Abstract
Biofilm regnes som en av de mest utfordrende temaer av moderne biomedisin, og de er potensielt ansvarlig for over 80% av antibiotika-tolerant infeksjoner. Biofilm har vist en usedvanlig høy toleranse for kjemoterapi, som antas å være multifaktoriell. For eksempel, gir matriksen en fysisk barriere som reduserer inntrengning av antibiotika inn i biofilmen. Også celler i biofilm er fenotypisk mangfoldig. Sannsynlig, oppstår biofilm elastisitet fra en kombinasjon av disse og andre, men likevel ukjente mekanismer. Alle de for tiden eksisterende antibiotika har blitt utviklet mot enkelt-celler (planktoniske) bakterier. Derfor er hittil foreligger det et meget begrenset repertoar av molekyler som selektivt kan virke på modne biofilmer. Denne situasjonen har drevet en progressiv paradigmeskifte i medisiner, som søker etter anti-biofilm har blitt oppfordret til å okkupere en mer fremtredende plass. En ekstra utfordring er at det er enmeget begrenset antall standardiserte metoder for biofilm forskning, spesielt de som kan brukes for stor-throughput screening av kjemiske biblioteker. Her er en eksperimentell anti-biofilm plattform for kjemisk screening presentert. Den bruker tre metoder for å måle biofilm levedyktighet (med resazurin flekker), total biomasse (med krystallfiolett farging), og biofilm matrise (ved hjelp av en hvetespirer agglutinin, WGA-fluorescens-basert farging av poly- N-acetyl-glukosamin, PNAG , fraksjon). Alle analysene ble utviklet ved bruk av Staphylococcus aureus som modell bakterier. Eksempler på hvordan plattformen kan benyttes for primær screening samt for funksjonell karakterisering av identifiserte anti-biofilm treff blir presentert. Dette eksperimentelle sekvens gjør videre for klassifisering av hits basert på de målte endepunkter. Den gir også informasjon om deres virkemåte, spesielt på lang sikt kontra kortsiktig kjemoterapeutiske effekter. Dermed er det svært Advantageous for rask identifisering av høykvalitets hit forbindelser som kan tjene som utgangspunkt for ulike biomedisinske applikasjoner.
Introduction
Bakterier kan veksle mellom to svært ulike livsstil, planktoniske og fastsittende, hvorav en biofilm er den vanligste eksempelet. I biofilm, bakterier danner strukturerte miljøer innebygd i en egenprodusert matrix 1. Denne egenproduserte matriks er en barriere mellom bakteriene og deres ytre miljø, og det beskytter de mikrobielle celler, holde dem i umiddelbar nærhet. Sammensetningen av biofilm matriksen varierer mellom og til og med innenfor art, men det meste består av et tett nettverk av lipopolysakkarider, ekstracellulært DNA og proteiner. Matriksen virker som en fysisk barriere for å inhibere inngangen av skadelige stoffer, men den beskytter også biofilmen fra dehydrering og hindrer næringsstoffer fra å slippe ut i cellen 2.
Biofilm regnes som en av de mest utfordrende temaer av moderne biomedisin, og de er angivelig ansvarlig for over 80% av antibiotika-tolerant infeksjoner 3. de displå en iboende høy toleranse mot eksterne trusler: fuktighet, osmotisk trykk, mekanisk stress 4, varme, UV stråling 5, desinfeksjonsmidler, antimikrobielle midler, og vertens immunsystemet 1. For eksempel har den nødvendige antimikrobielle midlet konsentrasjon som er nødvendig for å drepe en biofilm er vist å være opp til 1000 ganger høyere i forhold til det som kreves for å drepe planktoniske bakterier. Forklaringen på dette høyere toleranse synes å være multifaktoriell. Matriksen tilveiebringer en fysisk barriere som reduserer inntrengning av antibiotika inn i biofilmen. Også celler i biofilm er fenotypisk mangfoldig; de overgangen mellom forskjellige metabolske tilstander på grunn av en eksisterende gradient av oksygen, næringsstoffer og metabolitter mellom de indre og ytre deler av biofilmen 6. Følgelig, i noen biofilm områder, som for eksempel i kjernen, blir bakterier ute av oksygen og næringsstoffer, og bor i en metabolsk mindre aktiv, eller en fullstendig hviletilstand
Fra en methodological perspektiv, finnes flere utfordringer, som bare et begrenset antall av biofilm metoder har blitt utviklet av standardsettende organisasjoner, særlig de som gjelder for high-throughput screening av kjemiske biblioteker. Alle standardiserte analyser (med bare ett unntak), er basert på biofilmreaktorer, og disse fremgangsmåter krever store arbeidsvolum og store mengder av forbindelser som skal testes, som vanligvis er utilgjengelig under det tidlige stadium utprøvings 9-12. Den eneste eksisterende standardiserte screening-anvendelig analysen er den såkalte Calgary Biofilm-enhet, hvorfra den kommersielt tilgjengelige minimum biofilm eliminere konsentrasjon (MBEC)-systemet ble utviklet 13-15. Imidlertid er begrensningen av denne analysen er at biofilm er dyrket på pinnene, og ikke alle bakteriearter eller til og med stammer innenfor samme art er i stand til å danne biofilmer på denne enheten. Videre er fremgangsmåter som kan anvendes spesielt for utforskning av naturlige forbindelser erbehov for. Naturlige produkter har vært den viktigste kilden for innovasjon i antimikrobielle medisiner i løpet av det siste århundret 16. De kan gi nye anti-biofilm forbindelser med unike virkningsmekanismer som også kan være effektiv mot persister celler. Dermed utforskning av naturlige og naturlig inspirert bibliotekene har stor sjanse til å produsere lovende og unike anti-biofilm fører.
Her presenterer vi de eksperimentelle detaljene i en plattform av analyser som ble utviklet for den kjemiske screening av anti-biofilm forbindelser ved hjelp av tre metoder for å måle effektene på levedyktighet, total biomasse, og matrise av Staphylococcus aureus biofilm. Den første analysen måler biofilm levedyktighet, og den er basert på resazurin farging. Resazurin er et redoks-flekk som er blå og ikke-fluoriserende i sin oksiderte tilstand og blir til rosa, sterkt fluorescerende resorufin da reduseres med metabolsk aktivitet av bakteriene. Det er en veldig enkel og rask method egnet for primær screenings 17-20. Den andre analysen basert på krystallfiolett farging, måler total biofilm masse. Krystallfiolett er et mye brukt flekken for å studere bakterier og bakterier i biofilm 19,21-23. Analysen er basert på rimelige reagenser, og har en enkel absorbans endepunkt lesing. Til slutt, er rettet mot den tredje analysen den ekstracellulære polymere substans (EPS) -matrix av biofilm via hvetekim agglutinin (WGA), som binder spesifikt til polyakrylonitril N-acetyl-glukosamin rester (PNAG) er tilstede i matriksen i staphylococcal biofilmer 24. WGA er konjugert med en fluorophore som kan oppdages ved hjelp av fluorescens intensitet lesere 25. Vi presenterer her begrunnelsen og detaljer om plattformen vi utviklet, blant annet eksempler på applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. dyrke bakteriene
- Pre-kultur av bakterier over natten i et tryptisk soyavekstmedium (TSB) ved 37 ° C med 220 rpm risting (16-18 timer).
- Fortynn pre-kultur 100-1000 ganger (avhengig av vekst av bakterier, her er 1000 ganger brukes for S. aureus) i frisk TSB og la det vokse ved 37 ° C og 200 rpm å nå eksponensiell vekst (optisk tetthet ved 595 nm (OD 595) mellom 0,2 og 0,6).
MERK: Dette trinnet krever belastningen-spesifikke optimalisering.
2. biofilmdannelse: før og etter eksponering
- Fortynn de eksponentielt dyrkede kultur 100 ganger (dette tilsvarer ca. 10 6 kolonidannende enheter per milliliter (CFU / ml)).
- Pre-eksponering protokoll
- For ubehandlede kontrollprøver, tilsett 200 ul av den fortynnede bakteriekultur per brønn i en steril 96-mikrobrønnplate.
- Tilsett 4 pl av en testforbindelse eller en kontrollantibiotika (50x stamløsning) og 196 ul av den fortynnede bakteriekultur per brønn.
- Inkuber det ved 37 ° C på en plate rister ved 200 rpm i 18 timer.
Merk: Her bruker vi en shaker med en 2 mm bane.
- Post-eksponering protokoll
- For alle prøver, tilsett 200 ul av den fortynnede bakteriekultur per brønn i en steril 96-mikrobrønnplate.
- Inkuber det ved 37 ° C på en plate rister ved 200 rpm i 18 timer.
Merk: Her bruker vi en shaker med en 2 mm bane. - Fjerne hele planktoniske oppløsningen forsiktig, uten å berøre biofilm, ved hjelp av en multikanal pipette.
- Tilsett 4 pl av en testforbindelse eller en kontroll antibiotikum (50x stamløsning) og 196 ul av TSB per brønn.
- Inkuber det ved 37 ° C på en plate rister ved 200 rpm i ytterligere 24 timer.
Merk: Her bruker vi en shaker med en 2 mm bane.
3. Resazurin Farging-protokollenl for Livskraftig Vurdering av Biofilm
- Fremstille en stamoppløsning av 0,1 mg / ml resazurin (0,4 mM) i steril PBS. Hold denne aksjen steril, beskyttet mot lys eksponering, og ved 4 ° C.
- Fortynn resazurin lager 1:50 i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 20 uM.
- Overføre hele planktoniske løsning (forlater biofilm i brønnene) nøye, uten å berøre biofilm eller skape luftbobler, til en egen, ren 96-brønns plate ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Vask biofilm gang med sterilt PBS ved å legge til 200 mL per brønn, og ta den forsiktig med en flerkanals pipette.
- Tilsett 200 ul av den fortynnede resazurin per brønn av biofilm platen ved hjelp av en multikanal pipette.
- Inkuber det i mørket, ved romtemperatur (RT), og 200 rpm, risting i ca 20 min før de ubehandlede biofilm kontrollene er jevnt rosa.
- Mål fluorescens påλ exc = 560 nm og λ em = 590 nm med en plateleser (øverste lesing).
4. Crystal Violet Farging Protokoll for Biomasse Kvantifisering av Biofilm Bruke samme plate som i trinn 3
- Fjern resazurin flekken forsiktig fra brønnene ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Fest biofilmer med 200 ul metanol i 15 min.
- La platen lufttørke i 10 minutter.
- Legg 190 ul av 0,02% (volum / volum, fortynnet i avionisert vann) krystallfiolett oppløsning, forsiktig ved anvendelse av en multikanal pipette. Unngå å berøre sidene av brønnene med flekken mens pipettering og hindre dannelse av luftbobler ved å ikke trykke pipetten til å fullføre utblåsning.
- Inkuberes det i 5 min ved RT.
- Fjern flekken forsiktig, ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Vasker den to ganger med deionisert vann (200 mL hver gang).
- La brønnene tørke i 5 minutter ved romtemperatur og oppløse de gjenværende flekki 96% etanol eller 33% eddiksyre.
- Inkuber det i 1 time ved romtemperatur og lest av absorbansen ved 595 nm.
5. Evaluering av bakteriedrepende effekt på Planktoniske Bakterier Bruke den samme prøven Plate som for Biofilm
- Måle turbiditeten ved 595 nm av platen med de planktoniske løsningen fra 3.3.
- Flekk planktoniske bakterier med resazurin ved tilsetning av 10 pl av resazurin lager per brønn. Bland godt ved pipettering.
- Inkuber den i mørke ved romtemperatur i ca 5 minutter, inntil de ubehandlede kontrollene er jevnt rosa.
- Mål fluorescens ved λ exc = 560 nm og λ em = 590 nm.
6. Wheat Germ agglutinin Farging for Matrix Kvantifisering og Fluorescensmikroskopi Imaging of Biofilm
- Matrix kvantifisering
- Forbered en 5 mikrogram / ml oppløsning av WGA sonde i sterile PBS.
- Bruk en parallell prøve plate for farging. Fjern de planktoniske løsning fra brønnene og vaske en gang med steril PBS (200 mL per brønn), forsiktig med en flerkanals pipette uten å berøre biofilm.
- Tilsett 200 mL av WGA løsning per brønn å være farget.
- Inkuber den i mørke ved 4 ° C i 2 timer.
- Fjern den ubundne flekken ved vasking av brønnene med 200 ul PBS tre ganger.
- La platen tørke i 15 minutter ved RT.
- Oppløs den bundne flekk i 33% eddiksyre, ved hjelp av 200 ul per brønn.
- Tett brønnene med stripe caps og sonicate dem ved hjelp av et vannbad sonikator i 30 sek ved RT og 40 kHz.
- Inkuber platen i 1 time ved RT.
- Gjenta sonikeringstrinn. kan forbli forseglet Brønnene mellom ultralyd trinn.
- Mål fluorescens ved λ ex = 495 nm og λ em = 520 nm med en plateleser (øverste lesing).
- Visualisering matrisen medfluorescens mikroskopi
- Bruke samme protokoll som ovenfor til trinn 6.1.6.
- Etter tørketrinnet, å visualisere prøvene med et fluorescens-mikroskop, ved hjelp av et FITC-filter (eller et annet egnet grønn eksitasjon filter).
7. Farging Levedyktige og døde celler innenfor Biofilm for Imaging med Fluorescensmikroskopi og Kvantifisering av Signal for Green-til-rød-ratio (G / R)
- Imaging med fluorescens mikroskopi
- Forbered en løsning av hver probe (en fargingslevedyktige celler og de andre en fargings døde celler), i henhold til produsentens retningslinjer.
- Fjern de planktoniske oppløsning fra brønnene og vaskes en gang med sterilt PBS (200 ul pr brønn) ved hjelp av en multikanal pipette.
- Tilsett 6 mL av fargeløsning per brønn.
- Platen inkuberes i mørket i 15 min.
- Før mikroskopi, fjerne overflødig væske manually ved hjelp av en flerkanals pipette.
- Capture bildene ved hjelp av en fluorescens mikroskop, ved hjelp av for eksempel en FITC filter (for grønn fluorescens, levedyktige celler) eller en TRITC filter (rød fluorescens, døde celler).
- Kvantifisering av signalet som et grønn-til-rød fluorescens-forholdet (G / R)
- Følg samme protokoll som i trinn 7.1.1 og 7.1.2.
- Tilsett 200 ul av den fargeløsning per brønn og inkuber dem i 15 minutter i mørke.
- Mål fluorescens med en plateleser ved eksitasjon / emisjonsbølgelengder 485/535 nm og 485/635 for grønn og rød fluorescens, henholdsvis (øverste lesing).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den foreslåtte plattformen, er effektene på levedyktighet, biomasse, og biofilm matrise kvantifisert. I arbeidssekvensen (figur 1), blir en prøveplaten beiset med resazurin og senere med krystallfiolett for samtidig å vurdere effektene på bakteriell levedyktighet og biofilm på total biofilm biomasse. Begge analyser kan utføres etter hverandre i samme plate, fordi det ble vist tidligere at en første farging med resazurin hadde ingen statistisk signifikant virkning på krystallfiolett farging resultat (p = 0,4149 for sammenligning av maksimal signal absorbansenheter mellom krystallfiolett platene farget separat eller etter Resazurin-flekker, n = 20) 26. Effekten på planktoniske bakterier kan samtidig vurdert.
Ved treff blir identifisert fra enten levedyktighet eller biomasse-baserte analysen, er en andre plate st ained med WGA sonde for å kvantifisere effekten av forbindelsene på polysakkaridet komponent (PNAG) av biofilmen matrisen. Denne arbeidsflyten kan brukes til screening av kjemiske biblioteker, så vel som til funksjonelle oppfølgingsstudier for potens målinger av treff forbindelser, som eksemplifisert nedenfor.
Figur 1: Workflow av de tre-analysen plattform. Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten å kombinere de tre analysene på biofilm prøver. Plattformen omfatter farging for en effekt på levedyktigheten, biomasse, og EPS-lag; bildebehandling med fluorescens mikroskopi; og evaluere effekten på de planktoniske fase. "A" og "NA" står for henholdsvis "Aktiv" og "Ikke aktiv,". Modifisert fra Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Utførelse av Tre-analysen plattform for screening formål
Her blir to screening kjøringer vist som representative resultater av ytelsen av plattformen. I den første kampanje (figur 2A), ble en liten bibliotek av cinchona alkaloid-derivater screenet for anti-biofilm aktivitet mot S. aureus biofilmer 27, mens i det andre eksempel (figur 2B), en naturlig og naturlig inspirert bibliotek av abietane-typen diterpenoids og derivater ble utforsket 28,29. De aktive treff ble bestemt ved hjelp av de beregnede hit grenser (terskler, ligning 6, Tabell 1). I hver screening studie, resultatene av de første to analyser korrelerte meget godt; slagene var alle i stand til å redusere levedyktigheten og biofilm biomasse, while de inaktive forbindelser viste ingen effekt verken assay. Alle de identifiserte hits ble deretter testet på den tredje (WGA) analyse, men de hadde ingen matrise-demontering (eller matrise-nedverdigende) effekter (resultater ikke vist).
Figur 2: Representative resultater av screening kampanjer ved hjelp av plattformen med S. aureus biofilm. To eksempler på proof-of-concept validerings skjermer utføres ved hjelp av analyseplattform. Resultatene er presentert som en prosent av den ubehandlede kontroll biofilm, blir treff forbindelsene angitt i rødt, og linjene representerer de beregnede treff grenser. (A) screening av en cinchona-alkaloid derivat biblioteket identifisert en aktiv forbindelse. (B) Den screening av et bibliotek av abietane-type diterpenoids og derivater identifisert fem handleive forbindelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Utførelse av Tre-analysen plattform for oppfølgingsstudier
Representative resultater kan sees i figur 3, der to kjente antibiotika ble testet ved et meget bredt område av konsentrasjoner (0,5 nM-5 mM) mot S. aureus biofilmer. Minimumsverdier hemmende konsentrasjon (MIC) av referanse forbindelser mot planktoniske bakterier (enten fra litteraturen eller på laben) tjene som retningslinjer for valg av konsentrasjoner for å teste mot biofilm av samme art. I tillegg kan kunnskap om konsentrasjonsverdiene der ingen cytotoksisitet er oppdaget i pattedyrceller også hjelpe i valg av konsentrasjonen for å teste for anti-biofilm oppfølging. Ideelt sett,dersom begge antimikrobielle og cytotoksiske data for en bestemt forbindelse er tilgjengelige, kan en parameter kjent som "biologisk forenelighetsmiddel Index" (BI) beregnes, som definert av Müller og Kramer 30. Her ble MIC-verdiene mot planktoniske S. aureus for penicillin G og ciprofloksacin bestemt til å være 0,04 uM og 6 pM henholdsvis (resultater ikke vist). Konsentrasjonen intervallet varierte fra ca 10 5 x MIC til 10 -2 x MIC og 10 3 x MIC til 10 -4 x MIC for penicillin og ciprofloxacin, respektivt. Begge antibiotika ble en signifikant reduksjon i levedyktighet, biomasse, og biofilm matrise PNAG innhold når de ble utsatt for encellede bakterier før initieringen av biofilmdannelse prosessen (figur 3a). Imidlertid, til tross for den meget høye konsentrasjon av antibiotika testet på forhånd dannede (18 hr) biofilmer, levedyktighet og biomassen ble bare redusert til omtrent 50% av tslange av ubehandlede biofilmer (figur 3b). Den mest fremtredende Resultatet her var økningen av biofilm matrise (til over 200%) når prefabrikkerte biofilm ble behandlet med høye konsentrasjoner av penicillin G. ble oppdaget Ingen endringer i innholdet av biofilm matrisen når prefabrikkerte biofilm ble behandlet med ciprofloksacin.
Figur 3: Eksempel på en oppfølgingsstudie av anti-biofilm effekter ved hjelp av to modell antibiotika mot S. aureus biofilm. Virkningene av penicillin G og ciprofloxacin er presentert her: (A) forut for biofilmdannelse (pre-eksponering) og (B) etterbiofilmdannelse (post-eksponering). For figur klarhet, bare det laveste og de høyeste konsentrasjonene som ble testet er vist. Standardavvikene ikke overstiger 20%. *** EQUAls p <0,01. Modifisert fra Skogman et al. 26 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fluorescensmikroskopi-baserte Imaging
Det resultat at penicillin G ved 400 uM (så vel som høyere konsentrasjoner, som vist i figur 3b) dreper ca. 50% av den på forhånd dannede S. aureus biofilm bakteriepopulasjon ble bekreftet med en annen levedyktighet farging assay. Gjennomsnittet av de grønne-til-rød (G / R) fluorescens forholdstall for de ubehandlede biofilm brønnene var 2,75, noe som indikerer en overvekt av levende (grønn-farget) celler, over døde (rød-farget) celler. Men i penicillin-behandlede celler ble redusert G / R-forhold på 1,54, svarende til 56% av kontrollbrønnene. Cellene gjenværende i live etter penicillin behandling prosert en betydelig høyere mengde av EPS, som bedømmes utfra den påviste økning i grønn (WGA) fluorescens sammenlignet med ubehandlede biofilmer (figur 4b). Vi anbefaler, når det er mulig, for å utføre disse bildebaserte eksperimenter for å ytterligere bekrefte resultatene av plattformen, spesielt i den fasen av karakterisering av treffet kandidater.
Figur 4: Fluorescens-mikroskopi. Effekten av tilsetning penicillin (400 uM) på levedyktighet og EPS-produksjon er vist her. De øverste bildene (A) tilsvarer ubehandlede biofilmer og penicillin behandlet biofilm, hvor levedyktige celler er farget grønn og døde celler er farget rød. Den innsatte Grafen viser beregningene av G / R fluorescens forholdstall. De nederste bildene (B) tilsvarer ubehandlede biofilmer og penicillinbehandlede celler farget med WGA sonde. Den innsatte graf som viser kvantifiseringen av WGA signalene for behandlede og ubehandlede biofilm prøver, og Feilstolpene representerer standardavviket. Modifisert fra Skogman et al. 26 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Databehandling og statistisk analyse
Statistiske parametre er beregnet til å karakterisere kvaliteten av analysene og for å følge deres ytelse under screening løper. Ligninger av de viktigste parametrene som brukes, samt innhentet og målverdier, oppført i tabell 1. I alle ligninger, SD min, μ min, SD maks, og u max representerer standardavvik og hjelp av minimal(Min) og maksimal (max) signaler, henholdsvis. I resultatene som vises her, sammen sammenligninger av de opprinnelige verdiene ble gjort med en uparet t-test med Welch korreksjon, der p <0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant.
Tabell 1: statistiske parametre som brukes for å evaluere resultatene av analysene. I alle ligninger, SD min, μ min, SD maks, og u max representerer standardavvik og hjelp av minimal (min) og maksimal (max) signaler, henholdsvis. De fargemetoder, Resazurin, krystall fiolett, og hvetespirer agglutinin, er forkortede RES, CrV, og WGA, henholdsvis. RFU: relative fluorescens enheter; RAU: relative absorberingsenheter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er ingen enkel metode som kan samtidig måle effekten av en forbindelse på levedyktigheten, biomasse, og biofilm matrise. Derfor er det et behov for å kombinere analyser for å detektere en virkning på de tre endepunktene, fortrinnsvis ved en primær screeningtrinn.
Resazurin er en meget enkel fargeprotokoll bestående bare av tilsetningen av redoks-sonde. Men etablere optimal inkubasjonstid av biofilm med resazurin er avgjørende for å lykkes i denne analysen. I noen bakteriestammer, reduksjonen av resazurin proben til rosa, fluorescerende resorufin skjer meget raskt, mens i andre kan det vare i flere timer 19. Dessuten, innen den samme bakteriestamme, kan det også være betydelige forskjeller mellom planktoniske bakterier og biofilm. De planktoniske bakterier er vanligvis mer lett tilgjengelig, hovedsakelig fordi det bakterielle tetthet er lavere i planktoniske populasjoner enn i biofilm populations, som fremmer hurtigere omsetning av reaksjonen. I en publisert sammenligning av biofilm levedyktighet flekker prober ble resazurin konkludert å være en av de mest nøyaktige, enkle å bruke, og minst kostbare analyser 19. Videre har det vist seg å være gjeldende for en rekke bakterier og sopp organismer 19. På den annen side, er den krystallfiolett-analysen er den mest brukte for biofilmmassen kvantifisering 19,32,33. De mest kritiske trinn av denne protokollen er tilsetning og fjerning av krystallfiolett fargende oppløsning. Disse trinnene må være utført meget omhyggelig for å unngå uspesifikk farging (for eksempel på grunn dråper flekk på veggene i brønnene). En av de viktigste fordelene ved å bruke resazurin som den første farging analysen er det faktum at det er ikke-toksisk for cellene, som muliggjør bruken av den samme plate for krystallfiolett farging. Kombinasjonen av begge analysene forenkler betydelig arbeidsflyten, senker kostnadene, sparer consumdringer, og minimerer bruken av testforbindelsene, noe som er spesielt verdifullt i en screening miljø.
Som antydet tidligere, er egenprodusert ekstracellulære polysakkarid matrise en essensiell komponent i biofilm. For å måle matrisen innhold (spesielt viktig polysakkarider), ble en tredje analyse tatt med her, på grunnlag av fluorescens-merket WGA. Opprinnelig WGA kvantifisering ble beskrevet som en enzym-bundet lektin-sorbent assay (Ella) 24. En lignende analyse basert på fargings glykosaminoglykaner (GAG) i matrisen av S. aureus biofilmer med dimethylmethylene blå (DMMB) har også blitt brukt 31,34. GAG er lik de polysakkarid-intercellulære adhesiner (pias) som finnes i matriksen av Staphylococcus spp. biofilmer 35. WGA-analysen Tilsvar retter seg mot PIAer, men WGA mer spesifikt binder seg til polyakrylonitril N-acetyl-glukosamin rester, som spiller en viktig rolle i biofilm matrise 36 </ Sup>. Målretting matrisen er av stor betydning på grunn av det faktum at biofilm lett kan vokse dersom matrisen er igjen etter en kjemisk eller antibiotikabehandling. Bakterier kan også lettere fester seg til en overflate som er matrise pre-coated 35. Det er blitt vist at noen antibiotika effektivt kan redusere levedyktighet og biofilm biomasse, men uten noen effekt på matrisen. I våre eksperimenter, er det eksemplifisert ved tilfellet av ciprofloksacin 31. Noen antibiotika kan også øke matrise produksjon, som demonstrert her med penicillin G 26. Basert på disse endringene, kan antibiotika deles inn i kategoriene nevnt i tabell 2. Alle treff i våre screeningstudier (figur 2) kan klassifiseres sammen med ciprofloksacin, som stoffer som dreper bakterier i biofilm og redusere biomassen, men ikke demontere eller forstyrre biofilm matrise.
| Kategori | Effekt på bakterier | Effekt på matrix | Eksempel antibiotika (mål biofilm) | Henvisning |
| 1 | none | none | ampicillin (SA) | (Stoff et al. 2009) |
| 2 | none | - | cefalotin (SA) | (Stoff et al. 2009) |
| 3 | - | none | polymyksin (SA) | (Stoff et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamycin (PA) | (Stoff et al. 2009) |
| ciprofloxacin (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doksycyklin (PA) | (Stoff et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicillin G (SA, EC) | (Skogman et al. 2012) |
Tabell 2: Klassifisering av antibiotika. Antibiotika er delt inn i kategorier basert på deres effekt på levedyktigheten av biofilm bakterier (ved hjelp resazurin flekker) og matrisen (ved hjelp av WGA eller dimethylmethylene blå (DMMB) farging). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EC: Escherichia coli. Modifisert fra Tote et al. 31
Videre er ideell for å utføre primærscreenings kampanjer denne plattformen. Den mest kostnads- og tidseffektiv strategi er å bruke Resazurin og krystallfiolett-baserte analyser som et første-tier strategi og for å gå videre til WGA-matrise analysen i andre-tier (oppfølging) studier. Dette skyldes det faktum at WGA sonden er ganske dyrt, og at denne analysen består av flere trinn, noe som gjør den mer arbeidskrevende og tidkrevende.
Et relevant funksjon i denne plattformen er muligheten til å vurdere de langsiktige virkningene av de identifiserte antimikrobielle midler. Langtids kjemoterapeutiske virkningene kan bare oppnås hvis biofilmen matrisen er demontert. Det har vist seg at risikoen for gjenoppliving av biofilm infeksjon er mye høyere dersom matrisen er igjen. Med denne plattformen, er det mulig først å vurdere om den samlede biofilmen biomassen blir påvirket ved hjelp av krystallfiolett farging. En mer detailed vurdering av biofilm matrise polysakkarider, ved hjelp av WGA-analysen, kan følge. Av notatet, er sannsynligheten for å identifisere et enkelt molekyl som både kan demontere matrisen og utøve antibakteriell (biocid) effekter kan anses som lav. Faktisk, så langt de eneste forbindelser av denne typen som vi har identifisert er antimikrobielle peptider 37. For å løse dette, oppfølging utført i denne plattformen med enten resazurin- eller krystallfiolett-aktiv hits, siden denne strategien tillater identifisering av forbindelser med separat biocid eller matrise-nedverdigende aktivitet. Slike ledninger kan være potensielt interessant for flerkomponent strategier. En kombinasjon av matrisenedbrytende molekyler med biocide eller antibiotika-type forbindelser er ventet å tilveiebringe mer effektiv biofilm utrydding.
Oppsummert plattformen presenteres her gir et godt grunnlag for anti-biofilm screening ved hjelp av levedyktighet og biomasse målinger sammen med matrise quantifisering og visualisering. Både Resazurin og krystallfiolett farging analyser kan også brukes for andre typer biofilm- dannende mikroorganismer. Men disse analysene krever separat optimalisering for både dyrking og fargeforhold. Anvendeligheten av WGA farging analysen er begrenset til de bakterier i hvilken poly- N-acetyl-glukosamin er en hovedkomponent av biofilm matrisen. Andre matrise kvantifisering analyser (for eksempel basert på en dimetyl-metylen- blått-farging) kan anvendes i andre tilfeller. Til sammen analysene i denne plattformen er ganske enkelt å utføre, og alle reagenser er lett tilgjengelig, samt generelt rimelig. Denne plattformen er egnet for lav- til middels-throughput screening anti-biofilm uten behov for kostbare utstyrsinvesteringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Paul Cos og LMPH, Universitetet i Antwerpen, Belgia for hans støtte under filmingen prosessen i sitt laboratorium. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland prosjekter (prosjekter 272266 og 282981) og Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De tekniske bidrag MSc Janni Kujala er anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
