Abstract
바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 잠재적으로 항생제 내성 감염의 80 %에 대한 책임이 있습니다. 바이오 필름은 인성 생각된다 화학 요법에 대한 매우 높은 공차를 표시하고있다. 예를 들어, 행렬은 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 생물막 내에서 세포 표현형 다양하다. 가능성, 생물막 탄력성이와 다른, 아직 알려지지 않은 메커니즘의 조합에서 발생한다. 현재 기존 항생제 모두 단일 세포 (플랑크톤) 박테리아에 대해 개발되어왔다. 따라서, 지금까지 분자의 매우 제한된 레퍼토리는 선택적 성숙한 생물막에 작용할 수있는. 이러한 상황은 방지 생물막에 대한 검색이 더 눈에 띄는 자리를 차지하도록 촉구되어있는 신약 개발의 진보적 인 패러다임의 변화를 주도하고있다. 추가 과제는이 때문이다매우 생물막 연구를위한 표준화 된 방법, 화학 라이브러리의 대규모 스크리닝에 사용될 수있는 특히 수를 제한했다. 여기, 화학 검사에 대한 실험 안티 바이오 필름 플랫폼이 제공됩니다. 폴리 N의 아세틸 글루코사민, PNAG의 그것은 밀 배아 응집소를 사용하여 생물막 (레사 주린 염색과) 가능성, (크리스탈 바이올렛 염색) 총 바이오 매스 및 바이오 필름 매트릭스 (측정하는 세 가지 분석을 사용 WGA-형광 기반의 염색 , 분수). 모든 분석은 모델 박테리아 포도상 구균을 사용하여 개발 하였다. 플랫폼 일차 스크리닝뿐만 아니라 식별 항 생물막 히트 기능적 특성화에 사용될 수있는 방법의 예를 제시한다. 이 실험 순서는 또한 측정 된 엔드 포인트에 기초하여 히트 분류 할 수 있습니다. 또한 특히 단기 화학 요법의 효과에 비해 장기에, 행동의 자신의 모드에 대한 정보를 제공합니다. 따라서, 매우 ADVA은다양한 생명 의학 애플리케이션을위한 출발점을 제공 할 수 고품질의 히트 화합물의 빠른 식별을위한 ntageous.
Introduction
박테리아는 생물막이 가장 일반적인 예입니다있는 두 개의 매우 다른 생활 양식, 플랑크톤 및 정착, 사이를 전환 할 수 있습니다. 생물막에서 세균은 자체 제작 매트릭스 1에 포함 된 구조화 된 사회를 형성한다. 이 자동 생성 행렬은 세균 및 외부 환경 사이에 장벽이며, 근접을 유지하면서 균체를 보호한다. 생물막 매트릭스의 조성 사이에도 종 내에서 변화하지만, 대부분은 리포 폴리 사카 라이드, 세포 DNA와 단백질의 긴밀한 네트워크로 구성된다. 행렬은 유해한 제제의 입사를 억제하는 물리 장벽으로서 역할뿐만 아니라 탈수 생물막을 보호하고, 전지 (2)을 빠져 나가는 영양분을 방지한다.
바이오 필름은 현대 생물 의약의 가장 도전적인 주제 중 하나로 간주되고, 그들은 항생제 내성 감염 (3)의 80 % 이상에 대한 소문에 책임이 있습니다. 그들은 DISP습도, 삼투압, 기계적 응력 4, 열, 자외선 5, 살균제, 항균제, 호스트 면역 체계 1 : 외부 위협에 대한 본질적으로 높은 내성을 배치합니다. 예를 들어, 바이오 필름을 죽이기 위해 필요한 필요한 항균제의 농도는 플랑크톤 박테리아를 죽이기 위해 요구되는에 비해 최대 1000 배 높은 것으로 밝혀졌다. 이 높은 허용 오차에 대한 설명은 다 인성 것으로 보인다. 매트릭스는 생물막으로 항생제의 침투를 감소 물리적 장벽을 제공한다. 또한, 바이오 필름 내의 세포 표현형 다양하다; 이들은 의한 바이오 필름 (6)의 내측 및 외측 부분 사이의 산소, 영양소 및 대사 산물의 존재 구배 다른 대사 상태 사이에서 전환. 따라서, 이러한 핵심으로 일부 생물막 지역에서, 박테리아는 산소와 영양분을 박탈되며 대사 덜 활성 또는 완전히 휴면 상태에 살고
methodolog에서생물막 방식에만 한정 표준 제정기구 화학적 라이브러리의 고 - 처리량 스크리닝에 적용 특히 개발 한 것처럼 iCal의 관점 추가적인 어려움이 존재한다. (하나만 제외)의 모든 표준 분석법 생물막 반응기에 기초하여,이 방법은 일반적으로 초기 임상 단계 9-12 동안 사용할 수없는 큰 작동 부피 및 시험 될 화합물의 대용량을 필요로한다. 유일한 기존 표준 스크리닝 적용 분석은 시판 최소 생물막 제거 농도 (MBEC) 시스템이 개발되었다 13-15되는 소위 캘거리 생물막 장치이다. 그러나 이러한 분석의 한계는 생물막이 쐐기 상에 성장되고, 모든 박테리아 종 또는 동일한 종의 균주 내에서조차하지이 장치에 바이오 필름을 형성 할 수 있다는 것이다. 또한, 특히 천연 화합물의 탐색에 적용 할 수있는 방법은필요로했다. 천연 제품은 지난 세기 16 세 이상의 항균 신약 개발의 혁신의 주요 원천이되어왔다. 또한 persister 세포에 효과적 작용 고유 메커니즘 신규 항 생물막 화합물을 제공 할 수있다. 따라서, 자연과 자연에서 영감을 라이브러리의 탐사 유망 독특한 안티 바이오 필름 리드를 생산의 높은 가능성을 가지고있다.
여기서는 포도상 구균 생물막의 생존 총 미생물, 매트릭스에 대한 효과를 측정하기 위하여 세 가지 분석법을 이용하여 항 - 생물막 화합물의 화학적 스크리닝 개발 된 분석법의 플랫폼의 실험 세부 사항을 제시한다. 첫번째 분석은 생물막의 생존 능력을 측정하고,이를 레사 주린 염색에 기초한다. 레사 주린은 산화 된 상태에서 파란색과 비 형광 및 박테리아의 대사 활동에 의해 감소 할 때 핑크, 높은 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 변 산화 환원 얼룩입니다. 그것은 매우 간단하고 빠른 m이다기본 검진 17 ~ 20에 적합 ethod. 두 번째 분석은, 크리스탈 바이올렛 염색을 기준으로 총 생물막 질량을 측정한다. 크리스탈 바이올렛은 바이오 필름 19,21-23에서 세균과 박테리아를 연구하는데 널리 사용되는 얼룩입니다. 상기 분석은 저렴한 시약에 기초한 간단한 흡광도 포인트 판독 갖는다. 마지막으로 세 번째 분석은 포도상 구균 생물막 (24)의 매트릭스에 존재하는 N의 아세틸 글루코사민 잔기 (PNAG)을 폴리 데 특이 적으로 결합 밀 배아 응집소 통해 생물막 (WGA)의 세포 외 고분자 물질 (EPS) -matrix 타겟팅. WGA는 형광 강도 리더 (25)를 사용하여 검출 될 수있는 형광 물질로 접합된다. 우리는 여기에 근거하고 우리는 응용 프로그램의 예를 포함, 개발 플랫폼의 세부 사항을 제시한다.
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Protocol
1. 박테리아 성장
- 사전 문화 (220) rpm으로는 (16 ~ 18 시간)을 흔들어 37 ° C에서 트립신 콩 국물 (TSB)에서 하룻밤 박테리아.
- 신선한 TSB에 (여기에서, 1000 배 S. 구균에 이용되는 박테리아의 성장 속도에 따라) 및 (이 급성장 도달하도록 37 ° C, 200 rpm에서 성장 광하게 예비 배양을 100-1,000 배 희석 0.2 및 0.6) 사이의 595 nm의 (OD 595)에서 밀도.
참고 :이 단계는 균주 별 최적화가 필요합니다.
2. biofilm 형성 : 사전 및 사후 노출
- (이 밀리리터 당 약 106 콜로니 형성 단위 (CFU / ㎖)와 동일)가 기하 급수적으로 성장한 배양 100 배 희석.
- 노광 전 프로토콜
- 처리되지 않은 대조군 샘플의 경우, 멸균 96 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 희석 세균 배양 200 μl를 추가합니다.
- 시험 화합물 또는 제어 4 μl를 추가항생제 (50 배 원액) 잘 당 희석 세균 배양의 196 μL.
- 18 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어.
참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다.
- 노광 프로토콜
- 모든 샘플의 경우, 멸균 96 마이크로 웰 플레이트의 웰 당 희석 세균 배양 200 μl를 추가합니다.
- 18 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어.
참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다. - 멀티 채널 피펫을 사용하여 생물막을 건드리지 않고 조심스럽게 전체 플랑크톤 솔루션을 제거합니다.
- 시험 화합물 또는 제어 항생제 (50 배 원액) 잘 당 TSB 196 ㎕를 4 μl를 추가합니다.
- 추가로 24 시간 동안 200 rpm에서 플레이트 진탕 기에서 37 ° C에서 그것을 품어.
참고 : 여기에 우리가 2mm 궤도와 쉐이커를 사용합니다.
3. 레사 주린 염색 Protoco바이오 필름의 생존 능력 평가를위한 리터
- 멸균 PBS 0.1 ㎎ / ㎖ 레사 주린 (0.4 밀리미터)의 주식 솔루션을 준비합니다. 빛 노출로부터 보호 멸균이 주식을 유지하고, 4 ℃에서.
- 20 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)으로 레사 주린 스톡 1:50 희석.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 별도의 깨끗하고 96 웰 플레이트에, 기포를 생물막을 터치하거나 생성하지 않고 조심 (웰에 생물막을 떠나는) 전체 용액 플랑크톤을 전송.
- 물론 당 200 μl를 추가하여 멸균 PBS로 한 번 생물막을 씻으 조심스럽게 멀티 채널 피펫을 사용하여 제거합니다.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 생물막 플레이트의 웰 당 희석 레사 주린 200 μl를 추가합니다.
- 처리되지 않은 생물막 제어 균등 핑크 때까지 약 20 분 동안 진탕, 실온 (RT), 200 rpm에서, 어둠 속에서 그것을 품어.
- 의 형광을 측정EXC = 560 nm이고, λ 안에 플레이트 리더 (상단 읽기)와 590 nm의 = λ.
4. 크리스탈 바이올렛 염색 의정서는 바이오 필름의 바이오 매스 정량화를위한 3 단계에서와 같은 플레이트를 사용하여
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물에서 조심스럽게 레사 주린 얼룩을 제거합니다.
- 15 분 동안 메탄올 200 μL와 생물막을 수정합니다.
- 10 분 동안 접시에 건조 공기를 보자.
- 신중하게 멀티 채널 피펫을 사용하여, 크리스탈 바이올렛 용액 (탈 이온수에 희석 부피 / 부피) 0.02 %의 190 μl를 추가합니다. 피펫 동안 얼룩 웰의 측면에 손이 닿지 않도록 취출을 완료 피펫을 누르지 않으면 기포의 형성을 방지한다.
- RT에서 5 분 동안 그것을 품어.
- 멀티 채널 피펫을 사용하여 조심스럽게 얼룩을 제거합니다.
- 탈 이온수 (각 시간 μL 200)와 함께 두 번 씻으십시오.
- 우물은 실온에서 5 분간 건조하자 나머지 얼룩을 용해96 % 에탄올 또는 33 % 아세트산이다.
- 실온에서 1 시간 동안 그것을 품어 및 595 nm에서 흡광도를 참조하십시오.
5. 바이오 필름과 동일한 샘플 플레이트를 사용하여 플랑크톤 박테리아에 살균 효과를 평가
- 3.3에서 플랑크톤 솔루션 판의 595 nm에서의 탁도를 측정한다.
- 레사 주린 주식의 10 μl를 첨가 당 잘하여 레사 주린와 플랑크톤 박테리아를 얼룩. 피펫으로 잘 섞는다.
- 처리되지 않은 컨트롤이 고르게 핑크 때까지 약 5 분 동안 실온에서 어둠 속에서 그것을 품어.
- λ의 EXC = 560 nm에서의 형광을 측정하고 λ 안에 590 nm의 =.
매트릭스 정량 및 바이오 필름의 형광 현미경 이미징 6. 밀 배아 응집소 염색
- 매트릭스 정량화
- 멸균 PBS에서 WGA 프로브의 5 μg의 / ㎖ 솔루션을 준비합니다.
- 병렬 샘플 괞 찮아를 사용하여이 염색에 대한 테. 우물에서 플랑크톤 솔루션을 제거하고 조심스럽게 바이오 필름을 건드리지 않고 멀티 채널 피펫을 사용하여, 멸균 PBS (물론 당 200 μL)로 한 번 씻는다.
- 물론이 염색되는 당 WGA 용액 200 μl를 추가합니다.
- 2 시간 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 그것을 품어.
- PBS 3 회 200 μL로 우물을 세척하여 언 바운드 얼룩을 제거합니다.
- 실온에서 15 분 동안 접시를 건조 할 수 있습니다.
- 웰 당 200 μL를 사용하여 33 % 아세트산 바운드 얼룩을 녹인다.
- 스트립 캡 우물을 밀봉하고 실온에서 30 초, 40 kHz에서의 물 목욕 초음파기를 사용하여 초음파 처리.
- 실온에서 1 시간 동안 접시를 품어.
- 초음파 단계를 반복합니다. 웰은 초음파 단계 사이에 밀봉 된 상태로 유지 할 수 있습니다.
- λ의 예 = 495 nm에서의 형광을 측정하고 λ 그들은 플레이트 리더 (상단 읽기)와 520 nm의 =.
- 매트릭스와 시각화형광 현미경
- 단계 6.1.6 때까지 위와 같은 프로토콜을 사용합니다.
- 건조 공정 후, FITC 필터 (또는 다른 적절한 녹색 여기 필터)를 사용하여 형광 현미경으로 샘플을 시각화.
형광 현미경 및 녹색 - 투 - 붉은 비율에 대한 신호의 정량화 (G / R)와 이미징의 바이오 필름 내에서 7. 염색 유력한와 죽은 세포
- 형광 현미경과 영상
- 제조자의 지침에 따라, 각 프로브 (염색 한 생세포 다른 하나 염색 사균)의 용액을 준비한다.
- 우물에서 플랑크톤 솔루션을 제거하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 (물론 당 200 μL) 멸균 PBS로 한번 씻어.
- 물론 당 염색 액의 6 μl를 추가합니다.
- 15 분 동안 어둠 속에서 접시를 품어.
- 현미경 전에 초과 액체 m를 제거anually 멀티 채널 피펫을 사용.
- 인스턴스에 대한 FITC 필터 (녹색 형광 들면 생세포) 또는 TRITC 필터 (적색 형광 사균)를 이용하여 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐.
- 녹색 - 투 - 붉은 형광 비율로 신호의 정량화 (G / R)
- 단계 7.1.1과 7.1.2에서와 동일한 프로토콜을 따르십시오.
- 물론 당 염색 액 200 μl를 추가하고 어둠 속에서 15 분 동안 그들을 품어.
- 여기 / 방출 파장 녹색과 적색 형광을위한 535분의 485 nm의 635분의 485, 각각 (상단 읽기)에서 플레이트 리더로 형광을 측정한다.
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Representative Results
제안 된 플랫폼에서, 생존, 바이오 매스 및 바이오 필름 행렬에 미치는 영향은 정량화된다. 작업 시퀀스 (도 1)에서, 하나의 샘플 플레이트를 동시에 세균 생물막의 생존과 총 생물막 미생물에 대한 영향을 평가하기 위해 크리스탈 바이올렛으로 레사 주린과이어서 염색된다. 이 레사 주린과 제 염색 크리스탈 바이올렛 플레이트 사이의 최대 신호 흡광도 단위의 비교를 위해 크리스탈 바이올렛 염색 결과 (p = 0.4149에 유의 한 효과가 없었다 별도로 염색 이전 것이 입증 되었기 때문에 두 분석은 동일한 플레이트에서 연속으로 수행 될 수있다 레사 주린 - 염색, N = 20) (26) 후. 박테리아 플랑크톤에 대한 영향을 동시에 평가 될 수있다.
안타는 생존 또는 바이오 매스 기반 분석 중 하나에서 발견되는 경우, 두 번째 판은 일입니다 WGA 프로브 ained은 생물막 행렬의 다당류 성분 (PNAG)의 화합물의 효과를 정량화한다. 아래에서 예시 된 바와 같이이 워크 플로뿐만 아니라 히트 화합물의 효능 측정을위한 작용 후속 연구에, 화학 라이브러리의 스크리닝에 적용될 수있다.
그림 1 : 세 분석 플랫폼의 워크 플로우. 바이오 필름 샘플에있는 세 개의 분석을 결합하는 작업 흐름의 도식 표현. 이 플랫폼은 생존, 바이오 매스, 그리고 EPS 층에 영향을위한 염색을 포함한다; 형광 현미경을 사용하여 영상화; 그리고 플랑크톤 상에 미치는 영향을 평가. "A"와 "NA"가 ", 활성되지 않음" "활성"각각의 약자. Skogman 등의 알에서 수정. (26)JPG "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
심사 목적에 대한 3 분석 플랫폼의 성능
여기,이 검사 실행 플랫폼의 성능의 대표적인 결과로 표시됩니다. 제 캠페인 (도 2A)에서, 기나 알카로이드 유도체의 작은 라이브러리는 S. aureus에 대해 안티 생물막 활성에 대해 스크리닝 하였다 27 생물막 동안 두 번째 예 (도 2b) abietane 타입의 천연 및 천연 고무 라이브러리 diterpenoids 및 파생 금융 상품은 28, 29을 탐험했다. 액티브 히트 계산 횟수 제한 (수학 식 6, 표 1 임계 값)을 사용하여 측정 하였다. 각 선별 연구에서, 아주 잘 상관 관계를 처음 두 분석의 결과; 히트는 모든 승, 생존과 생물막 바이오 매스를 줄일 수 있었다하일 비활성 화합물 중 분석에 아무런 영향을 나타내지 않았다. 모든 확인 된 히트 후 세 번째 (WGA) 분석 테스트 있지만 (결과는 도시하지 않음)에는 행렬 분해 (또는 매트릭스 저하) 효과가 있었다 없었다.
그림 2 : 황색 포도상 구균의 바이오 필름과 플랫폼을 사용하여 선별 캠페인의 대표 결과. 개념 증명 확인 화면의 두 가지 예는 상기 분석 플랫폼을 사용하여 수행 하였다. 결과는 처리되지 않은 생물막 제어의 백분율로 제시, 히트 화합물은 빨간색으로 표시하고, 선은 계산 된 히트 한계를 표현하고 있습니다. (A)는 기나 알카로이드 유도체 - 라이브러리의 스크리닝은 하나의 활성 화합물을 확인 하였다. (B) 오 행위를 확인 abietane 형 diterpenoids 및 파생 상품의 라이브러리의 심사필자 화합물. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
후속 연구를위한 3 분석 플랫폼의 성능
대표적인 결과는 두 알려진 항생제 S. aureus에 생물막 대하여 농도의 매우 넓은 범위 (0.5 nm의 5 밀리미터)에서 시험 된도 3에서 볼 수있다. 플랑크톤 세균에 대한 기준 화합물 (어느 문헌이나 실험실에서 수행)의 최소 억제 농도 (MIC) 값은 같은 종의 바이오 필름에 대해 테스트 농도를 선택을위한 가이드 라인 역할을합니다. 또한, 세포 독성은 포유 동물 세포에서 검출되지 않는 농도 값에 대한 지식은 안티 생물막 후속 테스트하는 농도의 선택을 도울 수있다. 이상적으로,특정 화합물을 모두 항균 및 독성 데이터가 사용 가능한 경우 뮐러 크레이머 (30)에 의해 정의 된 바와 같이, "생체 적합성 지수"(BI)로 알려진 파라미터가 계산 될 수있다. 여기에, 페니실린 G 및 시프로플록사신에 대한 플랑크톤 황색 포도상 구균에 대한 MIC 값이 각각 0.04 μM 및 6 μM,로 결정 하였다 (결과는 도시하지 않음). 따라서, 농도 간격은 약 10 5 ×의 MIC에서 10 -2 X MIC 각각 페니실린과 시프로플록사신, 10 3 × MIC -4 10 X의 MIC였다. 이들은 생물막 형성 공정 (도 3a)의 개시 이전에 단일 세포 세균에 노출되었을 때 두 항생제 크게 생존, 바이오 매스 및 생물막 행렬 PNAG 함량을 감소 할 수있다. 그러나, 예비 성형 된 (18 시간) 생물막 테스트에서 항생제의 매우 높은 농도에도 불구하고, 생존 및 바이오 매스는 t의 약 50 %로 감소 하였다치료 생물막 (그림 3b)의 호스. 가장 두드러진 결과는 여기에 미리 형성된 바이오 필름을 미리 형성된 바이오 필름은 시프로플록사신 처리 된 경우 생물막 행렬의 콘텐츠의 어떤 변화가 검출되지 않았다 페니실린 G. 높은 농도로 처리 하였다 (200 % 이상) 생물막 행렬의 증가이다.
그림 3 : 황색 포도상 구균의 바이오 필름에 대해 두 모델 항생제를 사용하여 안티 바이오 필름 효과의 후속 연구의 예. 페니실린 G와 시프로플록사신의 영향 여기에 제시된다 : (A)의 형성 (노광 전) 및 (B) 이후 바이오 필름 형성 (노광)를 생물막 전에. 그림의 명확성을 위해, 단지 가장 낮은 및 테스트 가장 높은 농도를 나타내었다. 표준 편차는 20 %를 초과하지 않습니다. *** 등식LS의 P <0.01. Skogman 등의 알에서 수정. 26 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 현미경 기반 이미징
(도 3b에 도시 된 바와 같이,뿐만 아니라 높은 농도) 결과 해당 페니실린 400 μM에서 G는 예비 성형 S. 구균 세균 생물막 인구의 약 50 %가 생존 다른 염색 분석법으로 확인 하였다 죽인다. 처리되지 않은 생물막 우물에 대한 녹색 - 투 - 빨간색 (G / R) 형광 비율의 평균은 죽은 (빨간색 염색) 세포를 통해 라이브 (녹색 염색) 세포의 우세를 나타내는, 2.75이었다. 그러나, 페니실린 - 처리 된 세포의 G / R 비율은 대조군 웰의 56 %에 해당하는 1.54로 감소되었다. 페니실린 치료 친 후 살아 남은 세포치료 바이오 필름과 비교했을 때 녹색 (WGA) 형광 검출 된 증가에서 (그림 4B)을 판정으로, EPS의 상당히 높은 금액을 선보였. 우리는 또한 특히 히트 후보의 특성의 단계에서, 플랫폼의 결과를 확인하기 위해이 영상 기반의 실험을 수행하기 위해, 가능하면 좋습니다.
그림 4 : 형광 현미경. 생존 및 EPS 생산에 페니실린 추가 (400 μM)의 효과는 여기에 표시됩니다. 상단 이미지 (A)는 가능한 세포가 스테인드 녹색과 죽은 세포가 빨간색으로 염색되어 치료 바이오 필름 및 페니실린 처리 생물막에 해당합니다. 삽입 된 그래프는 G / R 형광 비의 계산을 도시한다. 하단 이미지 (B)은 치료 바이오 필름 및 페니실린에 해당WGA 프로브로 염색 처리 된 세포. 삽입 된 그래프는 처리 및 미처리 생물막 샘플에 대한 WGA 신호의 수량화를 제공하고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. Skogman 등의 알에서 수정. 26 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
데이터 처리 및 통계 분석
통계 파라미터는 분석법의 품질을 특성화하는 스크리닝 실행 동안 그들의 성능을 따라 계산된다. 사용되는 가장 중요한 매개 변수뿐만 아니라, 얻어진 목표 값의 방정식, 표 1에 나와있다. 모든 방정식, SD 최소, μ 분, SD 최대, 그리고 최대의 최소한의 표준 편차 수단을 나타내는 μ에서각각 (분) 및 최대 (최대) 신호. 여기에 도시 한 결과, 원래의 값의 비교는 p <0.05를 유의 한 것으로 간주 하였다 웰치 보정과 부대 t 테스트로 수행 하였다 페어링.
표 1 : 분석의 성능을 평가하는 데 사용되는 통계적 파라미터. 모든 방정식, SD 최소, μ 분, SD 최대 및 μ에서 최대는 각각 표준 편차 수단 최소한의 (분) 및 최대 (최대) 신호를 나타냅니다. 염색 방법, 레사 주린, 크리스탈 바이올렛, 밀 배아 응집소, 단축된다 RES, CRV, 그리고 WGA 각각. RFU : 상대 형광 단위; RAU : 상대 흡광도 단위. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
동시에 생존, 바이오 매스 및 생물막 행렬의 화합물의 효과를 측정 할 수있는 하나의 방법은 없다. 따라서, 바람직하게는 일차 스크리닝 단계에서 세 개의 엔드 포인트에 영향을 검출하기 위해 분석을 조합이 필요하다.
레사 주린는 산화 환원 프로브의 첨가로 이루어지는 매우 간단한 염색 프로토콜이다. 그러나, 레사 주린과 생물막 최적의 배양 시간을 설정하는 것은 상기 분석의 성공에 중요하다. 다른에서 몇 시간 19 지속될 수 있지만 일부 균주에서 분홍색 형광 레조 루핀 (resorufin)으로 레사 주린 프로브의 감소는 매우 신속하게 발생한다. 또한, 동일 균주 내에서, 또한 플랑크톤 박테리아와 바이오 필름 사이에 상당한 차이가있을 수 있습니다. 플랑크톤 박테리아는 일반적 쉽게 세균 밀도 생물막 PO보다 플랑크톤 집단 낮고 주로 때문에 도달반응의 빠른 회전율을 촉진 pulations. 생물막 생존 염색법 프로브 게시 비교하여, 레사 주린이 가장 정확하고 사용이 간편하고, 비용이 최소 19 분석법 중 하나가 될 것으로 결론 지어졌다. 또한, 세균 및 진균 (19)의 범위에 적용 할 것으로 밝혀졌다. 한편, 크리스탈 바이올렛 분석은 가장 널리 생물막 질량 정량 19,32,33 사용이다. 이 프로토콜의 가장 중요한 단계는 크리스탈 바이올렛 염색 액의 추가 및 제거한다. 이러한 단계 (인해 웰의 벽에 얼룩 방울 예) 비특이적 염색을 피하기 위해 매우 조심스럽게 수행되어야한다. 초기 염색 분석법으로 레사 주린 사용의 주요 이점 중 하나는 크리스탈 바이올렛 염색 동일한 플레이트의 사용을 가능하게하는 세포에 독성이 있다는 사실이다. 양 분석의 조합은 상당히 플로 단순화 비용을 낮추고 consum 절약청정도가 선별 및 환경에서 특히 유용하다 시험 화합물의 사용을 최소화한다.
앞서 지적 된 바와 같이, 자체 제작 세포 외 다당류 매트릭스는 생물막의 필수 성분이다. 매트릭스 콘텐츠 (특히 중요한 다당류)를 측정하기 위해 제 분석은 형광 표지 된 WGA에 기초하여, 여기에 포함되었다. 원래 WGA 정량은 효소 결합 렉틴 흡착제 분석 (엘라) 24 설명했다. 디메틸 메틸렌 블루 (DMMB)와 S. aureus에 생물막의 행렬에서 염색 글리코 사 미노 글리 칸 (개그)에 기초하여 유사한 분석도 31,34를 이용되었다. 개그는 황색 포도상 구균 종의 행렬에서 발견되는 다당류 세포 간 adhesins (PIA를)과 유사하다. 35 생물막. WGA-분석보다 구체적으로 유사 대상의 PIA를, 그러나 WGA는 생물막 매트릭스 (36) <에 필수적인 역할을 N의 아세틸 글루코사민 잔기, 폴리에 결합/ SUP>. 매트릭스 타겟팅 의한 매트릭스 화학적 또는 항생제 치료 후 방치하면 쉽게 생물막 자라게 할 수 있다는 사실에 높은 중요하다. 박테리아는 또한보다 쉽게 매트릭스 (35)를 미리 코팅 된 표면에 첨부 할 수 있습니다. 어떤 항생제 효과적으로 생존 생물막 미생물을 낮출 수 있음을 도시하지만, 매트릭스에 영향없이되었다. 실험에서, 이것은 시프로플록사신 (31)의 경우로 예시된다. 페니실린 G (26) 여기에서 입증 된 바와 같이 일부 항생제도, 매트릭스 생성을 증가시킬 수있다. 이러한 변화에 기초하여, 항생제는 표 2에 열거 된 범주로 분류 될 수있다. 우리의 스크리닝 연구 (그림 2)의 모든 히트 곡은 바이오 필름에 박테리아를 죽이고 바이오 매스를 줄일 수 있지만, 분해하거나 생물막 행렬을 방해하지 않는 화합물로, 함께 시프로플록사신으로 분류 될 수있다.
| 범주 | 박테리아에 미치는 영향 | 매트릭스에 미치는 영향 | 예를 들어 항생제 (목표 생물막) | 참고 |
| 1 | 없음 | 없음 | 암피실린 (SA) | (토트 백 등의 등. 2009) |
| 이 | 없음 | - | cefalotin (SA) | (토트 백 등의 등. 2009) |
| 삼 | - | 없음 | 폴리 믹신 (SA) | (토트 백 등의 등. 2009) |
| 4 | - | - | 카나마이신 (PA) | (토트 백 등의 등. 2009) |
| 시프로플록사신 (SA) | (Skogman 등. 2012) | |||
| (5) | - (+) | - | 독시사이클린 (PA) | (토트 백 등의 등. 2009) |
| 6 | - | + | 페니실린 G (SA, EC) | (Skogman 등. 2012) |
표 2 : 항생제의 분류. 항생제는과 (WGA 또는 디메틸 블루 (DMMB) 염색을 사용하여) 매트릭스 (염색 레사 주린 사용) 생물막 세균의 생존에 미치는 영향에 따라 범주로 구분됩니다. SA : 황색 포도상 구균; PA : 녹농균; EC : 대장균. 토트 등의 알에서 수정. (31)
또한,이 플랫폼은 기본 검진 캠페인을 수행하기에 적합합니다. 가장 비용 및 시간 효율적인 전략은 1 차 전략으로 레사 주린과 크리스탈 바이올렛 기반 분석을 적용하고, 두 번째 계층 (후속) 연구에서 WGA 매트릭스 분석로 이동하는 것입니다. 이것은 WGA 프로브 다소 비싸다는 사실로 인해 이러한 분석은 더 많은 수고와 시간을 소모하게되는 여러 단계로 구성되어있다.
이 플랫폼의 중요한 특징은 상기 식별 된 항균제의 장기 효과를 평가할 수있다. 생물막 행렬 분해되는 경우 장기간의 화학 요법의 효과는 달성 될 수있다. 이는 매트릭스가 남겨진 경우 생물막 소생 감염의 위험이 더 높은 것으로 밝혀졌다. 이 플랫폼으로, 그것은 전체 생물막 바이오 매스 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 영향을받는 경우 먼저 평가하는 것이 가능하다. 더 라WGA 분석법을 이용하여 바이오 필름 매트릭스 다당류 etailed 평가 따를 수있다. 참고로, 상기 매트릭스를 분해 효과는 낮은 것으로 간주 될 수있다 항균 (살균)를 발휘할 수 모두 단일 분자 식별의 가능성. 실제로 지금까지, 우리는 이러한 유형 식별 한 유일한 화합물은 항균 펩타이드 37이다. 이 전략은 별도의 살균 또는 행렬 분해 활성을 가진 화합물의 식별을 허용하기 때문에이 문제를 해결하기 위해, 후속 업, resazurin- 또는 크리스탈 바이올렛 활동 안타 하나와이 플랫폼에서 실행된다. 이러한 리드는 다 성분 전략 잠재적으로 흥미로운 일이 될 수 있습니다. 살 생물 제 또는 항생제 형 화합물과 매트릭스 - 분해 분자의 조합은보다 효율적인 생물막 박멸을 제공 할 것으로 예상된다.
요약하면, 여기에 제시된 플랫폼은 매트릭스 quantifi와 함께 생존 및 바이오 매스 측정을 사용하여 안티 바이오 필름 스크리닝을위한 좋은 기초를 제공양이온 및 시각화. 모두 레사 주린과 크리스탈 바이올렛 염색 분석법은 biofilm- 형성 미생물의 다른 종류에 대해 사용될 수있다. 그러나 이러한 분석은 모두 성장하고 염색 조건에 대한 별도의 최적화가 필요합니다. WGA 염색 분석법의 적용은 N의 폴리 아세틸 글루코사민은 생물막 행렬의 주성분 인 이들 세균으로 제한된다. (디메틸 메틸렌 블루 염색법에 기초한 것과 같은) 다른 매트릭스 정량 분석은 다른 경우에 적용될 수있다. 전부,이 플랫폼의 분석은 수행 할 매우 쉽게 모든 시약은 쉽게 사용할 수뿐만 아니라 일반적으로 저렴합니다. 이 플랫폼은 고가의 설비 투자가 필요없이 중간 처리량 항 생물막 스크리닝에 저 적합하다.
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Acknowledgments
저자는 자신의 실험실에서 촬영 과정에서 그의 지원을위한 교수 폴 감옥과 LMPH, 앤트워프 대학, 벨기에 감사합니다. 이 작품은 핀란드 프로젝트 아카데미 (272266 및 282981 프로젝트) 및 스웨덴어 Tekniska Vetenskapsakademien 나는 핀란드에 의해 투자되었다. 석사 야니 Kujala의 기술적 기여가 인정된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
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