Abstract
Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en het potentieel verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties. Biofilms hebben een uitzonderlijk hoge tolerantie voor chemotherapie, waarvan wordt gedacht multifactoriële te zijn weergegeven. Bijvoorbeeld, de matrix levert een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen in de biofilm fenotypisch verschillend. Waarschijnlijk biofilm veerkracht ontstaat door een combinatie van deze en andere, nog onbekende mechanismen. Alle momenteel bestaande antibiotica zijn ontwikkeld tegen één-cellen (planktonische) bacteriën. Derhalve tot nu toe een zeer beperkte repertoire van moleculen bestaat die selectief werken op rijpe biofilms. Deze situatie heeft een progressieve paradigmaverschuiving in drug discovery, waarin op zoek naar anti-biofilms werd aangespoord om een meer prominente plaats innemen gereden. Een bijkomend probleem is dat er eenzeer beperkt aantal gestandaardiseerde biofilm onderzoek, met name die kan worden gebruikt voor grote verwerkingscapaciteit screenen van chemische bibliotheken. Hier wordt een experimentele anti-biofilm platform voor chemische screening gepresenteerd. Het maakt gebruik van drie bepalingen om biofilm levensvatbaarheid (met Resazurin kleuring), totale biomassa (met kristalviolet kleuring) en biofilm matrix (gemeten met behulp van een tarwekiem agglutinine, WGA-fluorescentie-gebaseerde kleuring van het poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG , fractie). Alle testen werden ontwikkeld met behulp van Staphylococcus aureus bacteriën als model. Voorbeelden van het platform kan worden gebruikt voor primaire screening en voor functionele karakterisering van geïdentificeerde anti-biofilm hits worden gepresenteerd. Deze experimentele sequentie verder zorgt voor de indeling van de treffers op basis van de gemeten eindpunten. Het biedt ook informatie over hun werkingsmechanisme, vooral op lange termijn versus korte termijn chemotherapeutische effecten. Het is dus zeer Advantageous voor de snelle identificatie van hoogwaardige hit verbindingen die als uitgangspunt kunnen dienen voor diverse biomedische toepassingen.
Introduction
Bacteriën kunnen schakelen tussen twee zeer verschillende levensstijlen, plankton en zittend, waarvan een biofilm is de meest voorkomende voorbeeld. In biofilms, bacteriën vormen gestructureerde gemeenschappen ingebed in een zelfgeproduceerde matrix 1. Dit zelf geproduceerde matrix is een barrière tussen de bacteriën en hun externe omgeving, en het beschermt de microbiële cellen, waardoor ze in de buurt. De samenstelling van de biofilm matrix varieert tussen en zelfs binnen soorten, maar bestaat voornamelijk uit een dicht netwerk van lipopolysacchariden, extracellulair DNA en eiwitten. De matrix dient als een fysieke barrière remmen van de ingang van schadelijke stoffen, maar beschermt ook de biofilm tegen uitdroging en voorkomt voedingsstoffen ontsnapt de cel 2.
Biofilms worden beschouwd als een van de meest uitdagende onderwerpen moderne biogeneeskunde en ze ogenschijnlijk verantwoordelijk voor meer dan 80% van antibiotica-tolerante infecties 3. ze displegt een inherent hoge tolerantie tegen externe bedreigingen vochtigheidsgraad, osmotische druk, mechanische belasting 4, warmte, UV straling 5, desinfecterende middelen, antimicrobiële middelen en gastheerimmuunsysteem 1. Zo heeft de vereiste antimicrobiële middel concentratie vereist om een biofilm te doden aangetoond tot 1000 maal hoger in vergelijking met die welke vereist is planktonische bacteriën te doden. De verklaring voor deze hogere tolerantie lijkt multifactorieel. De matrix bevat een fysieke barrière die het binnendringen van antibiotica vermindert in de biofilm. Ook cellen binnen de biofilms zijn fenotypisch divers; zij overgang tussen verschillende metabolische toestanden als gevolg van een bestaande gradiënt van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten tussen de binnenste en buitenste delen van de biofilm 6. Dus in sommige biofilm gebieden, zoals de kern, bacteriën zijn verstoken van zuurstof en voedingsstoffen en in een metabolisch minder actieve of volledig rusttoestand
Vanuit methodological perspectief, extra uitdagingen bestaan, aangezien slechts een beperkt aantal biofilm methoden zijn ontwikkeld door normalisatie-organisaties, met name die van toepassing zijn op de high-throughput screening van chemische bibliotheken. Alle gestandaardiseerde assays (op één uitzondering na) zijn gebaseerd op biofilmreactoren, en deze werkwijzen vereisen grote hoeveelheden werk- en grote hoeveelheden van te onderzoeken verbindingen, die gewoonlijk beschikbaar tijdens de vroege experimentele stadium 9-12. De enige bestaande gestandaardiseerde screening-toepassing test is de zogenaamde Calgary Biofilm apparaat, waaruit de handel verkrijgbare minimale biofilm elimineren concentratie (MBEC) systeem ontwikkeld 13-15. De beperking van deze test is dat de biofilms worden geteeld op pennen, en niet elke bacteriële species of stammen binnen dezelfde soort kunnen biofilms deze inrichting te vormen. Bovendien methoden die met name kunnen worden toegepast op de exploratie van natuurlijke verbindingennodig. Natuurlijke producten zijn de belangrijkste bron voor innovatie in antimicrobiële drug discovery in de afgelopen eeuw 16 geweest. Ze kunnen nieuwe anti-biofilm verbindingen te voorzien van unieke werkingsmechanismen die ook effectief tegen persistorcellen kan zijn. Zo is de exploratie van natuurlijke en natuurlijk geïnspireerd bibliotheken heeft een hoge kans op het produceren van veelbelovende en unieke anti-biofilm leads.
Hier presenteren we de experimentele gegevens van een platform van assays die is ontwikkeld voor het screenen van chemische anti-biofilm verbindingen met behulp van drie tests om de effecten op de levensvatbaarheid, totale biomassa en matrix van Staphylococcus aureus biofilms meten. De eerste assay meet biofilm levensvatbaarheid en het is gebaseerd op resazurin kleuring. Resazurin is een redox vlek die is blauw en niet-fluorescerende in zijn geoxideerde toestand en kleurt roze, sterk fluorescerende resorufine wanneer het gereduceerd door metabolische activiteit van de bacteriën. Het is een zeer eenvoudige en snelle methode geschikt voor primaire screenings 17-20. De tweede test, op basis van kristalviolet kleuring, meet totale biofilm massa. Crystal violet is een veel gebruikte vlek voor het bestuderen van bacteriën en bacteriën in biofilms 19,21-23. De test is gebaseerd op goedkope reagentia en heeft een eenvoudige absorptie eindpunt lezen. Het derde onderzoek richt de extracellulaire polymere stoffen (EPS) -matrix van de biofilm via tarwekiem agglutinine (WGA), dat specifiek bindt aan N-acetyl-glucosamine residuen (PNAG) aanwezig in de matrix op Staphylococcus biofilms 24 poly-. De WGA is geconjugeerd met een fluorofoor die kan worden gedetecteerd via fluorescentie-intensiteit lezers 25. Wij presenteren hier de reden en de details van het platform dat we ontwikkeld, met inbegrip van voorbeelden van toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het kweken van de bacteriën
- Voorkweek de bacteriën overnacht in een tryptische soja bouillon (TSB) bij 37 ° C met 220 rpm schudden (16-18 uur).
- Verdun de voorkweek 100-1000 keer (afhankelijk van de groeisnelheid van de bacteriën, hier is 1000 keer gebruikt voor S. aureus) in vers TSB en laten groeien bij 37 ° C en 200 rpm te bereiken exponentiële groei (optische dichtheid bij 595 nm (OD 595) tussen 0,2 en 0,6).
OPMERKING: Deze stap vereist stam-specifieke optimalisatie.
2. Biofilm Formation: Pre- en Post-exposure
- Verdun de exponentieel gegroeid kweek 100 maal (dit komt overeen met circa 10 6 kolonievormende eenheden per milliliter (CFU / ml)).
- Pre-exposure protocol
- Voor onbehandelde controlemonsters, voeg 200 ul van de verdunde bacteriecultuur per putje van een steriele 96-microwell plaat.
- Voeg 4 pi van een testverbinding of controlantibioticum (50x voorraad-oplossing) en 196 pl van de verdunde bacteriecultuur per well.
- Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende 18 uur.
Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan.
- Post-exposure protocol
- Voor alle monsters, voeg 200 ul van de verdunde bacteriecultuur per putje van een steriele 96-microwell plaat.
- Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende 18 uur.
Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan. - Verwijder de gehele plankton oplossing voorzichtig, zonder het aanraken van de biofilm, met behulp van een multichannel pipet.
- Voeg 4 pi van een testverbinding of een controle-antibioticum (50x voorraadoplossing) en 196 gl per putje TSB.
- Incubeer het op 37 ° C op een plaat schudder bij 200 rpm gedurende nog 24 uur.
Opmerking: Hier maken we gebruik van een shaker met een 2 mm baan.
3. Resazurin kleuring protocol voor de levensvatbaarheid Assessment van biofilms
- Bereid een voorraadoplossing van 0,1 mg / ml resazurine (0,4 mM) in steriele PBS. Houd dit bestand steriel, beschermd tegen blootstelling aan licht, en bij 4 ° C.
- Verdun de Resazurin stock 1:50 in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot een eindconcentratie van 20 uM.
- Breng de volledige planktonische oplossing (waarbij de biofilms in putjes) voorzichtig zonder gebruikmaking van de biofilms of luchtbellen, een afzonderlijke, schone 96-wells plaat met een multichannel pipet.
- Was de biofilms eenmaal met steriel PBS door het toevoegen van 200 pl per putje, en verwijder voorzichtig met een multichannel pipet.
- Voeg 200 ul van de verdunde resazurin per putje van de biofilm plaat met behulp van een multichannel pipet.
- Incubeer in het donker bij kamertemperatuur (KT) en 200 rpm schudden gedurende ongeveer 20 min tot onbehandelde controles biofilm gelijkmatig roze.
- Meet de fluorescentie bijλ exc = 560 nm en λ em = 590 nm met een plaatlezer (top lezing).
4. Crystal Violet kleuring Protocol voor Biomassa Kwantificering van biofilms met dezelfde plaat als in stap 3
- Verwijder de Resazurin vlek voorzichtig uit de putjes met een multichannel pipet.
- Bevestig de biofilms met 200 pl methanol gedurende 15 min.
- Laat de plaat drogen aan de lucht gedurende 10 minuten.
- Voeg 190 ul van 0,02% (vol / vol, verdund in gedeïoniseerd water) kristalviolet oplossing voorzichtig met een meerkanaalspipet. Vermijd het aanraken van de zijkanten van de putten met de vlek terwijl pipetteren en te voorkomen dat de vorming van luchtbellen door niet drukken op de pipet om blow-out te voltooien.
- Incubeer het voor 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de vlek zorgvuldig met een multichannel pipet.
- Was het twee keer met gedemineraliseerd water (200 ui per keer).
- Laat de putjes drogen 5 minuten bij kamertemperatuur en los de resterende vlekin 96% ethanol en 33% azijnzuur.
- Incubeer gedurende 1 uur bij KT en lees absorptie bij 595 nm.
5. Evaluatie van het bacteriedodend effect op Planktonische Bacteriën Met behulp van hetzelfde monster Plate als voor de Biofilms
- Meet de troebelheid bij 595 nm van de plaat met de plankton oplossing van 3,3.
- Vlekken op de planktonische bacteriën resazurin door toevoeging van 10 ul van de resazurin voorraad per putje. Meng goed door pipetteren.
- Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 min, totdat de onbehandelde controles zijn gelijkmatig roze.
- Meet de fluorescentie bij λ = 560 nm exc en λ em = 590 nm.
6. tarwekiemagglutinine kleuring voor Matrix kwantificering en fluorescentiemicroscopie Imaging van biofilms
- matrix kwantificering
- Bereid een 5 ug / ml oplossing van WGA sonde in steriele PBS.
- Gebruik een parallelle sample plaTE voor deze vlekken. Verwijder het plankton uit de putjes en een keer wassen met steriele PBS (200 pi per putje), voorzichtig met een multichannel pipet zonder het aanraken van de biofilms.
- Voeg 200 ul van WGA-oplossing per putje te worden gemerkt.
- Incubeer in het donker bij 4 ° C gedurende 2 uur.
- Verwijder de ongebonden vlek door het wassen van de putjes met 200 pl PBS driemaal.
- Laat de plaat drogen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Los het gebonden vlek in 33% azijnzuur, gebruikt 200 gl per putje.
- Verzegeling van de putten met strip caps en ultrasone trillingen ze met behulp van een waterbad ultrasoonapparaat gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur en 40 kHz.
- Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij KT.
- Herhaal stap sonicatie. De putten kunnen verzegeld blijven tussen de sonicatie stappen.
- Meet de fluorescentie bij λ ex = 495 nm en λ em = 520 nm met een plaatlezer (top lezing).
- Het visualiseren van de matrix metfluorescentie microscopie
- Gebruik hetzelfde protocol als hierboven totdat stap 6.1.6.
- Na de droogstap, visualiseren monsters met een fluorescentiemicroscoop, met een FITC filter (of een andere geschikte groen opwekkingsfilter).
7. kleuring Levende en dode cellen binnen de biofilms for Imaging met fluorescentiemicroscopie en kwantificatie van het signaal voor de Green-to-rood-ratio (G / R)
- Beeldvorming met fluorescentie microscopie
- Bereid een oplossing van elke probe (een kleuring levensvatbare cellen en de ander kleuring dode cellen), volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Verwijder het plankton uit de putjes en eenmaal wassen met steriele PBS (200 ul per putje) met een multichannel pipet.
- Voeg 6 ul van de kleuroplossing per putje.
- Incubeer de plaat in het donker gedurende 15 minuten.
- Voor de microscopie, verwijder de overtollige vloeistof manually met behulp van een multichannel pipet.
- Vastleggen van de beelden met behulp van een fluorescentiemicroscoop, met behulp van bijvoorbeeld een FITC-filter (voor groene fluorescentie, levensvatbare cellen) of een TRITC filter (rode fluorescentie, dode cellen).
- Kwantificering van het signaal als een groen-naar-rood-fluorescentieverhouding (G / R)
- Volg hetzelfde protocol als in de stappen 7.1.1 en 7.1.2.
- Voeg 200 ul van de kleuroplossing per putje en incubeer ze gedurende 15 minuten in het donker.
- Meet de fluorescentie met een bord lezer bij excitatie / emissie golflengten 485/535 nm en 485/635 voor groene en rode fluorescentie, respectievelijk (top lezing).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het voorgestelde platform, worden de effecten op de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix gekwantificeerd. In de werkende sequentie (figuur 1), wordt één monster plaat gekleurd met resazurin en vervolgens met kristalviolet om de effecten op bacteriële biofilm levensvatbaarheid en totale biofilm biomassa gelijktijdig evalueren. Beide testen kunnen achtereenvolgens worden uitgevoerd in dezelfde plaat omdat werd aangetoond eerder dat een eerste kleuring met resazurin had geen statistisch significant effect op de kristalviolet kleuring resultaat (p = 0,4149 voor de vergelijking van de maximale signaal absorptie-eenheden tussen kristalviolet platen afzonderlijk gekleurd of na Resazurin-kleuring, n = 20) 26. Het effect op planktonische bacteriën samen beoordeeld.
Wanneer hits worden geïdentificeerd van zowel de levensvatbaarheid of de biomassa gebaseerde test, een tweede plaat is st ained de WGA probe om het effect van de verbindingen van de component polysaccharide (PNAG) van de biofilm matrix kwantificeren. Deze workflow kan worden toegepast op de screening van chemische banken, alsmede functionele vervolgonderzoeken potentie metingen hit verbindingen, zoals hieronder toegelicht.
Figuur 1: Workflow van de drie-test platform. Schematische weergave van de workflow combineren van de drie tests op biofilm monsters. Het platform omvat kleuring van een effect op de levensvatbaarheid, biomassa en EPS laag; beeldvorming met behulp van fluorescentie microscopie; en waarbij het effect op het plankton fase. "A" en "NA" staan voor respectievelijk "actief" en "Niet actief". Gewijzigd ten opzichte van Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Prestaties van de Drie-assay Platform voor Screening Purposes
Hier worden twee runs screening weergegeven als representatieve resultaten van de uitvoering van het platform. In de eerste campagne (Figuur 2A), een kleine bibliotheek van cinchona-alkaloïde derivaten gescreend op anti-biofilm activiteit tegen S. aureus biofilms 27, terwijl in het tweede voorbeeld (figuur 2B), een natuurlijke en natuurlijk geïnspireerd bibliotheek abietane-type diterpenoïden en derivaten werd verkend 28,29. De actieve treffers werden bepaald onder toepassing van de berekende grenzen hit (drempels, Vergelijking 6, Tabel 1). Iedere screening studie, de resultaten van de eerste twee assays correleerden goed; hits waren in staat om de levensvatbaarheid en de biofilm biomassa te reduceren, while de inactieve verbindingen vertoonden geen effect heeft op assay. Alle treffers die werden vervolgens getest op de derde (WGA) test, maar geen matrix-demontage (of matrix-afbrekende) effect had (resultaten niet getoond).
Figuur 2: Representatieve resultaten van de screening campagnes met behulp van het platform met S. aureus biofilms. Twee voorbeelden van proof-of-concept validatie schermen uitgevoerd met behulp van de test platform. De resultaten worden als percentage van de onbehandelde controle biofilm, worden de verbindingen hit in rood aangegeven en de lijnen stellen de berekende trefferlimieten. (A) Het screenen van een cinchona-alkaloïdederivaat bibliotheek die een actieve verbinding. (B) Het screenen van een bibliotheek van abietane-type diterpenoïden en derivaten geïdentificeerd vijf active verbindingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Prestaties van de Drie-assay Platform voor vervolgstudies
Representatieve resultaten zijn te zien in figuur 3, waarbij twee bekende antibiotica werden getest bij een zeer breed bereik van concentraties (0,5 nM-5 mM) tegen S. aureus biofilms. Minimale remmende concentratie (MIC) waarden van referentieverbindingen tegen planktonische bacteriën (hetzij uit de literatuur of uitgevoerd in het laboratorium) dienen als leidraad voor het kiezen van de concentraties te testen tegen biofilms van dezelfde soort. Bovendien kan de kennis van de concentratiewaarden waarin geen cytotoxiciteit wordt gedetecteerd in zoogdiercellen ook helpen bij de keuze van de concentratie te testen op anti-biofilm opvolging. Ideaal,als zowel antimicrobiële en cytotoxiciteit gegevens voor een bepaalde verbinding beschikbaar zijn, kan een parameter bekend als de "Biocompatibiliteit Index" (BI) berekend, zoals bepaald door Müller en Kramer 30. Hier zijn MIC waarden tegen plankton S. aureus penicilline G en ciprofloxacine werden vastgesteld bij 0,04 uM en 6 uM, respectievelijk (resultaten niet getoond). Zo is de concentratie interval varieerde van ongeveer 10 x 5 MIC tot 10 -2 x MIC en 10 3 x MIC tot 10 -4 x MIC voor penicilline en ciprofloxacine, respectievelijk. Zowel antibiotica kon de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix PNAG inhoud aanzienlijk dalen toen ze werden blootgesteld aan eencellige bacteriën voorafgaand aan de opening van het biofilm vormingsproces (Figuur 3a). Ondanks de zeer hoge concentratie getest op voorgevormde (18 hr) biofilms antibiotica, de levensvatbaarheid en de biomassa werd gereduceerd tot slechts ongeveer 50% van dslang van de onbehandelde biofilms (figuur 3b). Het belangrijkste resultaat hier was de toename van de biofilm matrix (tot meer dan 200%) als vooraf gevormde biofilms werden behandeld met hoge concentraties van penicilline G. geen wijzigingen in de inhoud van de biofilm matrix werd gedetecteerd wanneer voorgevormd biofilms werden behandeld met ciprofloxacine.
Figuur 3: Voorbeeld van een follow-up studie van de anti-biofilm effecten met behulp van twee model antibiotica tegen S. aureus biofilms. De effecten van penicilline G en ciprofloxacine worden hier gepresenteerd: (A) voorafgaand aan de vorming van (pre-blootstelling) en (B) na de vorming van biofilm (post-exposure) biofilm. Bij afbeelding duidelijkheid alleen de laagste en de hoogste geteste concentraties worden weergegeven. De standaarddeviaties niet meer dan 20%. *** equals p <0,01. Gewijzigd ten opzichte van Skogman et al. 26 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Fluorescentie microscopie-gebaseerde Imaging
Zodat penicilline G bij 400 uM (en hogere concentraties, zie figuur 3b) doodt ongeveer 50% van de voorgevormde S. aureus biofilm bacteriepopulatie werd bevestigd met een andere levensvatbaarheid kleuring assay. Het gemiddelde van de groene tot rode (G / R) fluorescentie verhoudingen voor de onbehandelde putjes biofilm 2,75, hetgeen een overwicht van levende (groen gekleurd) cellen dood neer (rood gekleurd) cellen. In penicilline behandelde cellen de G / R-verhouding af tot 1,54, overeenkomend met 56% van de controles. De resterende cellen in leven na penicilline progeproduceerd aanzienlijk grotere hoeveelheid EPS, zoals beoordeeld uit de gedetecteerde toename van de groene (WGA) fluorescentie in vergelijking met onbehandelde biofilms (figuur 4b). Wij raden waar mogelijk, om deze imaging-gebaseerde experimenten uit te voeren om de resultaten van het platform verder te bevestigen, met name in het stadium van de karakterisering van hit kandidaten.
Figuur 4: Fluorescentie microscopie. Het effect van penicilline toevoeging (400 pm) op de levensvatbaarheid en EPS productie worden hier getoond. De bovenste foto's (A) komen overeen met onbehandelde biofilms en penicilline behandelde biofilms, waar de levensvatbare cellen zijn gekleurd groen en dode cellen zijn rood gekleurd. De ingevoegde grafiek illustreert de berekening van G / R fluorescentie verhoudingen. De onderste foto's (B) komen overeen met onbehandelde biofilms en penicillinebehandelde cellen gekleurd met de WGA probe. De ingevoegde grafiek toont de kwantificering van de WGA signalen voor behandelde en onbehandelde monsters biofilm en error bars geven de standaardafwijkingen. Gewijzigd ten opzichte van Skogman et al. 26 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Data Processing en statistische analyse
Statistische parameters worden berekend aan de kwaliteit van de testen karakteriseren en om hun prestaties te volgen bij screening runs. De vergelijkingen van de belangrijkste parameters, evenals de verkregen streefwaarden, zijn weergegeven in Tabel 1. In alle vergelijkingen, SD min, μ min, max SD en p max geven de standaardafwijkingen en middelen voor de minimale(Min) en maximale (max) signalen, respectievelijk. In de hier getoonde resultaten, gepaarde vergelijking van de oorspronkelijke waarden werden gedaan met een ongepaarde t-test met correctie Welch, waar p <0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Tabel 1: Statistische parameters gebruikt om de prestaties van de assays te evalueren. In alle vergelijkingen, SD min, μ min, max SD en p vertegenwoordigen max de standaardafwijkingen en middelen voor de minimale (min) en maximale (max) signalen, respectievelijk. De kleuringen, Resazurin, kristalviolet en tarwekiem agglutinine afgekort RES CRV en WGA respectievelijk. RFU: relatieve fluorescentie-eenheden; RAU: relatieve absorptie-eenheden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is geen enkele methode die tegelijkertijd het effect van een verbinding op de levensvatbaarheid, biomassa en biofilm matrix kan meten. Daarom is er een behoefte voor het combineren assays om een effect te detecteren op de drie eindpunten, bij voorkeur bij een primaire screening fase.
Resazurin is een zeer eenvoudige kleuringsprotocol waarop uitsluitend de toevoeging van de redox probe. De vaststelling van de optimale incubatietijd van de biofilms met Resazurin is cruciaal voor het succes van deze test. In sommige bacteriestammen, het verminderen van de Resazurin probe om de roze, fluorescerende resorufine komt zeer snel, in andere kan het enkele uren duren 19. Bovendien binnen dezelfde bacteriestam er ook significante verschillen tussen planktonische bacteriën en biofilms zijn. De planktonische bacteriën worden meestal meer gemakkelijk te bereiken, vooral omdat de bacteriële dichtheid lager in planktonische populaties dan in biofilm populations, die hogere omloopsnelheden van de reactie bevordert. In een gepubliceerde vergelijking van biofilm levensvatbaarheid kleuring probes, werd resazurine gesloten een van de meest nauwkeurige, eenvoudig te gebruiken, en goedkoopste assays 19 zijn. Bovendien is aangetoond toepasbaar op een reeks van bacteriële en fungale organismen 19 zijn. Anderzijds, de kristal violet test is de meest gebruikte voor biofilm massa kwantificering 19,32,33. De meest kritische stappen van dit protocol is de toevoeging en verwijdering van de oplossing kristalviolet kleuring. Deze stappen moeten zeer zorgvuldig worden uitgevoerd om niet-specifieke kleuring te voorkomen (bijvoorbeeld vanwege druppels vlek op de wanden van de putjes). Een van de belangrijkste voordelen van het gebruik Resazurin als initiële kleuring test is het feit dat het niet-toxisch voor de cellen, die het gebruik van dezelfde dienblad kristalviolet kleuring maakt. De combinatie van beide assays aanzienlijk vereenvoudigt de workflow, verlaagt de kosten, bespaart consumables en minimaliseert het gebruik van de testverbindingen, die bijzonder waardevol in een screening omgeving.
Zoals eerder aangegeven, de zelf geproduceerde extracellulaire polysaccharide matrix is een essentieel onderdeel van biofilms. Het matrixgehalte (Van bijzonder belang polysacchariden) te meten, werd een derde assay hier opgenomen, op basis van fluorescentie-gemerkte WGA. Oorspronkelijk WGA kwantificering werd beschreven als een enzymgekoppelde lectine-Assay (Ella) 24. Een soortgelijke test gebaseerd op kleuring glycosaminoglycanen (GAG's) in de matrix van S. aureus biofilms met dimethylmethyleen blauw (DMMB) is ook gebruikt 31,34. GAG's zijn vergelijkbaar met de polysaccharide intercellulaire adhesinen (PIA) in de matrix van Staphylococcus spp. biofilms 35. De WGA-assay eveneens targets PIA, maar WGA meer specifiek bindt aan N-acetyl-glucosamine residuen, die een essentiële rol spelen bij de biofilm matrix 36 <poly-/ Sup>. Gericht op de matrix van groot belang vanwege het feit dat biofilms gemakkelijk kunnen aangroeien wanneer de matrix overblijft na een chemische of antibiotische behandeling. Bacteriën kunnen ook gemakkelijker hechten aan een oppervlak dat matrix voorbekleed 35. Het is aangetoond dat sommige antibiotica effectief kunnen verlagen de levensvatbaarheid en biofilm biomassa, maar zonder effect op de matrix. In onze experimenten, wordt dit toegelicht door het geval van ciprofloxacine 31. Antibiotica kan zelfs een toename matrixproductie, zoals hier aangetoond penicilline G 26. Gebaseerd op deze veranderingen kunnen antibiotica worden ingedeeld in de in tabel 2 opgesomde categorieën. Alle hits in onze screening studies (figuur 2) kunnen worden ingedeeld, samen met ciprofloxacine, als verbindingen die de bacteriën in de biofilm te doden en de biomassa te verminderen, maar niet uit elkaar te halen of verstoren van de biofilm matrix.
| Categorie | Effect op bacteriën | Effect op de matrix | Voorbeeld antibioticum (target biofilm) | Referentie |
| 1 | geen | geen | ampicilline (SA) | (Toté et al. 2009) |
| 2 | geen | - | cefalotine (SA) | (Toté et al. 2009) |
| 3 | - | geen | polymyxine (SA) | (Toté et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamycine (PA) | (Toté et al. 2009) |
| ciprofloxacine (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxycycline (PA) | (Toté et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicilline G (SA, EC) | (Skogman et al. 2012) |
Tabel 2: Classificatie van antibiotica. De antibiotica worden ingedeeld in categorieën op basis van hun effect op de levensvatbaarheid van de biofilm bacteriën (met resazurin kleuring) en de matrix (met WGA of dimethylmethyleen blauw (DMMB) kleuring). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EG: Escherichia coli. Gewijzigd ten opzichte van Toté et al. 31
Bovendien is dit platform is ideaal voor het uitvoeren van de primaire screening campagnes. De meest kosteneffectieve en tijd-effectieve strategie is om resazurin en kristal-violet gebaseerde testen toe te passen als een eerste-tier-strategie en om verder te gaan naar de WGA-matrix test in tweede echelon (follow-up) studies. Dit komt door het feit dat de WGA probe is nogal duur en dat deze assay uit verschillende stappen bestaat, waardoor het omslachtig en tijdrovend maakt.
Een relevante functie van dit platform is het mogelijk om de lange termijn van de geïdentificeerde antimicrobiële evalueren. Langdurige chemotherapeutische effecten kunnen alleen worden bereikt als de biofilm matrix wordt gedemonteerd. Het is aangetoond dat het risico van reanimatie van de biofilm infectie is veel hoger wanneer de matrix wordt achtergelaten. Dit platform is het mogelijk om eerst beoordelen of de totale biofilm biomassa wordt beïnvloed middels kristalviolet kleuring. Een dEDETAILLEERDE beoordeling van de biofilm matrix Polysacchariden, met de WGA assay kan volgen. Van de nota, de kans op het identificeren van een enkel molecuul dat zowel kan demonteren de matrix en oefenen antibacteriële (biociden) effecten kunnen zo laag worden beschouwd. Inderdaad, tot nu toe de enige verbindingen van dit type die we hebben geïdentificeerd antimicrobiële peptiden zijn 37. Om dit aan te pakken, worden follow-ups uitgevoerd in dit platform met ofwel resazurin- of crystal violet-actieve hits, omdat deze strategie de identificatie van verbindingen met aparte biocide of matrix-afbrekende activiteit mogelijk maakt. Dergelijke leads kan potentieel interessant voor multi-component strategieën. Een combinatie van matrix-afbrekende moleculen met biocidale of antibiotische-achtige verbindingen wordt verwacht efficiënter biofilm uitroeiing verschaffen.
Kortom, het platform hier gepresenteerde biedt een goede basis voor anti-biofilm screening met de levensvatbaarheid en biomassa metingen samen met matrix kwantificeringcatie en visualisatie. Zowel de Resazurin en kristalviolet kleuring assays kunnen ook worden gebruikt voor andere soorten biofilm- vorming van micro-organismen. Echter, deze testen vereisen afzonderlijke optimalisatie voor zowel groeiende als kleuring omstandigheden. De toepasbaarheid van de WGA kleuring assay beperkt tot die bacteriën waarin het poly-N-acetyl-glucosamine is een hoofdbestanddeel van de biofilm matrix. Andere matrix kwantificering assays (zoals die gebaseerd op dimethyl-methyleen blauw kleuring) kunnen worden toegepast in andere gevallen. Al met al, de analyses in dit platform zijn vrij eenvoudig uit te voeren, en alle reagentia zijn gemakkelijk beschikbaar, evenals het algemeen betaalbaar. Dit platform is geschikt voor lage tot medium-throughput screening anti-biofilm zonder dure investeringen apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs bedanken professor Paul Cos en LMPH, Universiteit Antwerpen, België voor zijn steun tijdens de opnames proces in zijn laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de Academie van Finland projecten (projecten 272.266 en 282.981) en Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De technische bijdrage van MSc Janni Kujala worden erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
