدة الخلية قبل الشروع في عملية تشكيل بيوفيلم (الشكل 3A). ومع ذلك، على الرغم من تركيز عال جدا من المضادات الحيوية اختبارها على متشكلة (18 ساعة) الأغشية الحيوية، تم تخفيض سلامة والكتلة الحيوية فقط إلى ما يقرب من 50٪ من رخرطوم من الأغشية الحيوية غير المعالجة (الشكل 3B). وكانت النتيجة الأبرز هنا الزيادة في مصفوفة بيوفيلم (إلى أكثر من 200٪) عندما تم علاج الأغشية الحيوية متشكلة مع تركيزات عالية من البنسلين G. تم الكشف عن أية تغييرات في محتوى المصفوفة بيوفيلم عندما تم علاج الأغشية الحيوية متشكلة مع سيبروفلوكساسين.
الرقم 3: مثال لدراسة متابعة تأثيرات مضادة للبيوفيلم باستخدام اثنين من المضادات الحيوية نموذج ضد الأغشية الحيوية العنقودية الذهبية. وتعرض آثار البنسلين G وسيبروفلوكساسين هنا: (أ) قبل تشكيل بيوفيلم (قبل التعرض) و (ب) تشكيل بعد بيوفيلم (بعد التعرض). لشخصية الوضوح، إلا وتظهر أدنى وأعلى تركيزات التي تم اختبارها. لا تتجاوز الانحرافات المعيارية 20٪. *** EQUAليرة سورية ف <0.01. تعديل من Skogman وآخرون. 26 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التصوير أساس المجهر مضان
ونتيجة لذلك بنسلين في 400 ميكرومتر (وكذلك تركيزات أعلى، كما هو مبين في الشكل 3B) يقتل وأكد نحو 50٪ من المكورات بيوفيلم السكان البكتيرية متشكلة مع فحص جدوى تلطيخ آخر. وكان متوسط (G / R) نسب مضان الخضراء إلى اللون الأحمر لآبار بيوفيلم غير المعالجة 2.75، مما يشير إلى غلبة الخلايا الحية (الخضراء الملون)، أكثر من الخلايا الميتة (الحمراء الملطخة). ومع ذلك، في الخلايا المعالجة البنسلين انخفضت G / نسبة R إلى 1.54، الموافق 56٪ من آبار المراقبة. الخلايا المتبقية على قيد الحياة بعد العلاج البنسلين المواليةيولدها كمية أعلى بكثير من العائد على السهم، والحكم عليها من زيادة في الكشف عن الأخضر (WGA) مضان بالمقارنة مع الأغشية الحيوية غير المعالجة (الشكل 4B). نوصي كلما كان ذلك ممكنا، لتنفيذ هذه التجارب القائمة على التصوير لمزيد من تأكيد نتائج منصة، وخصوصا خلال مرحلة توصيف المرشحين ضرب.
الشكل 4: مضان المجهر. وأظهرت تأثير إضافة البنسلين (400 ميكرومتر) على الإنتاج جدوى وربحية السهم هنا. أعلى الصور (A) تتوافق مع الأغشية الحيوية غير المعالجة والأغشية الحيوية المعالجة البنسلين، حيث خلايا قابلة للحياة هي ملطخة الخلايا الخضراء والميتة ملطخة الأحمر. ويوضح الرسم البياني إدراج حسابات نسب مضان G / R. الصور السفلية (B) تتوافق مع الأغشية الحيوية غير المعالجة والبنسلينالخلايا المعالجة بالإثير ملطخة التحقيق WGA. يعرض الرسم البياني إدراج الكمي لإشارات وغ لعينات بيوفيلم المعالجة وغير المعالجة، وأشرطة الخطأ تمثل الانحرافات المعيارية. تعديل من Skogman وآخرون. 26 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
معالجة البيانات والتحليل الإحصائي
وتحسب المعلمات الإحصائية لوصف نوعية فحوصات ومتابعة أدائها خلال أشواط الفرز. معادلات أهم المعايير المستخدمة، فضلا عن القيم التي تم الحصول عليها والهدف، يتم سرد في الجدول 1. في كل المعادلات، SD دقيقة، دقيقة ميكرون، SD كحد أقصى، وميكرون ماكس تمثل الانحرافات والوسائل القياسية من الحد الأدنى(دقيقة) وإشارات القصوى (كحد أقصى)، على التوالي. في النتائج المعروضة هنا، وإرفاقها أجريت مقارنات بين القيم الأصلية مع أونبايريد اختبار t مع تصحيح ولش، حيث اعتبرت ف <0.05 لتكون ذات دلالة إحصائية.
الجدول 1: معلمات الإحصائية المستخدمة لتقييم أداء المقايسات. في كل المعادلات، SD دقيقة، دقيقة ميكرون، SD كحد أقصى، وميكرون ماكس تمثل الانحرافات المعيارية وسيلة من الحد الأدنى (دقيقة) وإشارات القصوى (كحد أقصى)، على التوالي. وRES طرق التلوين، ريسازورين والبنفسجي وضوح الشمس، والقمح الجرثومية راصة، ومختصرة، CRV، وWGA، على التوالي. RFU: وحدات مضان النسبية. راو: وحدات امتصاص النسبية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ليس هناك طريقة واحدة يمكن أن تقيس وقت واحد تأثير مركب على الجدوى، والكتلة الحيوية، ومصفوفة بيوفيلم. لذلك، هناك حاجة للجمع بين فحوصات من أجل الكشف عن تأثير على النهاية ثلاثة، ويفضل أن يكون في مرحلة الفرز الأولية.
ريسازورين هو بروتوكول تلطيخ بسيط جدا تتألف فقط من إضافة التحقيق الأكسدة. ومع ذلك، ووضع فترة حضانة الأمثل للالأغشية الحيوية مع ريسازورين أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الاختبار. في بعض السلالات البكتيرية، والحد من التحقيق ريسازورين إلى الوردي، resorufin الفلورسنت يحدث بسرعة كبيرة، بينما في حالات أخرى يمكن أن تستمر عدة ساعات 19. وعلاوة على ذلك، في نفس سلالة بكتيرية، قد يكون هناك أيضا اختلافات كبيرة بين البكتيريا العوالق والأغشية الحيوية. وصلت البكتيريا العوالق عادة بسهولة أكثر، وذلك بسبب كثافة البكتيرية أقل في أعداد العوالق من في بو بيوفيلمpulations، وهو ما يعزز دوران أسرع من رد الفعل. في مقارنة نشرت تحقيقات تلطيخ قابلية بيوفيلم، واختتم ريسازورين ليكون واحدا من الأكثر دقة، وسهلة الاستخدام، وأقل تكلفة المقايسات 19. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن تكون قابلة للتطبيق على مجموعة من الكائنات البكتيرية والفطرية 19. من ناحية أخرى، وفحص الكريستال البنفسجي هو الأكثر استخداما لتقدير بيوفيلم كتلة 19،32،33. الخطوات الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هي إضافة وإزالة الحل الكريستال البنفسجي وصمة عار. يجب أن تجرى بعناية فائقة لتجنب تلطيخ غير محددة (على سبيل المثال، بسبب قطرات من وصمة عار على جدران الآبار) هذه الخطوات. واحدة من الفوائد الرئيسية لاستخدام ريسازورين كما الفحص تلطيخ الأولي هو حقيقة أنها غير سامة للخلايا، والتي تمكن من استخدام نفس لوحة لتلطيخ الكريستال البنفسجي. الجمع بين كل من المقايسات يبسط إلى حد كبير سير العمل، ويخفض التكاليف، ويوفر المستهلكونABLES، ويقلل من استخدام المركبات الاختبار، الذي هو قيمة خاصة في بيئة الفرز.
وكما ذكر سابقا، المصفوفة خارج الخلية السكاريد الذات المنتجة هي مكون أساسي من مكونات الأغشية الحيوية. لقياس محتوى المصفوفة (وخاصة السكريات الأساسية)، وفحص الثالث على هنا، على أساس WGA مضان المسمى. في الأصل كان وصف الكمي WGA باعتبارها كتين-بالأنزيم انزيم مرتبط (إيلا) 24. كما تم يستخدم فحص مماثل على أساس الجليكوسامينوجليكان تلطيخ (الكمامات) في المصفوفة من الأغشية الحيوية بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية مع الأزرق dimethylmethylene (DMMB) 31،34. الكمامات تشبه adhesins بين الخلايا السكاريد (تقييمات التنفيذ الأولية) وجدت في مصفوفة المكورات النيابة. الأغشية الحيوية 35. وWGA-فحص مماثل أهداف PIAs ولكن WGA أكثر تحديدا بربط بولي N--acetyl الجلوكوزامين المخلفات، والتي تلعب دورا أساسيا في مصفوفة بيوفيلم 36 < / سوب>. استهداف مصفوفة غير ذات أهمية عالية يرجع ذلك إلى حقيقة أن الأغشية الحيوية يمكن أن تنمو بسهولة إذا ما تركت المصفوفة بعد الكيميائية أو العلاج بالمضادات الحيوية. يمكن للبكتيريا أيضا نعلق بسهولة على سطح الذي مصفوفة قبل المغلفة 35. وقد تبين أن بعض المضادات الحيوية يمكن أن يقلل بشكل فعال سلامة وبيوفيلم الكتلة الحيوية، ولكن من دون أي تأثير على المصفوفة. في تجاربنا، وهذا ما يتضح من حالة سيبروفلوكساسين 31. يمكن لبعض المضادات الحيوية تزيد حتى إنتاج مصفوفة، كما هو موضح هنا مع البنسلين G 26. وبناء على هذه التغيرات، والمضادات الحيوية التي يمكن تصنيفها في الفئات المدرجة في الجدول 2. كل الضربات في دراسات فرز لدينا (الشكل 2) يمكن تصنيفها، جنبا إلى جنب مع سيبروفلوكساسين، والمركبات التي تقتل البكتيريا في بيوفيلم وخفض الكتلة الحيوية ولكن لا تفكيك أو تعطيل المصفوفة بيوفيلم.
| فئة | تأثير على البكتيريا | تأثير على مصفوفة | مثال مضاد حيوي (بيوفيلم الهدف) | مرجع |
| 1 | لا شيء | لا شيء | الأمبيسلين (SA) | (حمل وآخرون 2009) |
| 2 | لا شيء | - | cefalotin (SA) | (حمل وآخرون 2009) |
| 3 | - | لا شيء | بوليميكسين (SA) | (حمل وآخرون 2009) |
| 4 | - | - | كانامايسين (PA) | (حمل وآخرون 2009) |
| سيبروفلوكساسين (SA) | (Skogman وآخرون 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | الدوكسيسيكلين (PA) | (حمل وآخرون 2009) |
| 6 | - | + | البنسلين G (SA، EC) | (Skogman وآخرون 2012) |
الجدول 2: تصنيف المضادات الحيوية. وتنقسم المضادات الحيوية إلى فئات على أساس تأثيرها على بقاء البكتيريا بيوفيلم (باستخدام ريسازورين تلطيخ) ومصفوفة (باستخدام WGA أو dimethylmethylene الأزرق (DMMB) تلطيخ). SA: المكورات العنقودية الذهبية. السلطة الفلسطينية: الزائفة الزنجارية. المفوضية الأوروبية: الإشريكية القولونية. تعديل من حمل آخرون. 31
وعلاوة على ذلك، هذه المنصة مثالية لأداء حملات التحري الأولية. الاستراتيجية الأكثر من حيث التكلفة وفعالة في الوقت هو تطبيق ريسازورين وضوح الشمس فحوصات على أساس اللون البنفسجي كاستراتيجية من الصف الأول وللانتقال إلى فحص WGA مصفوفة في الدراسات من الدرجة الثانية (متابعة). ويرجع ذلك إلى حقيقة أن لجنة التحقيق WGA مكلفة نوعا ما، وأن هذا الاختبار يتكون من عدة خطوات، مما يجعله أكثر شاقة وتستغرق وقتا طويلا.
وهناك ميزة ذات الصلة من هذا النظام الأساسي هو إمكانية لتقييم الآثار الطويلة الأجل لمضادات الميكروبات التي تم تحديدها. ويمكن تحقيق آثار العلاج الكيميائي على المدى الطويل إلا إذا تم تفكيكها مصفوفة بيوفيلم. فقد تبين أن خطر إنعاش العدوى بيوفيلم هو أعلى من ذلك بكثير إذا ترك مصفوفة وراء. مع هذا النظام الأساسي، فمن الممكن لتقييم أولا إذا الكتلة الحيوية بيوفيلم الشاملة يتأثر تستخدم الكريستال البنفسجي تلطيخ. وأكثر دتقييم etailed من السكريات بيوفيلم المصفوفة، وذلك باستخدام فحص WGA، يمكنك متابعة. من المذكرة، واحتمال من تحديد جزيء واحد من شأنهما تفكيك مصفوفة وبذل مضاد للجراثيم (مبيد الأحياء) ويمكن اعتبار الآثار منخفضة. في الواقع، حتى الآن، المركبات الوحيدة من هذا النوع التي حددناها هي الببتيدات المضادة للميكروبات 37. ولمعالجة ذلك، تتم المتابعة في هذا المنبر مع أي يضرب فوق البنفسجية النشطة resazurin- أو الكريستال، منذ تسمح هذه الاستراتيجية تحديد المركبات مع مبيد الأحياء منفصل أو النشاط مصفوفة المهينة. ويمكن لهذه الخيوط يكون من المحتمل مثيرة للاهتمام لاستراتيجيات متعددة المكونات. ومن المتوقع أن يوفر أكثر كفاءة القضاء بيوفيلم مزيج من جزيئات المهينة المصفوفة مع مركبات مبيد الأحياء أو المضادات الحيوية من نوع.
وباختصار، فإن منصة المعروضة هنا يوفر أساسا جيدا لفحص مكافحة بيوفيلم باستخدام القياسات الحيوية وطاقة الكتلة الحيوية جنبا إلى جنب مع quantifi مصفوفةالموجبة والتصور. كل من ريسازورين والبنفسجي وضوح الشمس المقايسات تلطيخ يمكن أن تستخدم أيضا لأنواع أخرى من الكائنات الحية الدقيقة التي تشكل biofilm-. ومع ذلك، هذه المقايسات تتطلب التحسين منفصل لكل من النمو وتلطيخ الظروف. انطباق تلطيخ فحص WGA يقتصر على تلك البكتيريا فيها بولي N -acetyl الجلوكوزامين هو المكون الرئيسي للمصفوفة بيوفيلم. المقايسات مصفوفة الكمي أخرى (مثل واحد على أساس ثنائي ميثيل-الميثيلين الأزرق تلطيخ) يمكن تطبيقها في حالات أخرى. وإجمالا، المقايسات في هذا المنبر من السهل إلى حد ما على القيام بها، وكلها الكواشف متاحة بسهولة، وكذلك في متناول الجميع بشكل عام. هذه المنصة هي مناسبة لالمنخفضة لفحص المتوسطة الإنتاجية مكافحة بيوفيلم دون الحاجة إلى استثمارات معدات باهظة الثمن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
الكتاب أشكر الأستاذ بول كوس وLMPH، جامعة أنتويرب، بلجيكا لدعمه أثناء عملية التصوير في مختبره. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أكاديمية مشاريع فنلندا (مشاريع 272266 و282981) وسفنسكا TEKNISKA Vetenskapsakademien ط فنلندا. واعترف المساهمات الفنية للماجستير Janni Kujala.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
