Abstract
Biofilmer betraktas som ett av de mest utmanande ämnen av modern biomedicin, och de är potentiellt ansvariga för över 80% av antibiotika tolerant infektioner. Biofilmer har visat en exceptionellt hög tolerans för kemoterapi, som är tänkt att vara beroende av flera faktorer. Till exempel, tillhandahåller matrisen en fysisk barriär som minskar inträngningen av antibiotika in i biofilmen. Också, celler i biofilmer är fenotypiskt varierande. Sannolikt uppstår biofilm motståndskraft från en kombination av dessa och andra, hittills okända mekanismer. Alla de befintliga antibiotika har utvecklats mot enkel celler (plankton) bakterier. Därför hittills, föreligger en mycket begränsad repertoar av molekyler som kan selektivt verka på mogna biofilmer. Denna situation har drivit en progressiv paradigmskifte inom läkemedelsforskning, där sökande efter anti-biofilm har uppmanats att inta en mer framträdande plats. En ytterligare utmaning är att det finns enmycket begränsat antal standardiserade metoder för biofilm forskning, särskilt de som kan användas för stora throughput screening av kemiska bibliotek. Här är en experimentell anti-biofilm plattform för kemisk screening presenteras. Det använder tre analyser för att mäta biofilm lönsamheten (med resazurin färgning), total biomassa (med kristallviolett färgning), och biofilm matris (med en vetegroddagglutinin, WGA-fluorescensbaserad färgning av poly-N-acetyl-glukosamin, PNAG , fraktion). Alla analyser har utvecklats med hjälp av Staphylococcus aureus som modell bakterier. Exempel på hur plattformen kan användas för primär screening samt för funktionell karakterisering av identifierade anti-biofilm träffar presenteras. Denna experimentella sekvens som möjliggör för klassificering av de träffar baserat på de uppmätta ändpunkterna. Det ger också information om deras verkningsmekanism, särskilt på lång sikt kontra kortsiktiga kemoterapeutiska effekter. Således är det mycket Advantageous för snabb identifiering av hit föreningar med hög kvalitet som kan tjäna som utgångspunkter för olika biomedicinska tillämpningar.
Introduction
Bakterier kan växla mellan två mycket olika livsstilar, plankton och fastsittande, varav en biofilm är det vanligaste exemplet. I biofilmer, bakterier bildar strukturerade samhällen inbäddade i en egenproducerad matris 1. Denna egenproducerade matrisen är en barriär mellan bakterierna och deras yttre miljön, och det skyddar de mikrobiella cellerna, att hålla dem i omedelbar närhet. Sammansättningen av biofilmmatrisen varierar mellan och även inom arter, men det består huvudsakligen av ett tätt nätverk av lipopolysackarider, extracellulär DNA och proteiner. Matrisen fungerar som en fysisk barriär hämmar ingången av skadliga ämnen, men det skyddar också biofilmen från uttorkning och hindrar näringsämnen från att fly cellen 2.
Biofilmer betraktas som ett av de mest utmanande ämnen av modern biomedicin, och de är enligt uppgift svarar för mer än 80% av antibiotika tolerant infektioner 3. de displägga en inneboende hög tolerans mot yttre hot: fuktighet, osmotiska trycket, mekanisk påfrestning 4, värme, UV-strålning 5, desinfektionsmedel, antimikrobiella medel, och värdens immunsystem 1. Till exempel, har den erforderliga antimikrobiella medlet koncentration som krävs för att döda en biofilm visats vara upp till 1000 gånger högre i jämförelse med den som krävs för att döda planktonbakterier. Förklaringen till detta högre tolerans verkar vara multifaktoriell. Matrisen ger en fysisk barriär som minskar inträngningen av antibiotika in i biofilmen. Också, celler i biofilmer är fenotypiskt skiftande; de går över mellan olika metaboliska tillstånd på grund av en befintlig gradient av syre, näringsämnen och metaboliter mellan de inre och yttre delarna av biofilmen 6. Därför, i vissa biofilm regioner, till exempel kärnan, är bakterier berövas syre och näringsämnen och bor i ett metaboliskt mindre aktiv eller en helt vilande tillstånd
Från en methodologiCal perspektiv finns det ytterligare utmaningar, som endast ett begränsat antal biofilm metoder har utvecklats av standardiseringsorganisationer, i synnerhet de som gäller för high-throughput screening av kemiska bibliotek. Alla standardiserade analyser (med endast ett undantag) är baserade på biofilm reaktorer, och dessa metoder kräver stora arbetsvolymer och stora mängder av föreningar som skall testas, som vanligtvis inte tillgänglig under tidig investigational stadium 9-12. Den enda existerande standardiserade screening-tillämplig analysen är den så kallade Calgary Biofilm Device, från vilken kommersiellt tillgängliga minsta biofilm eliminerar koncentration (MBEC) Systemet har utvecklats 13-15. Dock är begränsningen av denna analys att biofilmer odlas på pinnar, och inte alla bakteriearter eller ens stammar inom samma art kan bilda biofilmer på den här enheten. Dessutom metoder som kan vara särskilt tillämpas på utforskandet av naturliga föreningar ärbehövs. Naturliga produkter har varit den viktigaste källan för innovation i antimikrobiell läkemedelsframtagning under det senaste århundradet 16. De kan ge nya anti-biofilm föreningar med unika verkningsmekanism som också kan vara effektiva mot persister celler. Således, utforskandet av naturliga och naturligt inspirerade bibliotek har stora chanser att producera lovande och unika anti-biofilm leder.
Här presenterar vi de experimentella detaljerna i en plattform analyser som utvecklats för kemisk screening av anti-biofilm föreningar med användning av tre analyser för att mäta effekterna på lönsamheten, totala biomassan, och matris av Staphylococcus aureus biofilmer. Den första analysen mäter biofilm livskraft, och den bygger på resazurin färgning. Resazurin är en redox-fläck som är blått och icke-fluorescerande i sitt oxiderade tillstånd och förvandlas till rosa färg, mycket fluorescerande resorufin när reduceras genom den metaboliska aktiviteten hos bakterierna. Det är en mycket enkel och snabb metod lämplig för primära screen 17-20. Den andra analysen, baserat på kristallviolett färgning mäter total biofilm massa. Kristallviolett är en allmänt använd fläck för att studera bakterier och bakterier i biofilmer 19,21-23. Analysen är baserad på billiga reagens och har en enkel absorbans endpoint behandlingen. Slutligen riktar den tredje analysen den extracellulära polymera substansen (EPS) -matris av biofilmen via vetegroddagglutinin (WGA), som specifikt binder till poly-N-acetyl-glukosamin-rester (PNAG) som föreligger i matrisen av stafylokock biofilmer 24. WGA är konjugerad med en fluorofor som kan detekteras med användning av fluorescensintensitets läsare 25. Vi presenterar här den logiska och uppgifter om plattformen vi utvecklat, inklusive exempel på tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Växande bakterierna
- Förkultur bakterierna över natten i en tryptisk sojabuljong (TSB) vid 37 ° C med 220 rpm skakning (16-18 h).
- Späd förodling 100-1000 gånger (beroende på tillväxthastigheten hos bakterier, här är 1000 gånger används för S. aureus) i färskt TSB och låta det växa vid 37 ° C och 200 rpm för att nå exponentiell tillväxt (optisk densitet vid 595 nm (OD 595) mellan 0,2 och 0,6).
OBS: Detta steg kräver stamspecifika optimering.
2. Biofilm Formation: före och efter exponering
- Späd de exponentiellt odlade kultur 100 gånger (detta motsvarar ca 10 6 kolonibildande enheter per milliliter (CFU / ml)).
- Pre-exponering protokoll
- För obehandlade kontrollprover, tillsätt 200 pl av den utspädda bakteriekultur per brunn av en steril 96-mikrobrunnsplatta.
- Tillsätt 4 | j, l av en testförening eller en kontrollantibiotika (50x stamlösning) och 196 pl av den utspädda bakteriekultur per brunn.
- Inkubera den vid 37 ° C på en plattskakanordning vid 200 rpm under 18 timmar.
Obs: Här använder vi en shaker med en 2 mm bana.
- Post-exponeringsprotokoll
- För alla prov, tillsätt 200 pl av den utspädda bakteriekultur per brunn av en steril 96-mikrobrunnsplatta.
- Inkubera den vid 37 ° C på en plattskakanordning vid 200 rpm under 18 timmar.
Obs: Här använder vi en shaker med en 2 mm bana. - Ta bort hela plankton lösning försiktigt, utan att röra biofilmen med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tillsätt 4 | j, l av en testförening eller en kontroll antibiotikum (50x stamlösning) och 196 | il TSB per brunn.
- Inkubera den vid 37 ° C på en plattskakanordning vid 200 rpm under ytterligare 24 timmar.
Obs: Här använder vi en shaker med en 2 mm bana.
3. Resazurin färgning Protocol för Livskraft Utvärdering av Biofilmer
- Bered en stamlösning av 0,1 mg / ml resazurin (0,4 mM) i steril PBS. Hålla detta lager steril, skyddad från ljusexponering, och vid 4 ° C.
- Späd resazurin lager 1:50 i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att uppnå en slutlig koncentration av 20 ^ M.
- Överföra hela plankton lösning (lämnar biofilmer i brunnarna) försiktigt, utan att vidröra biofilmer eller skapa luftbubblor, till en separat, ren 96-brunnar med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tvätta biofilmer gång med steril PBS genom att tillsätta 200 pl per brunn, och ta bort det försiktigt med en flerkanalspipett.
- Tillsätt 200 pl av den utspädda resazurin per brunn av biofilmen plattan med hjälp av en flerkanalspipett.
- Inkubera det i mörker, vid rumstemperatur (RT), och 200 rpm, skakning under ca 20 min tills de obehandlade biofilm kontrollerna är jämnt rosa.
- Mäta fluorescensen vidλ exkl = 560 nm och λ em = 590 nm med en plattläsare (överst behandlingen).
4. Crystal Violet färgning protokoll för biomassa Kvantifiering av Biofilmer Använda samma platta som i steg 3
- Ta bort resazurin fläcken försiktigt från brunnarna med en multikanalpipett.
- Fäst biofilmer med 200 pl metanol under 15 min.
- Låt plattan lufttorka i 10 min.
- Lägg 190 pl 0,02% (vol / vol, utspädda i avjoniserat vatten) kristallviolettlösning, försiktigt med en flerkanalspipett. Undvik att röra vid sidorna av brunnarna med fläcken medan pipettering och förhindra uppkomsten av luftbubblor genom att inte trycka på pipetten för att slutföra blow-out.
- Inkubera det i 5 minuter vid RT.
- Ta bort fläcken försiktigt med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tvätta det två gånger med avjoniserat vatten (200 | j, l varje gång).
- Låt brunnarna torka i 5 minuter vid RT och lös den återstående fläckeni 96% etanol eller 33% ättiksyra.
- Inkubera det under 1 h vid RT och läs av absorbansen vid 595 nm.
5. Utvärdering av bakteriedödande effekt på Plankton Bakterier Använda samma prov Plate som för Biofilmer
- Mäta grumlighet vid 595 nm av plattan med den planktoniska lösningen från 3,3.
- Färga plankton bakterier med resazurin genom att tillsätta 10 pl av resazurin lager per brunn. Blanda väl genom pipettering.
- Inkubera det i mörker vid RT under cirka 5 min, tills de obehandlade kontrollerna är jämnt rosa.
- Mät fluorescens vid λ exkl = 560 nm och λ em = 590 nm.
6. vetegroddsagglutinin Färgning för Matrix kvantifiering och fluorescensmikroskopi avbildning av Biofilmer
- matris kvantifiering
- Förbereda en 5 | j, g / ml lösning av WGA sonden i steril PBS.
- Använd en parallell prov plate för denna färgning. Avlägsna plankton lösningen från brunnarna och tvätta en gång med steril PBS (200 pl per brunn), försiktigt med en flerkanalspipett utan att vidröra biofilmer.
- Tillsätt 200 pl av WGA-lösning per brunn som skall färgas.
- Inkubera det i mörker vid 4 ° C under 2 h.
- Ta bort obundna fläcken genom att tvätta brunnarna med 200 pl PBS tre gånger.
- Låt plattan torka i 15 min vid RT.
- Upplösa den bundna fläck i 33% ättiksyra, med användning av 200 pl per brunn.
- Försegla brunnarna med remsor locken och låt ligga dem med hjälp av ett vattenbad sonikator i 30 sek vid RT och 40 kHz.
- Inkubera plattan under 1 timme vid RT.
- Upprepa sonikeringssteg. Brunnarna kan vara förseglad mellan sonication steg.
- Mät fluorescens vid λ ex = 495 nm och λ em = 520 nm med en plattläsare (överst behandlingen).
- Visualisera matrisen medfluorescensmikroskopi
- Använd samma protokoll som ovan tills steg 6.1.6.
- Efter torkningssteget, visualisera proverna med ett fluorescensmikroskop, med användning av ett FITC-filter (eller en annan lämplig grön excitationsfilter).
7. Färgning Viabla och döda celler inom Biofilmer för Imaging med fluorescensmikroskopi och kvantifiering av signalen för grön-till-röd-förhållande (G / R)
- Avbildning med fluorescensmikroskopi
- Bered en lösning av varje prob (en färgningslivskraftiga celler och de andra en färgnings döda celler), enligt tillverkarens anvisningar.
- Avlägsna planktonlösning från brunnarna och tvätta en gång med steril PBS (200 | il per brunn) med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tillsätt 6 pl av färgningslösningen per brunn.
- Inkubera plattan i mörker under 15 min.
- Innan mikroskopi, ta bort överflödig vätska manuellt med hjälp av en flerkanalspipett.
- Fånga bilder med hjälp av ett fluorescensmikroskop, med hjälp av till exempel en FITC-filter (för grön fluorescens, livsdugliga celler) eller en TRITC filter (röd fluorescens, döda celler).
- Kvantifiering av signalen som en grön-till-röd-fluorescensförhållandet (G / R)
- Följ samma protokoll som i steg 7.1.1 och 7.1.2.
- Tillsätt 200 pl av färgningslösningen per brunn och inkubera dem i 15 min i mörker.
- Mät fluorescensen med en plattläsare vid excitation / emissionsvåglängder 485/535 nm och 485/635 för grön och röd fluorescens, respektive (topp läsning).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den föreslagna plattformen är effekterna på lönsamheten, biomassa och biofilm matris kvantifieras. I arbetssekvensen (figur 1), är en provplatta färgas med resazurin och därefter med kristallviolett för att samtidigt utvärdera effekterna på bakteriell biofilm livskraft och om total biofilm biomassa. Båda analyserna kan utföras efter varandra i samma platta, eftersom det visades tidigare att en första färgning med resazurin hade ingen statistiskt signifikant effekt på kristallviolett färgning resultat (p = 0,4149 för jämförelse av maximal signal absorbansenheter mellan kristallviolett plattor färgas separat eller efter resazurin-färgning, n = 20) 26. Effekten på plankton bakterier kan samtidigt utvärderas.
När träffar identifieras antingen livskraft eller biobränslebaserad analys är en andra platta st ained med WGA sond för att kvantifiera effekten av föreningarna på polysackaridkomponenten (PNAG) av biofilmen matrisen. Detta arbetsflöde kan appliceras på screening av kemiska bibliotek, samt funktionella uppföljningsstudier för potens mätningar av träff föreningar, såsom exemplifieras nedan.
Figur 1: Workflow av de tre-analysplattform. Schematisk representation av arbetsflödet som kombinerar de tre analyser på biofilm prover. Plattformen omfattar färgning för en effekt på lönsamheten, biomassa och EPS skikt; avbildning med fluorescensmikroskopi; och utvärdering av effekten på planktonfasen. "A" och "NA" står för "Active" och "Ej aktiv" respektive. Modifierad från Skogman et al. 26jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utförande av tre analysplattform för screening
Här är två screening körningar visas som representativa resultat av utförandet av plattformen. I den första kampanj (fig 2A), var ett litet bibliotek med cinchona alkaloidderivat screenas för anti-biofilm aktivitet mot S. aureus biofilmer 27, medan i det andra exemplet (figur 2B), en naturlig och naturligt inspirerade bibliotek av abietane-typ diterpenoider och derivat undersöktes 28,29. De aktiva träffar bestämdes med användning av de beräknade träff gränser (trösklar, Ekvation 6, tabell 1). I varje screening studie, resultaten från de två första analyserna korrelerade mycket väl; träffarna var alla kunna minska lönsamheten och biofilmen biomassa, wedan de inaktiva föreningarna visade ingen effekt på vare analysen. Alla identifierade träffar testades sedan på den tredje (WGA) -analys, men de hade inga matris-demontering (eller matrisnedbrytande) effekter (resultaten visas inte).
Figur 2: Representativa resultat av screening kampanjer med plattformen med S. aureus biofilmer. Två exempel på proof-of-concept validerings skärmar utförs med hjälp av analysplattform. Resultaten presenteras som en procent av den obehandlade biofilm kontroll, är träff föreningar markerade med rött, och linjerna representerar de beräknade träff gränser. (A) screening av en kina-alkaloidderivat bibliotek identifierat en aktiv förening. (B) Screening av ett bibliotek av abietane typ diterpenoider och derivat identifierade fem handlingive föreningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Utförande av tre analysplattform för uppföljande studier
Representativa resultat kan ses i figur 3, där två kända antibiotika testades vid ett mycket brett intervall av koncentrationer (0,5 nM-5 mM) mot S. aureus biofilmer. Minsta hämmande koncentration (MIC) värden för referensföreningar mot plankton bakterier (antingen från litteraturen eller utförs i labbet) tjänar som riktlinjer för att välja koncentrationerna för att testa mot biofilmer av samma art. Dessutom kan kunskap om koncentrationsvärdena i vilka ingen cytotoxicitet detekteras i däggdjursceller också hjälpa till i valet av koncentrationen för att testa anti-biofilm uppföljningar. Helstom båda antimikrobiella och cytotoxiska data för en viss förening finns, kan en parameter som kallas "biokompatibilitet Index" (BI) beräknas, enligt definitionen Müller och Kramer 30. Här, var MIC-värden mot plankton S. aureus för penicillin G och ciprofloxacin bestämdes till 0,04 | iM och 6 ^ M, respektive (resultat ej visade). Således koncentrationsintervall varierade från ca 10 5 x MIC till 10 -2 x MIC och 10 3 x MIC till 10 -4 x MIC för penicillin och ciprofloxacin, respektive. Båda antibiotika skulle avsevärt minska lönsamheten, biomassa och biofilm matris PNAG innehåll när de utsattes för encelliga bakterier innan inledandet av biofilm bildningsprocessen (figur 3a). Trots den mycket höga koncentrationen av antibiotika som testades på förformade (18 h) biofilmer, livskraft och biomassan var bara reduceras till cirka 50% av tslang av obehandlade biofilmer (figur 3B). Den mest framträdande resultatet här var ökningen av biofilmen matrisen (till över 200%) när förformade biofilmer behandlades med höga koncentrationer av penicillin G. Inga ändringar i innehållet i biofilmen matrisen upptäcktes när förformade biofilmer behandlades med ciprofloxacin.
Figur 3: Exempel på en uppföljande studie av anti-biofilm effekter med hjälp av två modell antibiotika mot S. aureus biofilmer. Effekterna av penicillin G och ciprofloxacin presenteras här: (A) före biofilmbildning (förexponering) och (B) post-biofilmbildning (efterexponering). För figur klarhet, endast den lägsta och den högsta koncentrationen som testades visas. Standardavvikelserna inte överstiger 20%. *** EQUAls p <0,01. Modifierad från Skogman et al. 26 klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Fluorescensmikroskopi-baserade Imaging
Resultatet att penicillin G vid 400 | iM (såväl som högre koncentrationer, såsom visas i figur 3b) dödar ca 50% av den förformade S. aureus biofilm bakteriepopulation bekräftades med en annan viabilitetsfärgning analys. Genomsnittet av de gröna till röd (G / R) fluorescensförhållanden för de obehandlade biofilm brunnarna var 2,75, vilket tyder på en dominans av levande (grön-färgade celler), över döda (röd-färgade celler). Men i penicillinbehandlade celler i G / R-förhållandet minskade till 1,54, vilket motsvarar 56% av kontrollbrunnarna. Cellerna återstående liv efter penicillinbehandling proproduceras en betydligt större mängd EPS, som bedöms från den detekterade ökningen i grönt (WGA) fluorescens jämfört med obehandlade biofilmer (figur 4b). Vi rekommenderar, när det är möjligt, att utföra dessa avbildningsbaserade experiment för att ytterligare bekräfta resultaten av plattformen, särskilt under det skede av karakterisering av träff kandidater.
Figur 4: Fluorescensmikroskopi. Effekten av penicillin tillsats (400 M) på lönsamhet och EPS produktion visas här. De översta bilderna (A) motsvarar obehandlade biofilmer och penicillinbehandlad biofilmer, där levande celler färgas grön och döda celler färgas röd. Den infogade Diagrammet visar beräkningar av G / R fluorescensförhållanden. Botten bilder (B) motsvarar obehandlade biofilmer och penicillin-behandlade celler färgade med WGA sonden. Den infogade diagrammet visar kvantifiering av WGA signaler för behandlade och obehandlade biofilm prover, och felstaplar representerar standardavvikelser. Modifierad från Skogman et al. 26 klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Databehandling och statistisk analys
Statistiska parametrar beräknas för att karakterisera kvaliteten hos analyserna och att följa deras prestanda under screeningskörningar. Ekvationerna för de viktigaste parametrarna som används, såväl som de erhållna och målvärdena, redovisas i Tabell 1. I alla ekvationer, SD min, μ min, SD max, och p max representerar standardavvikelser och hjälp av minimala(Min) och maximal (max) signaler, respektive. I de resultat som visas här, parade jämförelser av de ursprungliga värdena gjordes med ett oparat t-test med Welch korrigering, där p <0,05 ansågs vara statistiskt signifikant.
Tabell 1: Statistiska parametrar som används för att utvärdera resultatet av analyserna. I alla ekvationer, SD min, μ min, SD max, och p max representerar standardavvikelser och medlen för minimal (min) och maximal (max) signaler, respektive. De färgningsmetoder, resazurin, kristallviolett, och vetegroddagglutinin, är förkortade RES, CrV, och WGA, respektive. RFU: relativa fluorescensenheter; RAU: relativa absorbansenheter. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns ingen enskild metod som samtidigt kan mäta effekten av en förening på lönsamheten, biomassa och biofilm matris. Därför finns det ett behov av att kombinera analyser för att detektera en effekt på de tre slutpunkter, företrädesvis vid en primär screening skede.
Resazurin är en mycket enkel färgningsprotokollet som endast består av tillsatsen av redox-proben. Det är dock avgörande för framgången av denna analys upprättandet av optimala inkubationstiden av biofilmer med resazurin. I vissa bakteriestammar, sker en minskning av resazurin sonden till rosa, fluorescerande resorufin mycket snabbt, medan det i andra fall kan pågå i flera timmar 19. Dessutom inom samma bakteriestam, kan det också finnas betydande skillnader mellan planktonbakterier och biofilm. De plankton bakterierna oftast mer lätt att nå, främst på grund av bakterietäthet är lägre i plankton populationer än i biofilm populations, vilket främjar snabbare omsättning av reaktionen. I en publicerad jämförelse av biofilm viabilitetsfärgning sonder, var resazurin slutsatsen att vara en av de mest exakta, enkla att använda och minst kostsamma analyser 19. Dessutom har det visat sig vara tillämpbar på en rad av bakterie- och svampliknande organismer 19. Å andra sidan, är den kristallviolett-analysen det mest använda för biofilm mass kvantifiering 19,32,33. De mest kritiska stegen i detta protokoll är tillägg och avlägsnande av kristallviolett fläcken lösning. Dessa steg måste utföras mycket försiktigt för att undvika ospecifik färgning (t.ex. på grund av droppar fläck på väggarna i brunnarna). En av de viktigaste fördelarna med att använda resazurin som första färgnings analysen är det faktum att det är icke-toxiska för cellerna, vilket möjliggör användning av samma platta för kristallviolett färgning. Kombinationen av de båda analyserna förenklar betydligt arbetsflödet, sänker kostnaderna, sparar konsumables, och minimerar användningen av testföreningarna, vilket är särskilt värdefullt i en screeningmiljö.
Såsom angivits tidigare är egenproducerade extracellulär polysackarid matris en viktig del av biofilmer. För att mäta matris innehåll (särskilt viktigt polysackarider), var en tredje analys ingår här, baserad på fluorescensmärkt WGA. Ursprungligen WGA kvantifiering beskrevs som en enzymkopplad lektin-sorbent assay (ELLA) 24. En liknande analys baserad på färgnings glykosaminoglykaner (GAG) i matrisen av S. aureus-biofilmer med dimetylmetylen blå (DMMB) har också använts 31,34. GAG liknar de polysackarid intercellulära adhesiner (Pias) som finns i matrisen av Staphylococcus spp. biofilmer 35. WGA-analysen på liknande mål PIA, men WGA mer specifikt binder till poly-N-acetyl-glukosamin-rester, som spelar en viktig roll i biofilmen matrisen 36 </ Sup>. Targeting matrisen är av stor betydelse på grund av det faktum att biofilmer lätt kan regrow om matrisen är kvar efter en kemisk eller antibiotikabehandling. Bakterier kan också lättare fästa till en yta som är matris pre-belagda 35. Det har visat sig att vissa antibiotika effektivt kan sänka lönsamheten och biofilm biomassa, men utan någon effekt på matrisen. I våra experiment, är detta exemplifieras av fallet med ciprofloxacin 31. Vissa antibiotika kan även öka matrisproduktion, vilket visas här med penicillin G 26. Baserat på dessa förändringar, kan antibiotika delas in i de kategorier som anges i tabell 2. Alla träffar i vår screeningstudier (Figur 2) kan klassificeras tillsammans med ciprofloxacin, som föreningar som dödar bakterierna i biofilmen och minskar biomassan men inte isär eller störa biofilmen matrisen.
| Kategori | Effekt på bakterier | Påverkan på matris | Exempel antibiotikum (mål biofilm) | Referens |
| 1 | ingen | ingen | ampicillin (SA) | (Toto et al. 2009) |
| 2 | ingen | - | cefalotin (SA) | (Toto et al. 2009) |
| 3 | - | ingen | polymyxin (SA) | (Toto et al. 2009) |
| 4 | - | - | kanamycin (PA) | (Toto et al. 2009) |
| ciprofloxacin (SA) | (Skogman et al. 2012) | |||
| 5 | - (+) | - | doxycyklin (PA) | (Toto et al. 2009) |
| 6 | - | + | penicillin G (SA, EG) | (Skogman et al. 2012) |
Tabell 2: Klassificering av antibiotika. Antibiotika är indelade i kategorier baserat på deras effekt på lönsamheten av biofilmbakterier (med resazurin färgning) och matrisen (med WGA eller dimetylmetylen blå (DMMB) färgning). SA: Staphylococcus aureus; PA: Pseudomonas aeruginosa; EG: Escherichia coli. Modifierad från Tote et al. 31
Dessutom är denna plattform idealisk för att utföra primära screeningkampanjer. Den mest kostnadseffektiva och tidseffektiv strategi är att tillämpa resazurin och kristallviolett baserade analyser som en primär strategi och gå vidare till WGA-matrisen analys i andra rangens (uppföljning) studier. Detta beror på det faktum att WGA sonden är ganska dyrt och att denna analys består av flera steg, vilket gör det mer arbetskrävande och tidskrävande.
En relevant egenskap hos denna plattform är möjligheten att utvärdera de långsiktiga effekterna av de identifierade antibiotika. Långsiktiga kemoterapeutiska effekter kan endast uppnås om biofilmen matrisen demonteras. Det har visat sig att risken för återupplivning av biofilmen infektion är mycket högre om matrisen är kvar. Med denna plattform, är det möjligt att först bedöma om den övergripande biofilm biomassa påverkas med hjälp av kristallviolett färgning. En mer dETALJERAD bedömning av biofilm matris polysackarider, med hjälp av WGA-analysen, kan följa. Notera dock att sannolikheten för att identifiera en enda molekyl som kan både ta isär matrisen och utöva antibakteriella (biocid) effekt kan betraktas som låg. Faktum är att hittills de enda föreningar av denna typ som vi har identifierat är antimikrobiella peptider 37. Att ta itu med detta, är uppföljningar utförs i denna plattform med antingen resazurin- eller kristallviolett-aktiva träffar, eftersom denna strategi medger identifiering av föreningar med separat biocidala eller matris-nedbrytande aktivitet. Sådana ledningar kan vara potentiellt intressant för flerkomponent strategier. En kombination av matrisnedbrytande molekyler med biocid eller antibiotika-föreningar förväntas ge mer effektiv bekämpning biofilm.
Sammanfattningsvis, plattformen som presenteras här ger en god grund för anti-biofilm screening med hjälp av mätningar livskraft och biomassa tillsammans med matris quantifining och visualisering. Både resazurin och kristallviolett färgning analyser kan också användas för andra typer av biofilm- bildar mikroorganismer. Dessa analyser kräver separat optimering för både växande och färgningsförhållanden. Tillämpligheten av WGA färgnings analysen är begränsad till de bakterier i vilka poly-N-acetyl-glukosamin är en huvudkomponent av biofilmen matrisen. Andra matris kvantifiering analyser (såsom en baserad på dimetyl-metylenblått färgning) kan tillämpas i andra fall. Sammantaget analyserna i denna plattform är ganska lätt att utföra, och alla reagens är lätt tillgängliga, liksom generellt prisvärd. Denna plattform är lämplig för låg- till medel genomströmning anti-biofilm screening utan behov av kostsamma investeringar i utrustning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Paul Cos och LMPH, University of Antwerp, Belgien för hans stöd under inspelningen processen i sitt laboratorium. Detta arbete har finansierats av Finlands Akademi projekt (projekt 272.266 och 282.981) och Svenska Tekniska Vetenskapsakademien i Finland. De tekniska bidragen från MSc Janni Kujala erkänns.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resazurin | Sigma Aldrich | R7017 | |
| Crystal violet | Sigma Aldrich | HT90132 | |
| Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | W11261 | |
| LIVE/DEAD BacLight | Molecular Probes | L7012 | SYTO 9 for staining viable cells green and propidium iodide for staining dead cells red |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Tryptone soy agar | Lab M, Neogen | LAB011 | |
| Tryptine soy broth | Lab M, Neogen | LAB004 | |
| F96 Well Plate Polystyrene Sterile Clear Flat bottom | Thermo Fisher Scientific | 161093 | |
| BRAND caps, strips of 8 | Sigma Aldrich | BR781413-300EA | |
| Branson CPX series ultrasonic bath | Sigma Aldrich | Z769428-1EA | |
| Multipipette | Thermo Fisher Scientific | ||
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Biomek 3000 | Beckman Coulter | ||
| Varioskan Flash Multiplate reader | Thermo Fisher Scientific | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | 25923 |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Dufour, D., Leung, V., Lévesque, C. M. Bacterial biofilm: structure, fuction, and antimicrobial resistance. Endodontic Topics. 22, 2-16 (2012).
- Donne, J., Dewilde, S. The Challenging World of Biofilm Physiology. Adv. Microb. Physiol. 67, 235-292 (2015).
- Otto, M. Staphylococcal infections: mechanisms of biofilm maturation and detachment as critical determinants of pathogenicity. Annu. Rev. Med. 64, 175-188 (2013).
- Cos, P., Tote, K., Horemans, T., Maes, L. Biofilms: an extra hurdle for effective antimicrobial. Curr. Pharm. Des. 16, 2279-2295 (2010).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21, 466-474 (2013).
- Lewis, K. Persister cells. Annu. Rev. Microbiol. 64, 357-372 (2010).
- Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J. Bacteriol. 192, 6191-6199 (2010).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. J. Microbiol. Methods. 70, 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nat. Protoc. 4, 783-788 (2009).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. J. Microbiol. Methods. 102, 55-64 (2014).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nat. Protoc. 5, 1236-1254 (2010).
- Konrat, K., et al. The Bead Assay for Biofilms: A Quick, Easy and Robust Method for Testing Disinfectants. PLoS One. 11, e0157663 (2016).
- Cragg, G. M., Newman, D. J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochim Biophys Acta. 1830, 3670-3695 (2013).
- Sandberg, M. E., et al. Pros and cons of using resazurin staining for quantification of viable Staphylococcus aureus biofilms in a screening assay. J. Microbiol. Methods. 78, 104-106 (2009).
- Mariscal, A., Lopez-Gigosos, R., Carnero-Varo, M., Fernandez-Crehuet, J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 773-783 (2009).
- Peeters, E., Nelis, H., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. J. Microbiol. Methods. 72, 157-165 (2008).
- Pettit, R., Weber, C., Pettit, G. Application of a high throughput Alamar blue biofilm susceptibility assay to Staphylococcus aureus biofilms. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 8 (28), (2009).
- Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation. J. Microbiol. Methods. 40, 175-179 (2000).
- Stiefel, P., et al. Is biofilm removal properly assessed? Comparison of different quantification methods in a 96-well plate system. Appl. Microbiol. Biotechnol. , (2016).
- Sandberg, M., Määttänen, A., Peltonen, J., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Automating a 96-well microtitre plate model for Staphylococcus aureus biofilms: an approach to screening of natural antimicrobial compounds. Int. J. Antimicrob. Agents. 32, 233-240 (2008).
- Thomas, V. L., Sanford, B. A., Moreno, R., Ramsay, M. A. Enzyme-linked lectinsorbent assay measures N-acetyl-D-glucosamine in matrix of biofilm produced by Staphylococcus epidermidis. Curr. Microbiol. 35, 249-254 (1997).
- Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34, 1-4 (2007).
- Skogman, M. E., Vuorela, P. M., Fallarero, A. Combining biofilm matrix measurements with biomass and viability assays in susceptibility assessments of antimicrobials against Staphylococcus aureus biofilms. J. Antibiot. Tokyo. 65, 453-459 (2012).
- Skogman, M. E., et al. Evaluation of antibacterial and anti-biofilm activities of cinchona alkaloid derivatives against Staphylococcus aureus). Nat. Prod. Commun. 7, 1173-1176 (2012).
- Fallarero, A., et al. (+)- Dehydroabietic Acid, an Abietane-Type Diterpene, Inhibits Staphylococcus aureus Biofilms in Vitro. Int J Mol Sci. 14, 12054-12072 (2013).
- Manner, S., et al. New derivatives of dehydroabietic acid target planktonic and biofilm bacteria in Staphylococcusaureus and effectively disrupt bacterial membrane integrity. Eur. J. Med. Chem. 102, 68-79 (2015).
- Muller, G., Kramer, A. Biocompatibility index of antiseptic agents by parallel assessment of antimicrobial activity and cellular cytotoxicity. J. Antimicrob. Chemother. 61, 1281-1287 (2008).
- Toté, K., et al. Inhibitory efficacy of various antibiotics on matrix and viable mass of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 525-531 (2009).
- Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L. A. Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2950-2958 (2002).
- Li, X., Yan, Z., Xu, J. Quantitative variation of biofilms among strains in natural populations of Candida albicans. Microbiolog. 149, 353-362 (2003).
- Barbosa, I., et al. Improved and simple micro assay for sulfated glycosaminoglycans quantification in biological extracts and its use in skin and muscle tissue studies. Glycobiology. 13, 647-653 (2003).
- Toté, K., Vanden Berghe, D., Maes, L., Cos, P. A new colorimetric microtitre model for the detection of Staphylococcus aureus biofilms. Lett. Appl. Microbiol. 46, 249-254 (2008).
- Arciola, C. R., Campoccia, D., Ravaioli, S., Montanaro, L. Polysaccharide intercellular adhesin in biofilm: structural and regulatory aspects. Front Cell Infect Microbiol. 5 (7), (2015).
- Ausbacher, D., et al. Staphylococcus aureus biofilm susceptibility to small and potent beta(2,2)-amino acid derivatives. Biofouling. 30, 81-93 (2014).
