Abstract
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つと考えられている、と彼らは、潜在的に抗生物質耐性の感染症の80％を担っています。バイオフィルムは、多因子性であると考えられている化学療法に対する非常に高い耐性を示しています。例えば、マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。そう、バイオフィルムの回復力は、これらおよび他の、未知の機構の組み合わせから生じます。現在、既存の抗生物質の全ては、単一細胞（浮遊性）細菌に対して開発されてきました。そのため、これまでのところ、分子の非常に限られたレパートリーは、それが選択的に成熟したバイオフィルムに作用することができる存在します。この状況は、抗バイオフィルムのための検索は、より目立つ場所を占めるように促しされた薬物の発見における漸進的パラダイムシフトを、推進してきました。追加の課題があるということですバイオフィルム研究のための標準化された方法、化学ライブラリーの大スループットスクリーニングのために使用することができる特に、非常に限られた数。ここでは、化学物質のスクリーニングのための実験的な抗バイオフィルムのプラットフォームが提供されます。それは、（レサズリン染色）バイオフィルムの生存率を測定するための3つのアッセイを使用しています（クリスタルバイオレット染色）総バイオマス、およびバイオフィルムマトリックス（ポリN -アセチルグルコサミンのコムギ胚芽凝集素を使用して、WGA-蛍光ベースの染色、PNAG 、分数）。すべてのアッセイは、モデル菌として黄色ブドウ球菌を使って開発されました。プラットフォームは、一次スクリーニングのために、ならびに同定された抗バイオフィルムヒットの機能的特徴付けのために使用することができる方法の例が示されています。この実験的なシーケンスは、さらに測定のエンドポイントに基づいて、ヒットの分類を可能にします。また、特に短期化学療法の効果に対する長期的に、それらの作用モードの情報を提供します。したがって、それは非常にアドバです様々な生物医学的応用のための出発点として機能することができ、高品質のヒット化合物の迅速な同定のためのntageous。
Introduction
細菌はバイオフィルムは、最も一般的な例となっている2つの非常に異なる生活様式、プランクトンや固着、切り替えることができます。バイオフィルムでは、細菌はセルフプロデュースマトリックス1に埋め込まれた構造化されたコミュニティを形成します。この自己生産マトリックスは、細菌とその外部環境との間の障壁であり、それは近接してそれらを維持する、微生物細胞を保護します。バイオフィルムマトリックスの組成物は、間にあっても種内で変化するが、それは主にリポ多糖、細胞外DNA、およびタンパク質の緊密なネットワークで構成されています。マトリックスは、有害物質の進入を阻害する物理的障壁として働くが、それはまた、脱水からバイオフィルムを保護し、セル2から逃げるの栄養素を防ぐことができます。
バイオフィルムは、現代の生物医学の最も困難な課題の一つとみなされ、それらは、抗生物質耐性の感染症3の80％以上のためのうわさによれば、責任があります。彼らは、DISP湿度、浸透圧、機械的ストレス4、熱、UV照射5、殺菌剤、抗菌剤、および宿主免疫系1：外部の脅威から本質的に高い耐性を築きます。例えば、バイオフィルムを殺すために必要な必要な抗菌剤の濃度は、浮遊細菌を死滅させるために必要なものと比較して最大で1000倍高いことが示されています。この高い耐性についての説明は、多因子であると思われます。マトリックスは、バイオフィルムへの抗生物質の浸透を減少させる物理的なバリアを提供します。また、バイオフィルム内の細胞は、表現型が多様です。それらが原因のバイオフィルム6の内側と外側の部分との間の酸素、栄養素、および代謝産物の既存の勾配に異なる代謝状態間の遷移します。したがって、このようなコアのようないくつかのバイオフィルム領域において、細菌は、酸素と栄養を奪われていると代謝活性の低いまたは完全に休止状態に住んでいます
methodologからiCalの斜視バイオフィルム法の限られた数だけが、標準化団体、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングに適用特ににより開発されているように、追加の課題が存在します。 （唯一の1つの例外を除いて）すべての標準化されたアッセイは、バイオフィルムリアクターに基づいて、これらの方法は、通常、初期の治験段階9-12中は利用できません大きな作業量と試験すべき化合物を大量に必要としています。唯一の既存の標準化されたスクリーニング-適用アッセイは、市販の最小バイオフィルム排除濃度（MBEC）システムは13-15を開発された、いわゆるカルガリーバイオフィルムデバイス、です。しかし、このアッセイの制限は、バイオフィルムは、ペグ上に成長しており、すべての細菌種または同じ種内でも株はないが、この装置にバイオフィルムを形成することができるということです。また、特に、天然化合物の探索にも適用することができる方法であります必要に応じて。天然物は、前世紀16以上の抗菌薬の発見の革新のための主要な源となっています。彼らはまた、存続細胞に対して有効であることができるユニークな作用機序を有する新規抗バイオフィルム化合物を提供することができます。このように、自然と自然にインスピレーションを得たライブラリの探査は、有望な、ユニークな抗バイオフィルムリードを製造する高い可能性を持っています。
ここでは、 黄色ブドウ球菌のバイオフィルムの生存率、総バイオマス、およびマトリックスに対する効果を測定するための3つのアッセイを用いて、抗バイオフィルム化合物の化学的スクリーニングのために開発されたアッセイのプラットフォームの実験の詳細を提示します。第一のアッセイは、バイオフィルムの生存率を測定し、それはレザズリン染色に基づいています。レサズリンは、その酸化状態にある青と非蛍光であり、細菌の代謝活性によって減少するとき、ピンク、蛍光性の高いレゾルフィンになるレドックス染色です。これは非常にシンプルかつ高速メートルです一次スクリーニング17-20に適しethod。クリスタルバイオレット染色に基づく第2のアッセイは、全バイオフィルムの質量を測定します。クリスタルバイオレットは、バイオフィルム19,21-23中の細菌や細菌を研究するために広く使用されている染色です。アッセイは、安価な試薬に基づいており、単純な吸光度エンドポイント測定値を有しています。最後に、第3のアッセイは、ブドウ球菌のバイオフィルム24のマトリクス中に存在するN-アセチルグルコサミン残基（PNAG）をポリ-するために特異的に結合するコムギ胚芽凝集素（WGA）を介して細胞外高分子物質（EPS）バイオフィルムの-マトリックスを対象としています。 WGAは、蛍光強度リーダ25を用いて検出することができるフルオロフォアとコンジュゲートされています。ここでは、我々はアプリケーションの例を含め、開発プラットフォームの根拠と詳細を提示します。
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Protocol
1.細菌の成長
- 一晩振とうを220rpm（16-18時間）と37℃でのトリプシン大豆ブロス（TSB）で前培養菌。
- 光（新鮮なTSBに、（ここでは、1000倍の黄色ブドウ球菌のために使用された細菌の増殖速度に依存する）及び指数増殖に達するために、それは37℃、200rpmで成長させて前培養100〜1,000倍に希釈0.2と0.6）の間の595nm（OD 595）での濃度。
注：このステップは、株特異的な最適化を必要とします。
2.バイオフィルム形成：前後の暴露
- （これはミリリットル当たり約10 6コロニー形成単位（CFU / ml）を等しい）指数関数的に増殖させた培養液100倍に希釈します。
- 前露光プロトコル
- 未処理の対照サンプルについては、滅菌96マイクロウェルプレートのウェルあたり希釈した細菌培養液200μlを追加します。
- 試験化合物またはコントロールの4μLを追加抗生物質（50倍ストック溶液）とウェルあたり希釈した細菌培養物の196μlの。
- 18時間200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。
- 露光後のプロトコル
- すべてのサンプルについては、滅菌96マイクロウェルプレートのウェルあたり希釈した細菌培養液200μlを追加します。
- 18時間200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。 - マルチチャンネルピペットを使用して、バイオフィルムに触れることなく、慎重に全体プランクトンソリューションを削除します。
- 試験化合物または対照抗生物質（50×ストック溶液）とウェル当たりTSBの196μlと4μLを加えます。
- さらに24時間、200rpmでプレートシェーカー上で37℃でそれをインキュベートします。
注：ここでは、2ミリメートル軌道でシェーカーを使用しています。
3.レサズリン染色Protocoバイオフィルムの生存率評価のためのリットル
- 滅菌PBS中0.1mg / mlのレサズリン（0.4ミリモル）のストック溶液を準備します。 、滅菌この株式を保持し、露光から保護し、そして4℃で。
- 20μMの最終濃度を達成するために、無菌のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）でレサズリンストック1:50に希釈します。
- マルチチャンネルピペットを用いて、別々の、きれいな96ウェルプレートに、バイオフィルムを触れたり、気泡を作成せずに、慎重に（ウェル中のバイオフィルムを残して）全体プランクトンソリューションを転送します。
- ウェルあたり200μLを添加することにより、滅菌PBSで一度バイオフィルムを洗浄し、そして慎重にマルチチャンネルピペットを使用して、それを削除してください。
- マルチチャンネルピペットを用いて、バイオフィルムプレートのウェルあたり希釈レサズリンの200μLを加えます。
- 未処理のバイオフィルムコントロールが均等にピンク色になるまで約20分間振とうし、室温（RT）、および200 rpmで、暗闇の中でそれをインキュベートします。
- で蛍光を測定しますEXC = 560 nmおよびλEMがプレートリーダー（トップリーディング）と590 nmのを=λ。
ステップ3のように同じプレートを使用したバイオフィルムのバイオマスの定量化のための4クリスタルバイオレット染色プロトコール
- マルチチャンネルピペットを用いて、ウェルから慎重にレサズリンの汚れを取り除きます。
- 15分間のメタノール200μlでバイオフィルムを固定してください。
- 10分間のプレートの空気が乾燥してみましょう。
- 慎重にマルチチャンネルピペットを使用して、クリスタルバイオレット溶液（体積/体積、脱イオン水で希釈した）0.02％の190μLを加えます。ピペッティングしながら染色でウェルの側面に触れないようにしてください、ブローアウトを完了するために、ピペットを押していないことにより、気泡の形成を防止します。
- RTで5分間それをインキュベートします。
- マルチチャンネルピペットを使用して、慎重に汚れを除去します。
- 脱イオン水（各時間μlの200）で2回、それを洗ってください。
- ウェルを室温で5分間乾かし、残りの汚れを溶解96％エタノールまたは33％の酢酸です。
- RTで1時間のためにそれをインキュベートし、595nmで吸光度を読み取ります。
5.バイオフィルムと同様のサンプルプレートを使用した浮遊性細菌の殺菌効果の評価
- 3.3から浮遊性溶液を用いて、プレートの595nmでの濁度を測定します。
- ウェル当たりレサズリンの株式の10μLを添加することにより、レサズリンと浮遊性細菌を染色。ピペッティングでよく混ぜます。
- 未処理のコントロールが均等にピンクになるまで、約5分間、室温で暗闇の中でそれをインキュベートします。
- λEXC = 560nmで蛍光を測定し、λEMが 590 nmのを=。
マトリックス定量化とバイオフィルムの蛍光顕微鏡イメージングのための6コムギ胚芽凝集素染色
- 行列の定量化
- 滅菌PBS中のWGAプローブの5μg/ mlの溶液を調製します。
- 並列サンプルナンプラーを使用しますこの染色のためのテ。井戸からプランクトン溶液を除去し、慎重にバイオフィルムを触れることなく、マルチチャンネルピペットを使用して、無菌PBS（ウェル当たり200μlの）で1回洗浄します。
- 染色するウェル当たりWGA溶液200μlを追加します。
- 2時間4℃で暗闇の中でそれをインキュベートします。
- PBS200μlの3回でウェルを洗浄することにより未結合の汚れを取り除きます。
- RTで15分間プレートを乾燥させてください。
- ウェルあたり200μlのを使用して、33％酢酸中で結合した汚れを溶解します。
- ストリップキャップでウェルを密閉し、室温で30秒、40 kHzのための水浴超音波処理を使用してそれらを超音波処理します。
- 室温で1時間静置します。
- 超音波処理の手順を繰り返します。ウェルは、超音波処理工程の間に封入されたままにすることができます。
- λの元 = 495 nmで蛍光を測定し、λEMプレートリーダー（トップリーディング）と520 nmのを=。
- マトリックスとの可視化蛍光顕微鏡検査法
- ステップ6.1.6まで上記と同じプロトコルを使用してください。
- 乾燥工程の後、FITCフィルター（または別の適切な緑色励起フィルタ）を用いて、蛍光顕微鏡を用いて試料を可視化。
蛍光顕微鏡およびシグナルの定量化とイメージングのためのバイオフィルム内の7染色生存細胞と死細胞のグリーン・ツー・赤比（G / R）のための
- 蛍光顕微鏡でのイメージング
- メーカーのガイドラインに従って、各プローブ（1染色生存細胞および他の1染色死細胞）の溶液を調製します。
- 井戸からプランクトン溶液を除去し、マルチチャンネルピペットを用いて、無菌PBS（ウェル当たり200μlの）で1回洗浄します。
- ウェル当たりの染色液の6μlを添加します。
- 15分間、暗闇の中でプレートをインキュベートします。
- 顕微鏡検査の前に、余分な液体mを削除しますanuallyマルチチャンネルピペットを使用して。
- 例えば、FITCフィルター（緑色蛍光のために、生細胞）またはTRITCフィルター（赤色蛍光、死細胞）を用いて、蛍光顕微鏡を用いて画像を捕捉します。
- 緑色〜赤色蛍光比（G / R）のようなシグナルの定量化
- ステップ7.1.1と7.1.2と同じプロトコルに従ってください。
- ウェル当たりの染色溶液200μlを加え、暗所で15分間、それらをインキュベートします。
- 励起/発光波長の緑色と赤色蛍光のための535分の485 nmおよび635分の485、それぞれ（上読み）でプレートリーダーで蛍光を測定します。
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Representative Results
提案されたプラットフォームでは、生存力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスへの影響を定量化しています。作業配列（ 図1）においては、一つのサンプルプレートを同時に細菌性バイオフィルムの生存率に、全バイオフィルムのバイオマスへの影響を評価するためにクリスタルバイオレットでレサズリンと、続いて染色します。それはレサズリンとの最初の染色は、クリスタルバイオレットプレートの間の最大信号の吸光度単位の比較のためにクリスタルバイオレット染色結果の統計的に有意な影響（p = 0.4149で別々に染色したことが以前に実証されたので、両方のアッセイは、同じプレートで連続して行うことができ、または染色をレサズリンした後、N = 20）26。浮遊性細菌に対する効果を同時に評価することができます。
ヒットは生存能力やバイオマスベースのアッセイのいずれかから識別されると、第2のプレートがstがありますバイオフィルムマトリックスの多糖成分（PNAG）に対する化合物の効果を定量化するWGAプローブとained。以下に例示するように、このワークフローは、ヒット化合物の効力を測定するための化学ライブラリーのスクリーニング、並びに機能的フォローアップ研究に適用することができます。
図1：3- アッセイプラットフォームのワークフロー。バイオフィルム試料について3つのアッセイを組み合わせたワークフローの概略図。プラットフォームは生存力、バイオマス、およびEPS層への影響についての染色を含み、蛍光顕微鏡を用いた撮像、そして、プランクトン相への影響を評価します。 「A」と「NA」は「アクティブでない」「アクティブ」と、それぞれのために立っています。 Skogman らから変更。 26JPG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
スクリーニング目的のための3つのアッセイプラットフォームのパフォーマンス
ここでは、2つのスクリーニングの実行プラットフォームの性能の代表的な結果として示されています。最初のキャンペーン（ 図2A）では、キナアルカロイド誘導体の小さなライブラリは、 黄色ブドウ球菌に対する抗バイオフィルム活性についてスクリーニングしたが、27のバイオフィルム一方、第2の例（ 図2B）、アビエタン型の自然と自然にインスピレーションを得たライブラリーでジテルペノイドおよび誘導体は28,29を調査しました。アクティブヒットは、算出したヒット限界（;式6、 表1の閾値）を用いて測定しました。各スクリーニング研究では、最初の2つのアッセイの結果は非常によく相関し;ヒットはすべてwは、生存率およびバイオフィルムのバイオマスを削減することができましたhileは、不活性化合物は、いずれかのアッセイには影響を示しませんでした。すべての識別されたヒットは、第3（WGA）アッセイで試験したが、彼らは何のマトリックス分解（またはマトリックス分解）の効果（結果は示されていない）を有していませんでした。
図2： 黄色ブドウ球菌の バイオフィルム とプラットフォームを用いたスクリーニングキャンペーンの代表的な結果 。概念実証の検証画面の2つの例は、アッセイプラットフォームを用いて行きました。結果は、ヒット化合物は赤色で表示され、未処理のバイオフィルム対照のパーセントとして提示され、そしてラインが計算されたヒットの制限を表します。 （A）キナアルカロイド誘導体のライブラリーのスクリーニングは、一つの活性化合物を同定しました。 （B）5行為を特定しアビエタン型ジテルペノイドおよび誘導体のライブラリーのスクリーニングアイブ化合物。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フォローアップ研究のための3つのアッセイプラットフォームのパフォーマンス
代表的な結果は、2つの既知の抗生物質は、 黄色ブドウ球菌バイオフィルムに対する濃度の非常に広い範囲（0.5 NM-5ミリモル）で試験した。 図3に見ることができます。プランクトン細菌に対する参照化合物（いずれかの文献から、または実験室で行われる）の最小発育阻止濃度（MIC）の値は、同じ種のバイオフィルムの検査の濃度を選択するための指針として役立ちます。さらに、細胞毒性は、哺乳動物細胞において検出されなかった濃度値の知識はまた、抗バイオフィルムのフォローアップのためにテストする濃度の選択を助けることができます。理想的には、特定の化合物の両方に抗菌および細胞毒性データが利用可能である場合ミュラーとクレイマー30で定義されているように、「生体適合性指数」（BI）として知られているパラメータは、計算することができます。ここでは、ペニシリンG、およびシプロフロキサシンのためのプランクトン黄色ブドウ球菌に対するMIC値は、それぞれ0.04μMおよび6μMであると決定された（結果は示さず）。このように、濃度の間隔はそれぞれ、約10 5×MICから10 -2のx MICおよびペニシリンやシプロフロキサシンのために10 3×MIC〜10 -4のx MICの範囲でした。それらは、バイオフィルム形成工程（ 図3a）の開始前に単細胞細菌にさらされたとき、両方の抗生物質が著しく生存能力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスPNAG含量を減少させる可能性があります。しかし、予め形成された（18時間）バイオフィルム上で試験抗生物質の非常に高い濃度にもかかわらず、生存率およびバイオマスのみトンの約50％に減少しました。未処理のバイオフィルムのホース（ 図3b）。最も顕著な結果は、ここに予め形成されたバイオフィルムは、予め形成されたバイオフィルムは、シプロフロキサシンで処理した場合のバイオフィルムマトリックスの内容に変化が検出されなかったペニシリンGの高濃度で処理した（200％以上）は、バイオフィルムマトリックスの増加となりました。
図3： 黄色ブドウ球菌の バイオフィルム に対する2つのモデルの抗生物質を使用して、抗バイオフィルム効果のフォローアップ調査の例 。ペニシリンGおよびシプロフロキサシンの効果は、ここに提示されている：（A）は、従来のバイオフィルム形成（露光前）および（B）後のバイオフィルム形成（後露光）。フィギュア明確にするために、唯一の最低および試験した最高濃度が示されています。標準偏差は20％を超えません。 *** EQUALSてp <0.01。 Skogman らから変更。 26 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
蛍光顕微鏡ベースのイメージング
（ 図3bに示すように、だけでなく、より高い濃度、）結果そのペニシリン400μMでGが予め形成された黄色ブドウ球菌のバイオフィルム細菌集団の約50％は別の生存率染色アッセイで確認した殺します。未処理のバイオフィルムの井戸のための緑〜赤色（G / R）蛍光比の平均が死んだ（赤染色）細胞経由でライブ（緑に染色された）細胞の優位性を示す、2.75でした。しかし、ペニシリン処理した細胞において、G / R比は、対照ウェルの56％に相当する、1.54に減少しました。ペニシリンの治療プロの後に生きて残った細胞未処理のバイオフィルム（ 図4b）と比較して（WGA）の緑色蛍光の検出増加から判断されるように、EPSの有意に高い量を生さ。我々はさらに、特にヒット候補の特性評価の段階で、プラットフォームの結果を確認するために、これらの画像ベースの実験を行うために、可能な限り、お勧めします。
図4： 蛍光顕微鏡。生存率およびEPS産生に対するペニシリンの添加（400μM）の効果は、ここに示されています。トップ画像（A）は、生細胞を染色した緑と死んだ細胞が赤色に染色されている未処理のバイオフィルムおよびペニシリン処理したバイオフィルムに対応しています。挿入されたグラフは、G / Rの蛍光比率の計算を示す図です。下部画像（B）は、未処理のバイオフィルムおよびペニシリンに対応しますWGAプローブで染色した処置された細胞。挿入されたグラフは、処理および未処理のバイオフィルムサンプルのWGAシグナルの定量化を示し、エラーバーは標準偏差を表します。 Skogman らから変更。 26 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
データ処理と統計解析
統計的パラメータは、アッセイの品質を特徴付けることおよびスクリーニングの実行時の性能を追跡するために計算されます。使用される最も重要なパラメータ、ならびに得られた値と目標値の式は、 表1に列挙されています。すべての方程式では、SDの分 、μ 分 、SD 最大 、および最大の μは、最小限の標準偏差と平均を示しますそれぞれ（MIN）および最大（max）の信号。ここに示された結果は、元の値の比較は、p <0.05を統計学的に有意であるとみなしたウェルチの補正で対応のないt検定を用いて行ったペアリング。
表1：アッセイの性能を評価するために使用される統計パラメータ。すべての方程式、SDの分 、μ 分 、SD 最大 、および最大の μはそれぞれ、最小限の（分）と最大（max）の信号の標準偏差および平均を示します。染色法、レサズリン、クリスタルバイオレット、およびコムギ胚芽凝集素は、それぞれ、RES、のCrV、およびWGAと略記されます。 RFU：相対蛍光単位; RAU：相対的な吸光度単位。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
同時に生存力、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスに対する化合物の効果を測定することができる単一の方法はありません。したがって、好ましくは、一次スクリーニング段階で三のエンドポイントへの影響を検出するためのアッセイを組み合わせる必要があります。
レサズリンは、レドックスプローブの添加のみからなる非常に単純な染色プロトコルです。しかし、レサズリンとバイオフィルムの最適なインキュベーション時間を確立することは、このアッセイの成功に不可欠です。他の人にそれが数時間19を最後にすることができますしながら、いくつかの細菌株では、ピンク、蛍光レゾルフィンにレサズリンプローブの減少は、非常に迅速に発生します。また、同じ細菌株内で、また、プランクトン細菌とバイオフィルムとの間に有意な違いがあるかもしれません。浮遊性細菌は、典型的には、より簡単に細菌密度は、バイオフィルムの経口よりもプランクトン集団が低い主な理由は、到達しています反応の速いターンオーバーを促進するpulations、。バイオフィルムの生存率染色プローブの公開された比較では、レサズリンが最も正確な使用が簡単で、かつ最も安価なアッセイ19の一つであると結論されました。また、細菌および真菌生物19の範囲に適用可能であることが示されています。一方、クリスタルバイオレットアッセイは、バイオフィルム塊定量19,32,33のために最も広く使用されています。このプロトコルの最も重要なステップは、クリスタルバイオレット染色溶液の添加及び除去です。これらのステップは、（ウェルの壁の汚れの滴に起因する例えば、）非特異的な染色を避けるために非常に慎重に行われなければなりません。最初の染色アッセイとしてレサズリン使用の主な利点の1つは、クリスタルバイオレット染色のために、同じプレートの使用を可能にする細胞に対して非毒性であるという事実です。両方のアッセイの組み合わせが大幅に、ワークフローを簡素化し、コストを下げ、は消耗品を節約しますABLES、スクリーニング環境において特に有益である、試験化合物の使用を最小限に抑えます。
先に示したように、自己生産細胞外多糖マトリックスは、バイオフィルムの必須成分です。行列のコンテンツ（特に必須の多糖類）を測定するために、第三のアッセイは、蛍光標識したWGAに基づいて、ここに含まれていました。元々 WGA定量は、酵素結合レクチン吸着アッセイ（ELLA）24として説明しました。ジメチルメチレンブルー（DMMB）と黄色ブドウ球菌のバイオフィルムのマトリックス中にグリコサミノグリカン（GAG）を染色に基づいて、同様のアッセイはまた、31,34使用されています 。 GAGはブドウ球菌属の行列に見られる多糖類細胞間アドヘシン（PIA）が類似しています。バイオフィルム35。 WGA-アッセイ同様にターゲットのPIAが、WGAは、より具体的には<バイオフィルムマトリックス36に不可欠な役割を果たしているN -アセチルグルコサミン残基を、ポリ-に結合します/ SUP>。行列を標的にすることにより、マトリックスは、化学的または抗生物質治療後に残っている場合は、バイオフィルムを簡単に再生することができるという事実に非常に重要です。細菌はまた、より簡単に行列が35を予め被覆された表面に付着することができます。いくつかの抗生物質が効果的に生存率およびバイオフィルムのバイオマスを低下させることができることを示したが、行列に影響せずにされています。我々の実験では、これは、シプロフロキサシン31の場合が例示されます。ペニシリンG 26とここに示されたように、いくつかの抗生物質があっても、マトリックス産生を増加させることができます。これらの変化に基づいて、抗生物質は、 表2に示すカテゴリに分類することができます。私たちのスクリーニング研究のすべてのヒット（ 図2）は 、バイオフィルム内の細菌を死滅させる化合物として、一緒にシプロフロキサシンと、分類およびバイオマスを減少させるが、バイオフィルムのマトリックスを分解したり、中断しないことができます。
| カテゴリー | 細菌への影響 | マトリックスへの影響 | 例の抗生物質（ターゲットバイオフィルム） | 参照 |
| 1 | なし | なし | アンピシリン（SA） | （トートら 2009） |
| 2 | なし | - | セファロチン（SA） | （トートら 2009） |
| 3 | - | なし | ポリミキシン（SA） | （トートら 2009） |
| 4 | - | - | カナマイシン（PA） | （トートら 2009） |
| シプロフロキサシン（SA） | （Skogman ら 2012） | |||
| 5 | - （+） | - | ドキシサイクリン（PA） | （トートら 2009） |
| 6 | - | + | ペニシリンG（SA、EC） | （Skogman ら 2012） |
表2： 抗生物質の分類。抗生物質は（レザズリン染色を用いて）バイオフィルム細菌および（WGAまたはジメチルメチレンブルー（DMMB）染色を用いて）行列の生存率に及ぼす影響に基づいてカテゴリに分類されます。 SA： 黄色ブドウ球菌 ; PA： 緑膿菌 ; EC： 大腸菌 。トートらから変更。 31
さらに、このプラットフォームは、一次スクリーニングのキャンペーンを実施するための理想的です。最もコストと時間の効果的な戦略は、最初の層の戦略としてレサズリン、クリスタルバイオレットベースアッセイを適用し、第二層（フォローアップ）の研究でWGA-マトリックスアッセイに移動することです。これは、WGAプローブはかなり高価であるという事実によるものであり、このアッセイは、より面倒で時間がかかるなりれ、いくつかのステップからなること。
このプラットフォームの関連する特徴は、識別された抗菌剤の長期的効果を評価する可能性です。バイオフィルムマトリックスが分解された場合、長期の化学療法の効果は、達成することができます。マトリックスが残されている場合、バイオフィルム感染の蘇生の危険性がはるかに高いことが示されています。このプラットフォームにより、全体的なバイオフィルムのバイオマスは、クリスタルバイオレット染色を使用して影響を受けている場合、最初に評価することが可能です。以上のDWGAアッセイを使用して、バイオフィルムマトリックス多糖類の評価をetailed、従うことができます。注目すべきは、マトリックスを分解し、抗菌（殺生）の効果を発揮することができる両方の単一分子を同定する可能性は低いとみなすことができます。確かに、これまで、我々が同定したこのタイプの唯一の化合物は、抗菌性ペプチド37です。この戦略は、別の殺生またはマトリックス分解活性を有する化合物の同定を可能にするため、これに対処するために、フォローアップは、resazurin-またはクリスタルバイオレットアクティブヒットのいずれかで、このプラットフォームで実行されています。このようなリードは多成分戦略のための潜在的に興味深いものになることができます。殺菌または抗生物質型化合物とマトリックス分解分子の組み合わせは、より効率的なバイオフィルムの根絶をもたらすことが期待されます。
要約すると、ここで提示プラットフォームは、行列quantifiとともに生存率およびバイオマスの測定値を用いて、抗バイオフィルムのスクリーニングのための良好な基礎を提供しますカチオンと可視化。両方のレサズリン及びクリスタルバイオレット染色アッセイはまた、バイオフィルム形成微生物の他の種類のために使用することができます。しかし、これらのアッセイは、成長および染色条件の両方に別々の最適化を必要とします。 WGA染色アッセイの適用は、ポリN -アセチルグルコサミンは、バイオフィルムマトリックスの主要成分であるこれらの細菌に限定されています。 （例えば、ジメチルメチレンブルー染色に基づくもののような）他のマトリックス定量アッセイは、他の場合にも適用することができます。要するに、このプラットフォームでのアッセイは、実行するのはかなり容易であり、全ての試薬は容易に入手可能と同様に、一般的に手頃な価格です。このプラットフォームは、高価な設備投資を必要とせずに、中スループット抗バイオフィルムスクリーニングに低に適しています。
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Acknowledgments
著者は、彼の研究室での撮影プロセスの間に彼のサポートのための教授ポールコスとLMPH、アントワープ大学、ベルギーに感謝します。この作品は、フィンランドのプロジェクトアカデミー（272266と282981を投影）とスヴェンスカTekniska Vetenskapsakademien私フィンランドによって賄われていました。修士課程Janniクジャラの技術的な貢献が認められています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
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