Abstract
Biofilm er betragtes som en af de mest udfordrende emner af moderne biomedicin, og de er potentielt ansvarlige for over 80% af antibiotika-tolerante infektioner. Biofilm har vist en usædvanlig høj tolerance for kemoterapi, som menes at være multifaktoriel. For eksempel matricen tilvejebringer en fysisk barriere, der reducerer indtrængning af antibiotika ind i biofilmen. Også celler i biofilm er fænotypisk forskellige. Sandsynligt, opstår biofilm modstandskraft fra en kombination af disse og andre, endnu ukendte, mekanismer. Alle de nuværende antibiotika er blevet udviklet mod single-celler (planktoniske) bakterier. Derfor hidtil en meget begrænset repertoire af molekyler eksisterer som selektivt kan handle på modne biofilm. Denne situation har kørt en progressiv paradigmeskift inden for lægemiddelforskning, hvor søger efter anti-biofilm er blevet opfordret til at indtage en mere fremtrædende plads. En yderligere udfordring er, at der er enmeget begrænset antal standardiserede metoder til biofilm forskning, især dem, der kan anvendes til store-throughput screening af kemiske biblioteker. Her er en eksperimentel anti-biofilm platform for kemisk screening præsenteret. Det bruger tre assays til at måle levedygtighed biofilm (med resazurin farvning), total biomasse (med krystalviolet farvning), og biofilm matrix (under anvendelse af en hvedekimagglutinin, WGA-fluorescens-baserede farvning af poly- N-acetyl-glucosamin, PNAG , fraktion). Alle assays blev udviklet ved anvendelse Staphylococcus aureus som model bakterier. Eksempler på, hvordan platformen kan anvendes til primær screening samt til funktionel karakterisering af identificerede anti-biofilm hits præsenteres. Denne eksperimentelle sekvens tillader yderligere for klassificeringen af hits baseret på de målte endepunkter. Det giver også oplysninger om deres virkemåde, især på lang sigt versus kortsigtede kemoterapeutiske virkninger. Det er således meget advantageous for hurtig identifikation af høj kvalitet, hit-forbindelser, der kan tjene som udgangspunkt for forskellige biomedicinske anvendelser.
Introduction
Bakterier kan skifte mellem to meget forskellige livsstile, planktoniske og fastsiddende, hvoraf en biofilm er det mest almindelige eksempel. I biofilm, bakterier danner strukturerede samfund indlejret i en egenproduceret matrix 1. Denne selv-producerede matrix er en barriere mellem bakterier og deres omverden, og det beskytter de mikrobielle celler, holde dem i umiddelbar nærhed. Sammensætningen af biofilmen matrix varierer mellem og endda inden arter, men det meste består af et tæt netværk af lipopolysaccharider, ekstracellulært DNA og proteiner. Matricen fungerer som en fysisk barriere inhiberer indgangen af skadelige stoffer, men det beskytter også biofilmen fra dehydrering og forhindrer næringsstoffer i at undslippe cellen 2.
Biofilm er betragtes som en af de mest udfordrende emner af moderne biomedicin, og de er angiveligt ansvarlig for over 80% af antibiotika-tolerante infektioner 3. De displægge en iboende høj tolerance mod eksterne trusler: fugtighed, osmotisk tryk, mekanisk stress 4, varme, UV stråling 5, desinfektionsmidler, antimikrobielle stoffer, og værtens immunsystem 1. For eksempel har den krævede koncentration antimikrobielt middel, der kræves for at dræbe en biofilm vist sig at være op til 1000 gange højere i sammenligning med den, der kræves for at dræbe planktoniske bakterier. Forklaringen på dette højere tolerance synes at være multifaktoriel. Matricen indeholder en fysisk barriere, der reducerer indtrængning af antibiotika ind i biofilmen. Også celler i biofilm er fænotypisk forskellige; de overgangen mellem forskellige metaboliske tilstande på grund af en eksisterende gradient af oxygen, næringsstoffer og metabolitter mellem de indre og ydre dele af biofilmen 6. Derfor, i nogle biofilm regioner, såsom kernen, er bakterier berøvet oxygen og næringsstoffer og leve i et metabolisk mindre aktiv eller en helt sovende tilstand
Fra et methodological perspektiv, findes yderligere udfordringer, som kun et begrænset antal biofilm metoder er blevet udviklet af standardudstedende organisationer, navnlig dem, der gælder for high-throughput screening af kemiske biblioteker. Alle standardiserede assays (med kun én undtagelse) er baseret på biofilm reaktorer, og disse fremgangsmåder kræver store arbejds- mængder og store mængder af forbindelser, der skal testes, som normalt er utilgængelige i den tidlige testpræparat stadium 9-12. Det eneste eksisterende standardiserede screening-gældende assay er den såkaldte Calgary Biofilm Device, hvorfra kommercielt tilgængeligt system minimum biofilm eliminerer koncentration (MBEC) blev udviklet 13-15. begrænsning af dette assay er imidlertid, at de biofilm dyrkes på pinde, og ikke alle bakteriearter eller endda stammer af samme art er i stand til at danne biofilm på denne enhed. Endvidere metoder, der kan især anvendes til udforskning af naturlige forbindelser erhavde brug for. Naturlige produkter har været den største kilde til innovation i antimikrobielle lægemiddelforskning i det forløbne århundrede 16. De kan give nye anti-biofilm forbindelser med unikke virkningsmekanismer, der også kan være effektiv mod persister celler. Således udforskning af naturlige og naturligt inspirerede biblioteker har store chancer for at producere lovende og unikke anti-biofilm kundeemner.
Her præsenterer vi de eksperimentelle detaljer i en platform af analyser, der blev udviklet til den kemiske screening af anti-biofilm forbindelser ved hjælp af tre analyser til at måle effekten på levedygtigheden, total biomasse, og matrix af Staphylococcus aureus biofilm. Den første assay måler biofilm levedygtighed, og den er baseret på resazurin farvning. Resazurin er en redox plet, der er blå og ikke-fluorescerende i sin oxiderede tilstand og bliver til lyserød, stærkt fluorescerende resorufin når reduceret med den metaboliske aktivitet af bakterierne. Det er en meget enkel og hurtig metode egnet til primære screeninger 17-20. Det andet assay er baseret på krystalviolet farvning, måler total biofilm masse. Crystal violet er en udbredt plet til at studere bakterier og bakterier i biofilm 19,21-23. Bestemmelsen er baseret på billige reagenser og har en simpel absorbans endpoint læsning. Endelig er den tredje assay målretter det ekstracellulære polymere stof (EPS) -matrix af biofilmen via hvedekimagglutinin (WGA), som binder specifikt til poly- N-acetyl-glucosamin-rester (PNAG) til stede i matrixen af stafylokok biofilm 24. WGA er konjugeret med en fluorofor, som kan detekteres ved anvendelse af fluorescens intensitet læsere 25. Vi præsenterer her rationalet og detaljer om platformen vi udviklede, herunder eksempler på anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dyrkning af bakterier
- Forkultur bakterierne natten over i et tryptisk bouillon (TSB) ved 37 ° C med 220 rpm rystning (16-18 timer).
- Fortynd præ-kulturen 100-1000 gange (afhængigt af vækstraten for bakterier, her er 1.000 gange bruges til S. aureus) i frisk TSB og lade det vokse ved 37 ° C og 200 rpm for at nå eksponentiel vækst (optisk densitet ved 595 nm (OD 595) mellem 0,2 og 0,6).
BEMÆRK: Dette trin kræver stamme-specifik optimering.
2. biofilmdannelse: før og efter eksponering
- Fortynd de eksponentielt dyrkede kultur 100 gange (dette svarer cirka 10 6 kolonidannende enheder pr milliliter (CFU / ml)).
- Protokol præ-eksponering
- For ubehandlede kontrolprøver, der tilsættes 200 pi af den fortyndede bakteriekultur per brønd af en steril 96-mikrobrøndsplade.
- Tilsættes 4 pi af en testforbindelse eller en kontrolantibiotikum (50x stamopløsning) og 196 pi af den fortyndede bakteriekultur per brønd.
- Inkuber det ved 37 ° C på en pladeryster ved 200 rpm i 18 timer.
Bemærk: Her bruger vi en shaker med en 2 mm kredsløb.
- Protokol efter eksposition
- For alle prøver, der tilsættes 200 pi af den fortyndede bakteriekultur per brønd af en steril 96-mikrobrøndsplade.
- Inkuber det ved 37 ° C på en pladeryster ved 200 rpm i 18 timer.
Bemærk: Her bruger vi en shaker med en 2 mm kredsløb. - Fjerne hele planktoniske der forsigtigt uden at røre biofilmen, ved anvendelse af en multikanalpipette.
- Tilsættes 4 pi af en testforbindelse eller en kontrol antibiotikum (50x stamopløsning) og 196 pi TSB per brønd.
- Inkuber det ved 37 ° C på en pladeryster ved 200 rpm i yderligere 24 timer.
Bemærk: Her bruger vi en shaker med en 2 mm kredsløb.
3. Resazurin Farvning Protocol for Levedygtighed Vurdering af Biofilm
- Der fremstilles en stamopløsning på 0,1 mg / ml resazurin (0,4 mM) i sterilt PBS. Hold denne bestand sterile, beskyttet mod lys eksponering, og ved 4 ° C.
- Fortynd resazurin lager 1:50 i steril phosphatbufret saltvand (PBS) for at opnå en slutkoncentration på 20 uM.
- Overføre hele planktoniske opløsning (forlader biofilm i brøndene) forsigtigt, uden at røre biofilm eller skabe luftbobler, til en separat, ren 96-brønds plade under anvendelse af en multikanalpipette.
- Vask biofilm gang med sterilt PBS ved at tilføje 200 pi per brønd, og fjerne det forsigtigt med en multikanal pipette.
- Tilsæt 200 pi af den fortyndede resazurin pr brønd af biofilmen plade under anvendelse af en multikanalpipette.
- Inkuber det i mørke ved stuetemperatur (RT), og 200 opm, omrystning i ca. 20 minutter, indtil de ubehandlede biofilm kontroller er jævnt pink.
- Mål fluorescensen vedλ exc = 560 nm og λ em = 590 nm med en plade-læser (øverste læsning).
4. Crystal Violet Farvning Protokol for Biomasse Kvantificering af Biofilm Brug den samme plade som i trin 3
- Fjern resazurin pletten forsigtigt fra brønde med en multikanalpipette.
- Fastgør biofilm med 200 pi methanol i 15 min.
- Lad pladen lufttørre i 10 min.
- Tilføj 190 pi 0,02% (vol / vol, fortyndet i deioniseret vand) krystalviolet-opløsning, forsigtigt med en multikanalpipette. Undgå at berøre siderne af brøndene med pletten mens pipettering og forhindre dannelsen af luftbobler ved ikke at trykke på pipetten til at fuldføre blow-out.
- Inkuber det i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjerne pletten omhyggeligt med en multikanalpipette.
- Vask to gange med deioniseret vand (200 pi hver gang).
- Lad brøndene tørre i 5 minutter ved stuetemperatur og opløs den resterende pletteni 96% ethanol eller 33% eddikesyre.
- Inkuber det i 1 time ved stuetemperatur og læse absorbansen ved 595 nm.
5. Evaluering af bakteriedræbende virkning på Planktoniske Bakterier Brug den samme prøve plade som for biofilm
- Mål turbiditet ved 595 nm af pladen med den planktoniske opløsning fra 3,3.
- Farv de planktoniske bakterier med resazurin ved at tilføje 10 pi af resazurin lager per brønd. Bland godt ved pipettering.
- Inkuber det i mørke ved stuetemperatur i ca. 5 min, indtil de ubehandlede kontroller er jævnt pink.
- Mål fluorescensen ved λ exc = 560 nm og λ EM = 590 nm.
6. hvedekimagglutinin Farvning for Matrix Kvantificering og Fluorescence Microscopy Imaging af Biofilm
- Matrix kvantificering
- Der fremstilles en 5 ug / ml opløsning af WGA probe i sterilt PBS.
- Brug en parallel prøve plate for denne farvning. Fjern planktoniske løsning fra brøndene og vask en gang med sterilt PBS (200 pi per brønd), forsigtigt med en multikanalpipette uden at røre biofilm.
- Tilsæt 200 pi WGA opløsning per brønd, der skal farves.
- Inkuber det i mørke ved 4 ° C i 2 timer.
- Fjern ubundet farve ved vask af brøndene med 200 pi PBS tre gange.
- Lad pladen tørre i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Opløs det bundne plet i 33% eddikesyre, anvendelse af 200 pi per brønd.
- Forsegl brøndene med striben hætter og lydbehandling dem ved hjælp af et vandbad sonikator i 30 sek ved stuetemperatur, og 40 kHz.
- Inkubér pladen i 1 time ved stuetemperatur.
- Gentag lydbehandlingstrin. Brøndene kan forblive forseglet mellem sonication trin.
- Mål fluorescens ved λ ex = 495 nm og λ em = 520 nm med en plade-læser (øverste læsning).
- Visualisere matrix medfluorescensmikroskopi
- Brug den samme protokol som ovenfor, indtil trin 6.1.6.
- Efter tørringstrinnet, visualisere prøverne med et fluorescensmikroskop under anvendelse af et FITC-filter (eller en anden egnet grøn excitationsfilter).
7. Farvning levedygtige og døde celler i biofilm for Imaging med Fluorescence Microscopy og Kvantificering af Signal for Green-til-rød-ratio (G / R)
- Imaging med fluorescens mikroskopi
- Der fremstilles en opløsning af hver probe (én farvende levedygtige celler og den anden farvende døde celler), ifølge producentens anvisninger.
- Fjern planktoniske løsning fra brøndene og vask en gang med sterilt PBS (200 pi per brønd) under anvendelse af en multikanalpipette.
- Tilsæt 6 pi farvningsopløsningen per brønd.
- Inkubér pladen i mørke i 15 minutter.
- Før mikroskopi, fjerne den overskydende væske manually hjælp af en multikanalpipette.
- Fang billeder ved hjælp af en fluorescens mikroskop, bruger for eksempel et FITC-filter (for grøn fluorescens, levedygtige celler) eller et TRITC filter (rød fluorescens, døde celler).
- Kvantificering af signalet som et grønt-til-rød-fluorescensforhold (G / R)
- Følg den samme protokol som i trin 7.1.1 og 7.1.2.
- Tilsæt 200 pi af farveopløsningen per brønd og inkuber dem i 15 minutter i mørke.
- Mål fluorescens med en pladelæser ved excitations- / emissionsbølgelængder 485/535 nm og 485/635 for grøn og rød fluorescens, henholdsvis (øverste læsning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den foreslåede platform, er virkningerne på levedygtigheden, biomasse og biofilm matrix kvantificeret. I arbejdsgruppen sekvens (figur 1), er en prøve plade farvet med resazurin og efterfølgende med krystalviolet til samtidig vurdere virkningerne på bakteriel biofilm levedygtighed og på total biofilm biomasse. Begge assays kan udføres efter hinanden i den samme plade, fordi det blev demonstreret tidligere, at en første farvning med resazurin havde ingen statistisk signifikant virkning på krystalviolet farvning resultat (p = 0,4149 for sammenligning af maksimale signal absorbansenheder mellem krystalviolet plader farves separat eller efter resazurin-farvning, n = 20) 26. Effekten på planktoniske bakterier kan samtidigt evalueres.
Når hits identificeres fra enten levedygtighed eller biomassen-baseret assay, en anden plade er st ained med WGA-proben at kvantificere virkningen af forbindelserne på polysaccharidet komponent (PNAG) af biofilmen matrix. Denne arbejdsproces kan anvendes til screening af kemiske biblioteker, såvel som til funktionelle opfølgende undersøgelser for styrke målinger af hit-forbindelser, som eksemplificeret nedenfor.
Figur 1: Arbejdsgang af de tre-assay platform. Skematisk fremstilling af arbejdsgangen kombinere de tre assays af biofilm prøver. Platformen indeholder farvning for en effekt på levedygtighed, biomasse og EPS lag; billeddannelse ved hjælp af fluorescens mikroskopi; og evaluering af effekten på planktoniske fase. "A" og "NA" står for "Aktiv" og "Ikke aktiv", hhv. Modificeret fra Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Udførelse af Tre-assay Platform til screening
Her er to screening kørsler vist som repræsentative resultater opnået af platformen. I den første kampagne (figur 2A) blev et lille bibliotek med cinchonaalkaloid derivater screenes for anti-biofilm aktivitet mod S. aureus biofilm 27, mens der i det andet eksempel (figur 2B), en naturlig og naturligt inspireret bibliotek af abietane-typen diterpenoider og derivater blev udforsket 28,29. De aktive hits blev bestemt ved hjælp af de beregnede hit grænser (tærskler; Ligning 6, tabel 1). I hver screening undersøgelse af resultaterne af de første to assays korrelerede meget godt; hits var alle i stand til at reducere levedygtighed og biofilmen biomasse, while de inaktive forbindelser viste ingen effekt på hverken assay. Alle de identificerede hits blev derefter testet på den tredje (WGA) assay, men de havde ingen matrix-adskillelse (eller matrix-nedbrydende) virkninger (resultater ikke vist).
Figur 2: Repræsentative resultater af screening kampagner ved hjælp af platformen med S. aureus biofilm. To eksempler på proof-of-concept validering skærme udføres ved hjælp af analysen platform. Resultaterne er præsenteret som en procentdel af den ubehandlede biofilm kontrol, er hit-forbindelser vist med rødt, og linjerne repræsenterer de beregnede hitgrænserne. (A) Screening af et Cinchona-alkaloidderivat bibliotek identificeret én aktiv forbindelse. (B) Screeningen af et bibliotek af abietane-typen diterpenoider og derivater identificeret fem handlingive forbindelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Udførelse af Tre-assay Platform for opfølgende undersøgelser
Repræsentative resultater kan ses i figur 3, hvor to kendte antibiotika blev testet ved et meget bredt område af koncentrationer (0,5 nM-5 mM) mod S. aureus biofilm. Mindste hæmmende koncentration (MIC) værdier af referencestoffer mod planktoniske bakterier (enten fra litteraturen eller udføres i laboratoriet) tjene som retningslinjer for at vælge de koncentrationer for at teste mod biofilm af samme art. Derudover kan viden om de koncentrationsværdier, hvor ingen cytotoksicitet detekteres i pattedyrsceller også hjælpe ved udvælgelsen af fusionen til at teste for anti-biofilm opfølgning. ideelt,hvis der foreligger både antimikrobielle og cytotoksicitetsdata for en bestemt forbindelse, kan en parameter kendt som "Biokompatibilitet Index" (BI) beregnes som defineret af Müller og Kramer 30. Her blev MIC-værdier mod planktoniske S. aureus for penicillin G og ciprofloxacin bestemt til at være 0,04 um og 6 uM (resultater ikke vist). Således er koncentrationen interval varierede fra ca. 10 5 x MIC til 10 -2 x MIC og 10 3 x MIC til 10 -4 x MIC for penicillin og ciprofloxacin, hhv. Begge antibiotika i væsentlig grad kan formindske levedygtighed, biomasse og biofilm matrix PNAG indhold, når de blev udsat for encellede bakterier forud for indledningen af biofilm dannelse processen (figur 3a). Trods den meget høje koncentration af afprøvet på foruddannede (18 timer) biofilm antibiotika, levedygtighed og biomassen blev kun reduceret til ca. 50% af tslange af ubehandlede biofilm (figur 3B). Den mest fremtrædende resultat her var stigningen i biofilmen matrix (til over 200%), når forud dannede biofilm blev behandlet med høje koncentrationer af penicillin G. blev påvist ingen ændringer i indholdet af biofilm matrix når præformede biofilm blev behandlet med ciprofloxacin.
Figur 3: Eksempel på en opfølgende undersøgelse af anti-biofilm effekter ved hjælp af to model antibiotika mod S. aureus biofilm. Virkningerne af penicillin G og ciprofloxacin er præsenteret her: (A) før biofilmdannelse (præ-eksponering) og (B) post-biofilmdannelse (post-eksponering). For figur klarhed, kun de laveste og de højeste testede koncentrationer er vist. Standardafvigelserne ikke overstige 20%. *** EQUAls p <0,01. Modificeret fra Skogman et al. 26 Klik her for at se en større version af dette tal.
Fluorescens mikroskopi-baserede Imaging
Det resultat, at penicillin G ved 400 uM (samt højere koncentrationer, som vist i figur 3b) dræber ca. 50% af den i forvejen dannede S. aureus biofilm bakteriepopulation blev bekræftet med en anden levedygtighed farvning assay. Gennemsnittet af de grønne-til-rød (G / R) fluorescens nøgletal for de ubehandlede biofilm brønde var 2,75, hvilket indikerer en overvægt af levende (grønne-farvede) celler over døde (rød-farvet) celler. Men i penicillin-behandlede celler G / R-forhold faldt til 1,54, hvilket svarer til 56% af kontrolbrøndene. Cellerne resterende live efter penicillin behandling proindført en betydeligt højere mængde af EPS, som bedømt ud fra den detekterede stigning i grøn (WGA) fluorescens sammenlignet med ubehandlede biofilm (figur 4b). Vi anbefaler, når det er muligt, at udføre disse imaging-baserede eksperimenter for yderligere at bekræfte resultaterne af platformen, især i den fase, karakterisering af hit kandidater.
Figur 4: Fluorescens mikroskopi. Virkningen af penicillin tilsætning (400 uM) om levedygtighed og EPS produktion er vist her. De øverste billeder (A) svarer til ubehandlede biofilm og penicillin-behandlede biofilm, hvor levedygtige celler farves grønne og døde celler farves rød. Den indsatte graf illustrerer beregningerne af G / R fluorescens nøgletal. De nederste billeder (B) svarer til ubehandlede biofilm og penicillin-behandlede celler farvet med WGA-proben. Den indsatte graf viser kvantificering af WGA signaler til behandlede og ubehandlede biofilm prøver, og fejlsøjler repræsenterer standardafvigelser. Modificeret fra Skogman et al. 26 Klik her for at se en større version af dette tal.
Databehandling og statistisk analyse
Statistiske parametre beregnes til at karakterisere kvaliteten af de assays og følge deres præstationer under screeningen kørsler. Ligningerne for de vigtigste parametre, der anvendes, samt de opnåede og målværdier, er anført i tabel 1. I alle ligninger, SD min, μ min, SD max, og u max repræsenterer de standardafvigelser og hjælp af minimal(Min) og maksimale (max) signaler, hhv. I de her beskrevne, parrede sammenligninger af de oprindelige værdier blev gjort med en uparret t-test med Welch korrektion, hvor p <0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Tabel 1: Statistiske parametre, der anvendes til at evaluere resultaterne af analyserne. I alle ligninger, SD min, μ min, SD max, og u max repræsenterer standardafvigelser og hjælp af minimale (min) og maksimale (max) signaler, hhv. De farvningsfremgangsmåder, tilsætte Resazurin, krystalviolet, og hvedekimagglutinin, er forkortet RES, CrV, og WGA, hhv. RFU: relative fluorescensenheder; RAU: relative absorbansenheder. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er ingen enkelt metode, der samtidigt kan måle virkningen af en forbindelse på levedygtigheden, biomasse og biofilm matrix. Derfor er der et behov for at kombinere assays for at detektere en virkning på de tre endepunkter, fortrinsvis ved en primær screening.
Resazurin er en meget enkel farvningsprotokol kun består af tilsætningen af redox-proben. Men er afgørende for succes i denne analyse, oprettelse af optimale inkubationstid af biofilm med resazurin. I nogle bakteriestammer, reduktion af resazurin sonden til den lyserøde, fluorescerende resorufin sker meget hurtigt, mens det i andre kan det vare flere timer 19. Endvidere under samme bakteriestamme, der kan også være betydelige forskelle mellem planktoniske bakterier og biofilm. De planktoniske bakterier er typisk mere let nås, hovedsagelig fordi det bakterielle densitet er lavere i planktoniske populationer end i biofilm poge bestande, som fremmer hurtigere omsætning af reaktionen. I en offentliggjort sammenligning af biofilm levedygtighed farvning sonder blev resazurin indgået for at være en af de mest præcise, enkle at bruge, og billigste assays 19. Endvidere er det blevet vist at være anvendelig til en række bakterielle og fungale organismer 19. På den anden side er krystalviolet assayet er den mest udbredte til biofilm mass kvantificering 19,32,33. De mest kritiske trin i denne protokol er tilsætning og fjernelse af krystalvioletfarvning opløsning. Disse trin skal udføres meget omhyggeligt for at undgå uspecifik farvning (f.eks grund dråber af pletten på væggene i brøndene). En af de vigtigste fordele ved at bruge resazurin som den første farvning assayet er, at det er ikke-toksisk for cellerne, som giver mulighed for et samme plade til krystalviolet farvning. Kombinationen af begge analyser forenkler væsentligt arbejdsgangen, sænker omkostningerne, sparer forbrugerhavender, og minimerer brugen af testforbindelserne, hvilket er særlig værdifuldt i en screening miljø.
Som tidligere nævnt, den selv-producerede ekstracellulære polysaccharid matrix er en vigtig bestanddel af biofilm. For at måle matrix indhold (især vigtige polysaccharider), blev en tredje analyse medtaget her, er baseret på fluorescens-mærkede WGA. Oprindeligt WGA kvantificering blev beskrevet som et enzymbundet lectin-sorbent assay (ELLA) 24. Et lignende assay baseret på farvende glycosaminoglycaner (GAG) i matrixen af S. aureus biofilm med dimethylmethylen blå (DMMB) er også blevet anvendt 31,34. GAG'er ligner polysaccharid intercellulære adhæsiner (PIA) fundet i matrixen af Staphylococcus spp. biofilm 35. Den WGA-assay Tilsvarende mål konsekvensvurderinger, men WGA mere specifikt binder sig til poly- N-acetyl-glucosamin-rester, som spiller en væsentlig rolle i biofilmen matrix 36 </ Sup>. Målretning matricen er af stor betydning på grund af det faktum, at biofilm nemt kan regrow hvis matricen er tilbage efter en kemisk eller antibiotisk behandling. Bakterier kan også lettere vedhæfte til en overflade, der er matrix pre-coated 35. Det er blevet vist, at nogle antibiotika effektivt kan sænke levedygtighed og biofilm biomasse, men uden nogen effekt på matricen. I vores eksperimenter, er dette eksemplificeret ved tilfælde af ciprofloxacin 31. Nogle antibiotika kan endda øge matrixproduktion, som demonstreret her med penicillin G 26. Baseret på disse ændringer, kan antibiotika inddeles i kategorierne i tabel 2. Alle hits i vores screening undersøgelser (figur 2) kan klassificeres sammen med ciprofloxacin, som forbindelser, der dræber bakterierne i biofilmen og reducere biomassen, men må ikke adskilles eller forstyrre biofilm matrix.
| Kategori | Effekt på bakterier | Effekt på matrix | Eksempel antibiotikum (target biofilm) | Reference |
| 1 | ingen | ingen | ampicillin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 2 | ingen | - | cefalotin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 3 | - | ingen | polymyxin (SA) | (TOTE et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamycin (PA) | (TOTE et al. 2009) |
| ciprofloxacin (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxycyclin (PA) | (TOTE et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicillin G (SA, EF) | (Skogman et al. 2012) |
Tabel 2: Klassificering af antibiotika. De antibiotika er opdelt i kategorier baseret på deres effekt på levedygtigheden af biofilm bakterier (ved hjælp resazurin farvning) og matricen (ved hjælp af WGA eller dimethylmethylen blå (DMMB) farvning). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EF: Escherichia coli. Modificeret fra TOTE et al. 31
Desuden er denne platform er ideel til udførelse af primær screening kampagner. Den mest omkostningseffektive og tid-effektiv strategi er at anvende tilsætte Resazurin og krystalviolet assays som et første lag strategi og gå videre til WGA-matrix assay i andet lag (opfølgning) undersøgelser. Dette skyldes det faktum, at WGA-proben er temmelig dyrt, og at dette assay består af flere trin, hvilket gør det mere besværligt og tidskrævende.
En relevant træk ved denne platform er muligheden for at vurdere de langsigtede virkninger af de identificerede antimikrobielle midler. Langsigtede kemoterapeutiske virkning kan kun opnås, hvis biofilmen matrix skilles ad. Det er blevet vist, at risikoen for genoplivning af biofilmen infektion er meget højere, hvis matricen er efterladt. Med denne platform, er det muligt først at vurdere, om den samlede biofilm biomasse påvirkes ved hjælp krystalviolet farvning. En mere dETALJERET vurdering af biofilm matrix polysaccharider, ved hjælp af WGA-assayet, kan følge. Af note, er sandsynligheden for at identificere et enkelt molekyle, der både kan adskille matricen og udøve antibakteriel (biocid) virkninger kan betragtes som lav. Faktisk hidtil de eneste forbindelser af denne type, som vi har identificeret, er antimikrobielle peptider 37. For at løse dette, er opfølgning udføres i denne platform med enten resazurin- eller krystalviolet-aktive hits, da denne strategi muliggør identifikation af forbindelser med separat biocide eller matrix-nedbrydende aktivitet. Sådanne ledninger kan være potentielt interessant for flerkomponent-strategier. En kombination af matrix-nedbrydende molekyler med biocide eller antibiotika-type forbindelser forventes at give en mere effektiv biofilm udryddelse.
Sammenfattende platformen præsenteres her giver et godt grundlag for anti-biofilm screening ved hjælp levedygtighed og biomasse målinger sammen med matrix kvantifikation og visualisering. Både tilsætte Resazurin og krystalviolet farvende assays kan også anvendes til andre former for biofilm- danner mikroorganismer. Men disse assays kræver særskilt optimering for både voksende og farvningsbetingelser. Anvendeligheden af WGA-farvning assayet er begrænset til de bakterier, hvor poly- N-acetyl-glucosamin er en hovedkomponent i biofilmen matrix. Andre matrix kvantificering assays (som den er baseret på dimethyl-methylenblåt farvning) kan anvendes i andre tilfælde. Tilsammen analyserne i denne platform er forholdsvis let at udføre, og alle reagenser er let tilgængelige samt generelt overkommelig. Denne platform er egnet til lav- til medium-throughput anti-biofilm screening uden behov for dyre investeringer udstyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Paul Cos og LMPH, University of Antwerpen, Belgien for hans støtte under optagelserne processen i sit laboratorium. Dette arbejde blev finansieret af Academy of Finland projekter (projekter 272.266 og 282.981) og Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De tekniske bidrag MSc Janni Kujala anerkendes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
