Introduction
التوصيف المظهري من مجموعات متحولة منهجي من الكائنات النموذج هو نهج ثبت لتشريح تعقيد الخلوية. وفرداني وحيدة الخلية الخضراء الطحالب كلاميدوموناس reinhardtii يحتوي على مجموعة الجينات مثل النباتات، لكنها اختلفت من النباتات البرية قبل الازدواجية الجينوم متعددة في النسب نبات الأرض 2. من حيث المبدأ، وعدم الازدواجية الجينات ودورة الحياة أساسا فرداني يسهل إلى حد كبير النهج الوراثية الخسارة من وظيفة. ومع ذلك، واختلال الموجهة للجينات من الاهتمام يكاد يكون من المستحيل نظرا لعدم وجود كفاءة التكامل الجيني مثلي. مكتبة تعطل إقحامي عشوائية قيد الإنشاء، جنبا إلى جنب مع تحديد الموقع تعطلت، مما أسفر حتى الآن مجموعة العريض من 1،935 اضطرابات معين يمثل 1،562 الجينات 3. ومع ذلك، فإن هذا النهج (من المتوقع في عام لإنتاج طفرات فارغة) لا ينطبق على الجينات الأساسية. درجات الحرارة الحساسة (TS) الطفرات يمكن recovereد في الجينات الأساسية، والطرق الحديثة تسمح تحديد كفاءة من هذا الجين المتحور والآفة المسببة. تحليل المظهري في درجة حرارة عالية ثم يقدم معلومات فورية حول وظيفة الجين المتحور. وذكرت لنا على عزل وتوصيف الطفرات المميتة TS في ~ 70 جينات أساسية في كلاميدوموناس، مع التركيز بصفة خاصة على الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية والسيطرة على 1،4.
وكانت شاشات المميتة نهاية الخبر الدعامة الأساسية للتحليل الجيني في الكائنات الحية الدقيقة لعقود 5،6. من حيث المبدأ، وهذه سمة مرغوب فيه هو نهج "التشبع"، وهذا يعني أن كل الجينات قادرة على التحور إلى تضمنته الفتك يتم تحديدها من قبل متحولة واحد على الأقل، مما يسمح للتحليل كامل. ومع ذلك، في الواقع، هناك عدة عوامل تحد من نهج إلى التشبع. أولا، في حين أن جميع الجينات تقريبا يمكن أن تحور إلى فقدان النشاط في درجة حرارة عالية، وكفاءة استرداد هذه المسوخ تختلف باختلاف ما لا يقل عنأمر من حجم 7،8. لذلك، تبدأ شاشة عشوائية لالتقاط الزيارات المتكررة في "المسافرين الدائمين" قبل فترة طويلة واقترب التشبع. ثانيا، في حين نهاية الخبر الطفرات عادة ما تؤدي إلى الحد من وظيفة، فإنها قد لا تكون بلا قيم حقيقية في درجة حرارة المقيدة (وعلى العكس، هي في كثير من الأحيان لا تعمل بكامل طاقتها في درجة الحرارة المسموح بها). يمكن التعامل مع هذه المشكلة إلى حد ما مقارنة الأليلات متعددة؛ إذا كانت كل مشاركة النمط الظاهري مشترك، وهذا هو الأرجح أن تعكس نتيجة لتعطيل بسيط من الجين. الأليلات متعددة قد تكون مفيدة أيضا للغاية لتحديد الجزيئي نهائي الآفة المسببة 1. ومع ذلك، فإن "المسافر الدائم" المشكلة يعني أن الأليلات متعددة في الجينات نادرا ما تصيب يمكن أن يكون من الصعب التعافي.
لهذه الأسباب، لقد تم تطوير خط أنابيب معززة لعزل وتوصيف المسوخ نهاية الخبر ظاهريا. لقد جمعنا أكثر من 3،000 نهاية الخبر المسوخ حتى الآن، طالتسبب حوالي 200 الطفرات دورة الخلية مرشح جديدة. التحليل الجزيئي والمظهرية لهذه المجموعة، والتي من المرجح بالفعل تشمل الطفرات في معظم أو جميع مسارات الخلية الأساسية، ينبغي أن تقدم رؤى ونظريات جديدة في علم الأحياء الخلية النباتية. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الخط إلى أي الكائنات الحية الدقيقة التي تنمو على أجار لبناء بكفاءة نهاية الخبر مجموعات متحولة.
مذكرة بشأن المعدات: اثنين من الروبوتات هي مهمة جدا لتحقيق الكفاءة في هذا الإجراء (منقار مستعمرة ومجموعة متماثلة منقار بلاتر / الكرز). جامعي وعادة ما يكون المسامير المعدنية. وتعقد المستعمرات التقطت في الهواء على هذه المسامير لفترة (ثواني إلى دقائق، اعتمادا على نموذج). يموت كلاميدوموناس في حوالي 20 ثانية على مسمار معدني في الهواء. هذا يقيد اختيار نموذج للكائن. المسائل دقة. لدينا منقار مستعمرة دقيقة إلى حد معقول. ومع ذلك، فمن عنيفة بعض الشيء في عملها وبعض إمكانية لانتقال التلوث القائم على الرش. لم يتم استخدامه على ارتفاعإيه من 384 الكثافة (4.5 ملم تباعد مركز الوسط)؛ في هذه الكثافة، ودقة مقبولة تماما. واختيار الروبوت الطلاء طبق الأصل / الكرز (التجهيزات المختلفة المستخدمة لهذه التطبيقات) أبطأ بكثير في قطف، ولكن ليس دقيقا بما فيه الكفاية لكثافة 1536 (6144 يشكل تحديا، وحتى بالنسبة لهذا الروبوت دقيقة للغاية، ونحن قمنا بتقييم هذه الكثافة ولكن لم يتم انتخاب لاستخدامه بسبب الصعوبات التي تواجهها مختلف). الروبوت سوف لا تعمل بشكل جيد إذا تم تحميلها لوحات بشكل غير متساو، وما إلى ذلك. ومن المهم أن بقعة تحقق للتأكد من أن الأمور في نصابها الصحيح تحدث. وبطبيعة الحال، سيتم تشغيل الروبوت غير المراقب وبشكل عام، كل سوف تسير على ما يرام إذا كانت لوحات القليلة الأولى الصحيحة.
Protocol
1. الأشعة فوق البنفسجية الطفرات
- إعداد مجموعة من 100-200 لوحات أجار مستطيلة مع تريس، خلات-الفوسفات (وات) متوسطة 9،10. إعداد هذه اللوحات قبل بضعة أيام، والاحتفاظ بها على مقاعد البدلاء لتجف لضمان الاستيعاب السريع للخلايا معلقة في الخطوات التالية.
- ثقافة كلاميدوموناس خلايا تصل إلى 0،2-0،5 الكثافة الضوئية (OD 750؛ ~ 2 أيام) في 100 مل من TAP السائلة تحت الضوء، عند 25 درجة مئوية، واهتزاز في 100 دورة في الدقيقة.
يتم تنفيذ الطفرات الأشعة فوق البنفسجية بشكل مستقل في اثنين من خلفيات وراثية: ملاحظة Mat- الرطوبة ص (يمنح مقاومة لهيغروميسين B) ومات + بارو ص (يمنح مقاومة لباروموميسين). اختيار المضادات الحيوية هو إجراء تعسفي، شريطة أنواع التزاوج بينهما المقاومة المخدرات التكميلية. - تحقق عينة من كل الثقافات تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا هي قابلة للحياة وصحية (السباحة وسليمة)، وبدون تلوث.
ملاحظة: الثقافات متضخمة "تحطم" وتفقد قدرتها على البقاء، يبدو وكأنه "أشباح" في المرحلة المجهري التباين. لا تبقي الثقافات شاكر الذهاب بمجرد وصولها إلى التشبع. و"الأشباح" الظاهرة يمكن اكتشافها بسهولة في الخطوة 1.3. - تمييع الثقافة إلى 0.003 OD 750. التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم لضمان كثافة متجانسة، كما كانت السلالة متحركة وتسبح إتجاهي في استجابة للضوء.
- ضبط كثافة تعليق على أساس جرعة الأشعة فوق البنفسجية المخطط لها، بحيث يمثل قتل الخلية، 200 - 600 والمستعمرات الناجين تتشكل على لوحات (الشكل 1). انظر الجدول رقم 1 للحصول على معلومات حول مرات التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
- إرفاق كاسيت أنبوب صغير يناسب موزع السائل وتنفيذ سلسلة من يغسل للتعقيم، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، لمنع التلوث.
- باستخدام السائل موزع 8 × 12، الاستغناء عن 4 × 96 قطرات من 2 ميكرولتر كل على لوحات مستطيلة الشكل (1
- لضمان انتشار الخلايا حتى للغاية واحدة، واستخدام لوحات الجافة، كما ذكر أعلاه، وسرعان ما تغطي لوحات لمنع الخلايا من السباحة في الاستجابة للضوء. يحافظ على لوحات مغطاة وفي الظلام حتى يتم امتصاص جميع السوائل.
- من أجل ضمان أقصى قدر من قوة من الأشعة فوق البنفسجية مع أي الارتداد بسبب الحمض النووي للضوء يعتمد إصلاح 11،12، والعمل في الظلام في هذه الخطوة وعلى الفور حزمةلوحات في مربع مظلم بعد التشعيع.
ملاحظة: والسبب في ذلك الطلاء الثانوي هي أن نهاية الخبر المسوخ قاتلة يمكن في بعض الحالات تتراكم الكتلة الحيوية كبيرة، حتى لو تم القبض على الخلايا في دورة الخلية الأولى بعد الطلاء. يلغي النسخة المتماثلة الثانوي هذه الإشارة، ويزيد من حساسية.
ملاحظة: حضانة مرات مختلفة تستخدم لمعادلة النمو منذ النوع البري ينمو بشكل كبيرأسرع في 33 درجة مئوية مما كانت عليه في 21 درجة مئوية.
2. تحديد المرشحين متحولة TS: شاشة الأولى
- معالجة يقترن 21/33 الصور لوحة مع العرف ماتلاب صورة برامج التحليل للقضاء على خلفية وشريحة الصور في 1536 صفيف. وسيقوم البرنامج تحديد الكتلة الحيوية الكشف عن (مجموع كثافة بكسل) في كل موقف (الشكل 5).
ملاحظة: سوف يقوم البرنامج (المنصوص عليها في SI جنبا إلى جنب مع تعليمات) استخدام صورة شبكة لوحة لتحديد المواقع من الخلايا (الإدخالات الفردية) في 1536، مجموعة في التكبير ولوحة المحاذاة المستخدمة وحساب مجموع كثافة بكسل في كل خلية . ثم تتم مقارنة هذه القيم لكل متحولة ضد المعلمات قابل للتعديل لتحديد النمو المطلوب في 21 درجة مئوية نسبة إلى نهاية الخبر + القياسية ودرجة حرارة عالية الحساسية، وتعرف بأنها: S (موت 33) / S (WT 33) / S (موت 21) / S (WT 21)، حيث S هو إشارة (بكسل فيتوتر بعد الطرح الخلفية)، موت هو متحولة الفردية، و "WT" مستعمرة غير درجة الحرارة حساسة اختيارها عشوائيا (mutagenized السلالة التي كان الخبر + النمط الظاهري). ويعرف النمو في 21 درجة مئوية كما S (موت 21) / S (WT 21). في هذه الشاشة الأولى، وتطبيق معايير الاختيار استرخاء (السماح النمو المنخفض نسبيا في 21 درجة مئوية، ودرجة منخفضة نسبيا من حساسية درجة الحرارة) للحفاظ على كاذبة سلبي أدنى سعر. - تحميل قائمة من المستعمرات المختارة التي يولدها البرنامج كملف التعليمات للمستعمرة واحدة اختيار الروبوتات (عادة في 384 مجموعة). إعداد لوحات المصدر والهدف وفقا للتعليمات الروبوتات واختيار المستعمرات لمجموعة (الشكل 6).
ملاحظة: جامعي التقليدية تتطلب ملف التعليم في بعض الشكل، مثل csv. و txt،. أو xls. وكل جامعي لديها القدرة على أن تكون مدفوعة ملف. سيتطلب أشكال مختلفة بتحرير طفيفة من قانون MATLAB (شفرة المصدر المقدمة). وضع لوحات هدف في 21 درجة مئوية حاضنة لل~ 5 أيام لتنمو لوحة الأسهم.
3. تحديد نهاية الخبر المسوخ: شاشة الثانية
- كرر الخطوة 2.1 لإعادة اختبار المستعمرات المقطوفة. عادة 30 - 50٪ من المستعمرات وإعادة اختبار نهاية الخبر اضحة المميتة، لالعائد من 2٪ - 5٪ نهاية الخبر المميتة بالنسبة إلى المستعمرات الأولية على قيد الحياة الطفرات الأشعة فوق البنفسجية.
- كرر الخطوة 2.2 لالتقاط نهاية الخبر المميتة فحص مرتين، ولكن مع ملف تعليمات معدلة تهدف إلى المستعمرات مجموعة إلى كتل من 100 المستعمرات على لوحات مستطيلة في الكثافة 384. هذا هو للفحص المجهري مريحة في الخطوة التالية. يتم تحديد شكل ملف التعليمات في وقت التشغيل بواسطة رمز MATLAB.
- تأكد من تضمين عدة مستعمرات WT كوسيلة لمراقبة ووضع لوحات على 21 درجة مئوية لمدة 5 أيام ~.
4. تحديد النمط الظاهري الأولي
- تكرار لوحات 100 كتلة المحتشدة في الخطوة 3.2 ووضعها في 21 ° C incuباتور ل~ 2 أيام للحصول على المستعمرات المتزايد حديثا.
- تكرار نسخة جديدة من لوحات 100 كتلة (4.1) إلى ثلاث نسخ. وضع نسخة واحدة في 21 درجة مئوية حاضنة واحدة في 33 درجة مئوية الحاضنة والضوابط.
- وضع النسخة الثالثة ( "الفرز لوحات") في إعداد الروبوتية، وبقعة المستعمرات مع دبابيس طويلة تطرق مع الماء المعقم.
ملاحظة: خلايا كلاميدوموناس معلقة على أجار تميل آليا على الهبوط في البداية على شكل بقعة كثيفة بدلا من الخلايا، مع عدد قليل من الخلايا وحيدة متاحة للتفتيش المجهري. لتحسين المستعمرات للتفتيش المجهري، بقعة الخلايا المنقولة في البداية مع قطرة ماء (حجم المياه المنقولة بواسطة المسامير الطويلة الروبوتية هو ~ 100 نيكولا لانغ). وهذا يؤدي إلى تشتت الخلايا في دائرة نصف قطرها صغير (~ 1 مم) عن مركز التدبيس الأولي، مع العديد من الخلايا وحيدة معزولة. - خذ photomicrographs من منطقة في كل بقعة من لوحات الفحص في وقت 0 (في حين لا تزال واحدة، وخلايا غير مقسمة) (الشكل 7) ووضع لوحات على 33 درجة مئوية لمدة الحضانة. تحديد موقع الصورة التي تحكم مرحلة اليدوية لتعديل المجهر الرباعيات تشريح المقرر أن تعطي توقف في 4.5 ملم مركز إلى مركز تباعد من مجموعة 384 الكثافة.
- إزالة لوحات فحص من 33 درجة مئوية الحاضنة واتخاذ photomicrographs، كما في الخطوة 4.4، في نقاط زمنية مختلفة (10 ساعة و 20 ساعة، 48 ساعة). تأكد من المسرح، وحامل لوحة، وتحكم مرحلة ومحسوبة بدقة للحصول على صور من نفس الخلايا في كل نقطة زمنية. أداء اكتساب صورة مجهرية سريع (~ 10 دقيقة).
- استخدام نسخة ثانية في 33 درجة مئوية حاضنة للتحقق من النمط الظاهري الخبر والتأكد من أن التقلبات في درجات الحرارة خلال الحصول على الصور ليس لها تأثير كبير على الخبر النمط الظاهري.
- تحليل الصور المجهرية واختر لالمسوخ على أساس المعايير المطلوب (الشكل 8). بقعة مجموعة تم اختيارها النهائي في لوحة أجار 96 المحتشدة. تأكد من أن كللوحة تحتوي على المسوخ من نفس النوع التزاوج والمقاومة للأدوية.
- لكل لوحة، ودمج عمودين الماضية الإيجابية (الاستعلام طفرة) والتحكم السالب (WT) لفحص تكامل.
5. التكملة والربط اختبار متحولات جديدة الى "المسافرين الدائمين"
- نقل كميات كبيرة من المستعمرات المحتشدة لخالية من النيتروجين الأمشاج الحث المتوسطة 10 في 96-جيدا microplates (يجب أن يكون كثافة من كل مستعمرة نحو 0.2 OD). احتضان لوحات تحت الضوء (13-20 W المصابيح الزئبق) ب ~ 5 ساعة للسماح عملية تكوين الأمشاج.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن تتم إما مع تكرار الإعداد الروبوتية أو يدويا مع جهاز الطلاء بسيط. - تعليق الاستفسارات مع أنواع التزاوج المعاكس إيواء أشرطة مقاومة بديلة في أنابيب مع خالية من النيتروجين الأمشاج الحث المتوسطة 10 لتكوين الأمشاج.
- مزج العينات في لوحة الهدف في MIXT التزاوجحجم لدى عودتهم من 20 ميكرولتر (الشكل 9). وبعد 10 دقيقة ~ تحت ضوء، بقعة 5 ميكرولتر من كل مرتين أيضا: مرة واحدة على لوحة التونسية للاختبار الربط ومرة واحدة على TAP + 5 ميكرومتر بارو + 9 ميكرومتر الرطوبة لاختبار تكامل.
- احتضان لوحات الربط في 21 درجة مئوية الحاضنة بين عشية وضحاها، ومن ثم الانتهاء منها في احباط. الاحتفاظ بها في الظلام لمدة 5 أيام للسماح تشكيل بوغ لاقحي.
- احتضان لوحات تكامل اختبار ل~ 10 يوما في ضوء عند 21 درجة مئوية.
ملاحظة: يتم معايرة كميات المخدرات للسماح للبقاء diploids متخالف على نحو مضاعف، لكنها لا تزال كافية للقضاء على haploids التزاوج. تمت معايرة هذه المبالغ لالتكامل كاسيت المقاومة القياسية المستخدمة في هذا المشروع المحدد؛ مع التكامل الجديدة، ينبغي تعديلها جرعات. يتم التحقق منها معظم الكتلة الحيوية لتكون diploids التدفق الخلوي (الشكل 9)، على الرغم من أن مستوى متفاوت من haploids (وربما من الانقسام الاختزالي ونمو مقاومة مضاعفsegregants) عادة لوحظ كذلك. - تكرار لوحات لاختبار تكامل في نسختين لتحديد النمط الظاهري ts-. وضع نسخة واحدة على 21 درجة مئوية، ونسخة واحدة على 33 درجة مئوية لمدة 5 أيام ~.
- المستعمرات اختبار لالنمط الظاهري ts-، كما وصفها في القسم 2.1 (الشكل 5). المستعمرات التي لم يتم استكمال مع الاستعلام المرجح تمثل الأليلات من نفس الجين كما الاستعلام (diploids مغاير أليلية للطفرات في الجين نفسه).
- لاختبار الربط بعد خطوة 5.4، تحويل لوحات العودة للضوء للسماح الانقسام الاختزالي وثمرة segregants فرداني لل~ 7 أيام.
- تكرار لوحات اختبار الربط وات + 10 ميكرومتر بارو و 10 ميكرومتر الرطوبة لتحديد للنسل مقاومة المزدوج (يتوقع أن تكون 25٪ من ذرية فرداني، لأن الأشرطة هي غير المرتبطة) واحتضان عند 21 درجة مئوية لمدة أسبوع.
ملاحظة: زيادة جرعة الدواء لhaploids مقاومة مضاعف. - المستعمرات اختبار لالنمط الظاهري ts-، وأنان خطوة 2.1.
ملاحظة: يتوقع النمط الظاهري ts- (ولاحظ) عن المسوخ في مجموعة تكامل نفس الاستعلام. وبالإضافة إلى ذلك، النمط الظاهري ts- في مقايسة الربط، لمتحولة أن يكمل الاستعلام، يمكن أن تعكس ربطا محكما بين الاستعلام وطفرة جديدة. المسوخ التي تكمل الاستعلامات اختبارها هي جينات جديدة من المحتمل أن يدخل خط أنابيب لتحديد بيوينفورمتيك الآفة المسبب للمرض، وفي نهاية المطاف لمزيد من التحليل المظهري.
Representative Results
وتبين لنا خط أنابيب المتسارع لعزل نهاية الخبر المسوخ في كلاميدوموناس. والاستغناء الخلايا على لوحات أجار، وبعد فترة وجيزة من التحقق من صحة سريع تحت المجهر لكثافة وحيدة الخلية، لوحات وللأشعة فوق البنفسجية المشع (الشكل 1). يتم تحديد المستعمرات المشع النموذجية واختار في شكل المحتشدة بعد 10 يوما من النمو في درجة الحرارة المسموح بها (الشكل 2). يتم دمج لوحات الناتجة في شكل 384 إلى 1536 مصفوفة (الشكل 3). من هذه الخطوات الأولى لجمع المستعمرات المشع، ونحن المحتشدة ~ 200000 المستعمرات حتى الآن. يتم ضبط كثافة تعليق على أساس جرعة الأشعة فوق البنفسجية المخطط بحيث، وهو ما يمثل الموت، 200 - 600 والمستعمرات الناجين تتشكل على لوحات. تم اختبار ثلاث مرات للأشعة فوق البنفسجية التعرض (1.5 دقيقة، 1 دقيقة، و 0.5 دقيقة)، وثلاثة الكثافة وفقا لذلك (جدول رقم 1). تجريبيا، أسفرت وقت التعرض 1.5 دقيقة أكثر من الخبر- المسوخ (~ 50٪)؛ ولكن، حتى الآن، أسفرت عن 1 دقيقة معظم المرشحين دورة الخلية. لذلك، تم القيام به في المستقبل جولات الأشعة فوق البنفسجية الطفرات مع 1 دقيقة فقط. أهم ما يشغل هو الرش أثناء قطف الأولي والتلوث (وخصوصا في صيغ عالية الكثافة). وهذا قد يؤدي إلى الازدواجية ومزيد من phenotyping من نفس متحولة مرتين. لتقليل احتمال لمثل هذا السيناريو، ورعاية لجمع المستعمرات في الحجم الأمثل، وتأكد من أن المستعمرات المجاورة لا التقطت في الفحص الأولي.
بعد ذلك، تم تنفيذ اثنين متتابعة فحوصات النمط الظاهري ts- (الشكل 5)، وانعزل حوالي 3000 ts- المسوخ وتتميز ظاهريا بواسطة المجهر مرور الزمن (الشكل 8). بسبب التركيز البيولوجي في دراسة دورة الخلية من الفائدة في الظواهر التي تفي بمعايير معينة، نحن لسنا مهتمين بجمع أكثر من اثنين الأليلات في كل هدف جنراله. لذا، أجرينا تكامل واختبار الربط مع الجينات تتميز بالفعل مع أكثر من أليلين (سؤال) ضد المرشحين جمعت حديثا لإزالة الجينات المتكررة للغاية من أنابيب المصب (الشكل 9).
الشكل 1: شكل انتشار خلايا Unmutagenized والأشعة فوق البنفسجية الطفرات. (أ) الاستغناء عن 384 × 2 قطرات ميكرولتر على لوحة أجار باستخدام موزع كاشف. (ب) ويتم اختبار لوحات عشوائية تحت المجهر للتحقق من كثافة وحيدة الخلية وتكون الأشعة فوق البنفسجية مع المشع التعرض 1 دقيقة. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المستعمرات-mutagenized الأشعة فوق البنفسجية اختار لصفائف 384. (أ) تزرع الخلايا وحيدة المشع للأشعة فوق البنفسجية ل~ 10 أيام إلى المستعمرات مرئية. شريط مقياس = 2 سم. (ب) يقر برنامج تحليل الصور مستعمرات للانفصال وفقا لمعايير معينة وآليا صالحة لهم في 384 لوحات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. دمج إلى مجموعة 1536. يتم دمج أربع لوحات 384 شكل لواحد 1536 لوحة. مرة واحدة نمت، يتم نسخ أنها مرة أخرى لاختبار والنمط الظاهري ts-. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التصوير لالكمي. وتعقد (أ) لوحات في إطار تحت موقفا وثيقة التصوير بحيث يتم تصويرها جميع لوحات في سلسلة في التكبير متطابقة وتحديد المواقع. (ب) الصورة الأولى هي لوحة microtiter 1536 جيدا مع نقاط حمراء وضعت في زوايا ونقاط المنتصف. هذه "الشبكة لوحة" صورة تحدد موقف مجموعة. (ج) مثال على مصفوفة 1536 بعد الحضانة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تحديد النمط الظاهري ts- من شبهتحليل الصور -automated. ويتم تحليل الصور لوحة العرف البرمجيات MATLAB (المنصوص عليها في SI). ومجزأة الصورة تلقائيا إلى صفوف الخلية (96، 384، أو 1536)، وكميا إشارة في كل خلية. يتم وضع علامة نمو في 21 درجة مئوية في الزرقاء، ويتم وضع علامة النمو عند 33 درجة مئوية في أصفر. المستعمرات واظهار نمو أعلى بكثير في 21 درجة مئوية مقارنة ب 33 درجة مئوية (موحدة لنهاية الخبر +) ويتم اختيار وتميز في المربعات السوداء مع نقطة خضراء. هذه الخيارات يمكن تحريرها يدويا. يتم نقل الاختيار النهائي لملف المستخدمة من قبل الروبوت قطف مستعمرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. انتقاء الروبوتية من أول جولة نهاية الخبر المرشحين القاتلة. الكرز-pickiنانوغرام الروبوت يتبع تعليمات من الملفات التي تم إنشاؤها كما هو موضح في الخطوة 2.1 لاختيار المرشحين لمجموعة جديدة. تظهر لوحة أعلى التحميل من دبوس معقم. تظهر لوحة أسفل قطف دقيقة من مستعمرة معينة في لوحة مصدر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم فحص 7. الوقت الفاصل بين الفرز الأولي من الظواهر الفتاكة TS. يتم نسخ النسخ التي مرت جولتين من بروتوكول فحص موضح في الشكل رقم 5 لوحات في كثافة الخلايا مثل الخلايا الفردية التي لا يمكن حلها مجهريا. ويستخدم الرباعيات تشريح المجهر تعديلها لتحديد المواقع التي تؤخذ photomicrographs بعد 0 ساعة و 10 ساعة، و 20 ساعة حضانات ر 33 درجة مئوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 8: كلاميدوموناس المسوخ دورة الخلية التي تم تحديدها من قبل الوقت الفاصل بين المجهري. (أ) يصف رسم توضيحي لدورة الخلية فريدة كلاميدوموناس المرحلة G1 طويلة تميزت نمو الخلايا، تليها دورات SM الانشطار، الذي ينتهي مع تفريخ الخلايا الوليدة حديثي الولادة. (ب) وصور مجهرية تظهر خلايا WT خلال دورة الخلية وتحديد نموذجية المسوخ دورة الخلية التي تفشل في استكمال الانقسام. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 9: التكملة والربط اختبار. (أ) يعبروا مقاومة (على سبيل المثال، الرطوبة) الاستعلام المضادات الحيوية مع تحور الجين يتكرر كثيرا في لوحة 96-جيدا مع مجموعة من المسوخ من الآخر نوع التزاوج التي تأوي الكاسيت الثاني المضادات الحيوية المقاومة (على سبيل المثال، بارو). لوحات تكامل تسفر عن جزء كبير من diploids كما يتضح من تلطيخ النووي حامض والتحليل في التدفق الخلوي (اللوحة السفلى اليسرى في). (ب) يتم اختبار خليط التزاوج سواء بالنسبة للتكامل في diploids والربط في مقاومة المزدوج ذرية الانتصافي. السيطرة الإيجابية هي الاستعلام نفسه في المقابل نوع التزاوج، وكما هو متوقع، تبين النمط الظاهري ts- في 33 درجة مئوية، في حين أن السيطرة السلبية هي WT ويظهر في نهاية الخبر + النمط الظاهري. تظهر المستعمرات حلقت أي تكامل مع الاستعلام وبالتالي فهي نالأليلات ts- مصريات لجين الاستعلام. وتستبعد هذه عموما من مزيد من التوصيف، منذ فقط "المسافرين الدائمين" موجودة في مجموعة واختبار تكامل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مرة | OD | اختار المستعمرات (#) | النمط الظاهري Ts- | المرشحين دورة الخلية |
| 1.5 ' | 0.012 | 6000 (متوسط = ~ 200) | 200 (3.3٪) | 7 (3.5٪) |
| 1 " | 0.003 | 11000 | 131 (1.19٪) | 15 (11.4٪) |
| (متوسط = ~ 360) | ||||
| 6E-04 | 9000 | 40 (0.45٪) | 1 (2.5٪) | |
| (متوسط = ~ 300) |
الجدول 1: معايرة تشعيع تايمز لتعظيم العائد من دورة الخلية المرشحين متحولة. تم اختبار ثلاث مرات التشعيع (30 لوحات لكل منهما) مع المواد المستنفدة للأوزون المقابلة لضمان قيد الحياة أعداد مستعمرة (200-600).
Discussion
خط أنابيب الموصوفة هنا لعزل عالية الغلة من المسوخ المميتة TS يضمن أن يفترض كل مسارات الخلوية ضرورية للجينوم كلاميدوموناس ممثلة. خطوتين الأكثر أهمية بالنسبة لمجموعة فعالة من الجينات دورة الخلية المحتملة وللقضاء على الأليلات المتكررة "المسافر الدائم" هي: 1) تعريف متماسك من خصائص النمط الظاهري اعتقال لدورات الخلايا غير مكتملة و2) فحص تكامل مواز ضد تحديدها بالفعل الاستعلام الجينات لتكبير جمع بأخرى معزولة حديثا.
عندما متزامنة عبر الدوائر السوداء الخفيفة، كلاميدوموناس ينمو الضوئي خلال ساعات النهار وزيادة في حجم الخلية> 10X دون أي تكرار الحمض النووي أو خلية تقسيم 13. تتزامن تقريبا مع بداية الليل، وخلايا ثم الخضوع لدورات متعددة بالتناوب تكرار الحمض النووي، الانقسام، وانقسام الخلايا (الشكل 8). هذا schem التنظيمييوفر البريد التمييز الطبيعي بين الجينات المطلوبة في المقام الأول لنمو الخلايا والنزاهة والجينات المطلوبة خصيصا للدورة انقسام الخلايا. وجدنا أن 10 ساعة و20 ساعة نقطة زمنية هي مفيدة للغاية لالمظهرية الخام الأولية قطع 1. لفئات واسعة من طفرات مميتة TS أن ندرك في الوقت الراهن، على أساس هذه الصور (انظر SI في تولين والصليب، 2014) 1، هي: الشق، الفشار، جولة، الصغيرة والمتوسطة، تحلل في وقت مبكر، ومتعددة دورة (الشكل 8 ).
الفئات الثلاث الأكثر أهمية التي نركز عليها هي الشق، الفشار، وجولة. عرضت على "الشق" والظواهر "الفشار" في السابق أن تكون سمة من سمات معظم الآفات خلية دورة محددة (على سبيل المثال، الإنقسامية التي تعتمد على السيكلين كيناز، والآلات تكرار الحمض النووي، وTopoisomerase الثاني) 1. مظهر واحد (الشق) أو متعددة (الفشار) طائرات واضحة من انقسام الخلايا بدايته ولكن غير ناجحة هو morphol مريحةمؤشر ogical من بدء دورة الخلية. هذه المسوخ المعرض عموما عيوب نمو ضئيلة أو معدومة، مع زيادة في حجم الخلايا مماثلة لWT على علامة 10 ساعة. والشق والفشار الظواهر واضحة في 10 ساعة ويتم تطويرها بالكامل (كثيرا ما يرتبط مع تحلل الخلايا) بواقع 20 ساعة. خلايا "جولة" تنمو على نحو مماثل لWT لكن مع إنتاج خفضت كثيرا من الطائرات تقسيم بدايته واضحة، وبالتالي العوائد الكبيرة، وخلايا القبض الجولة. وتراجعت المسوخ السابقة في هذه الفئة إلى مكونات معقدة 14 أو في الجينات الداعمة للطور الصعود المطلوبة لوظيفة أنيبيب (العوامل المساعدة للطي تويولين، جاما تويولين حلقة مجمع) 1. في أوقات لاحقة، وهذه الخلايا غالبا ما تظهر تحلل الخلايا وضوحا.
"الصغيرة" وخلايا "متوسطة" تنمو إما تكاد لا تذكر (الصغيرة) أو أقل بكثير من وزن (وسط). العديد من هذه المسوخ التي تم تحديدها حتى الآن لديهم آفات في الجينات التي تشير إلى الأدوار في cellula الأساسي الشروحعمليات النمو ص (الترجمة أو نشوء حيوي الغشاء). التمييز المجهري الرئيسي بين المتوسطة وجولة يعتمد على مقدار النمو في 10 ساعة (جولة: مثل WT، المتوسطة: انخفاض). لأن الفئات الصغيرة والمتوسطة هي كبيرة جدا وربما تعكس الآفات في مجموعة كبيرة من مسارات الخلوية، نحن لسنا في محاولة لتشبع هذه الفئات. ومع ذلك، فإننا لا نريد أن جزيئيا تحديد ممثلي الطبقة لفهم الظواهر الخسارة في مسارات متنوعة. فئتين غير مدروسة هي: 1) المسوخ التي تفقد سلامة (فقدان اللون الأخضر، وفقدان refractility) من قبل علامة 10 ساعة، مع القليل من الأدلة على نمو الخلايا مسبق و2) دورات متعددة الناشر في وقت مبكر. خلايا تتكاثر على نحو مماثل لWT في 10 و 20 ساعة، على الرغم من أنها تظهر عجزا كاملا لتنفيذ الانتشار على المدى الطويل.
نحن تميز معظمها "من الدرجة الأولى"، "الفشار"، و "جولة" واستبعاد خلايا صغيرة مدورة والمتوسطة، وكذلككما المسوخ تتسرب منها المياه التي كاملة القليلة انقسامات الخلية. هذا هو أساسا لضمان ميزات الخلوية الأساسية، مثل النمو وسلامة الغشاء، وظيفية، وإثراء احتمال لالجينات ذات الصلة الانقسام. تم العثور على هذا النهج لتكون فعالة تجريبيا. ومع ذلك، قد يكون هذا الجين دورة الخلية هو عديد المظاهر ولها أدوار إضافية في وقت سابق من G1، قبل التقسيم الفعلي. مثل هذه الحالات، والتي نتوقع أن تكون نادرة، وغاب. أكثر عموما، ونحن نهدف لاعتقال متجانسة، وهذا احتمال كبير ويرجع ذلك إلى واحد الطفرة المسببة هذا هو بروتين مختلة تماما. ومع ذلك، لنفس السبب كما هو موضح فقط، قد يكون هناك عدة نقاط اعتقال وبالتالي، بعض المرونة من المستحسن في اختيار المرشحين.
من أجل إثراء مجموعة مع الجينات التي تم تشخيصها حديثا، ويعاير المرشحين الذي تم اختياره لتكامل. نحن بحاجة ts- في السيطرة الايجابية (الاستعلام ضد طفرة الاستعلام) ونهاية الخبر + في السيطرة السلبية (QUERذ ضد WT). طفرات جديدة في مجموعة تكامل نفس الاستعلام هي ts-. العضوية في مجموعة تكامل نفس يعكس دائما تقريبا آفة الجزيئية في نفس الجين (وقد كان هذا هو الحال بالنسبة لكل هذا الجين اختبرناها). لذلك، ل "المسافرين الدائمين"، هذا المعيار هو الإقصائي لمزيد من التوصيف. المسوخ التي لم تكن في مجموعة تكامل نفس الاستفسارات اختبار المرشحة للجينات جديدة وتتميز مزيد من المعلومات البيولوجية والأدوات التجريبية. انتعاش متغير بدرجة كبيرة من ts- الأليلات إلى مجموعات مختلفة تكامل ظاهرة التي تعرف جيدا هو، وتقلب أكبر بشكل ملحوظ من الضوضاء بواسون، وذلك بسبب تقلب جوهري كبير من التحولية لts- بين جينات مختلفة. يسبب يمكن أن تشمل الاختلافات الجوهرية thermolability. أحجام البروتين مختلفة؛ وجود البروتين ومونومر مقابل كما كبيرة، استقر المجمع. والبقع الساخنة تسبب الطفرات الوراثية. هذا هو تقريبا nuisa النقيالامتحانات التنافسية الوطنية. ومع ذلك، وينتج نتيجة إيجابية هي أن "المسافر الدائم" القائمة ليست طويلة (مع فقط بضعة أهداف الاحتلال أكثر من القائمة)، وبالتالي فإن اختبار تكامل كثيفة العمالة ليست مهمة ضخمة حتى مراحل لاحقة من المشروع.
كما اتباع نهج متكامل، أجرينا فحص الربط. في هذا الاختبار، يتم اختيار السلالات المقاومة للازدواجية ويتم اختبارها لالنمط الظاهري ts-. ومن المتوقع النمط الظاهري ts- (ولاحظ) عن المسوخ في مجموعة تكامل نفس الاستعلام أو طفرات مرتبطة بإحكام. لكل من الجينات اختبار، ومن المتوقع أن تظهر (TS + النمط الظاهري) في احتمال معينة اعتمادا على المسافة الوراثية ذرية WT. ونحن نقدر أن هناك حوالي 100 zygospores لكل التزاوج في هذه البقع. على افتراض 100٪ كفاءة الانتصافي، وهذا سوف يؤدي إلى ذرية مقاومة للالمزدوج المخدرات حوالي 100 من أشرطة مقاومة العقاقير غير المرتبطة (25٪ من ذرية الانتصافي، أربعة في الانقسام الاختزالي، بسبب Mالميراث endelian). وهذا من شأنه أيضا أن تكون الحال بالنسبة ts- الطفرات، حيث 25٪ من السلالات ستكون مزدوجة متحولة، وسوف يكون 25٪ WT إذا كان الاستعلام واختبار الطفرات غير المرتبطة. لذلك، من ذرية-مقاومة مزدوجة من المخدرات، و25٪ يكون وزن (حوالي 25 خلية). هذا هو الحال بالنسبة لطفرات غير المرتبطة تماما. ومع ذلك، الربط المعتدل (داخل ~ 20 سم، حوالي 2 ميغابايت، أو 2٪ من الجينوم 115) سوف يقلل بشدة أو القضاء على الخبر + إشارة. في حالة الربط بين الطفرة اختبار لالكاسيت المضادات الحيوية، واتس + haploids التي هي مزدوجة المقاوم للعقاقير موجودة في كميات منخفضة جدا. هذا يظهر كما فشل واضح لإعادة تجميع مع كل المسوخ اختبارها، وعلى الرغم من استكمال جميع المسوخ اختبارها، وهي نتيجة الشاذة أن يلاحظ بسهولة. في مثل هذه الحالات، سوف backcrossing يحل المشكلة.
كلا من المعرفة المسبقة ومن تحليل تسلسل، فإننا نتوقع الجينات دورة الخلية في كلاميدوموناس الى نحو 500 جين 2، على الرغم من موشارع، ولكن ربما ليس كل شيء، ضرورية. سنقيم ضرورة لجولات الطفرات إضافية كما يتم جمع المزيد من المسوخ ومستوى ارتفاع التشبع.
تم تصميم هذا الإجراء بشكل فريد لدراسة العمليات البيولوجية الأساسية والجينات والبروتينات التي تحمل بها. منهجيات أخرى لتوليد اضطرابات في الجينات الأساسية موجودة (على سبيل المثال، والتحول من الأليلات mutagenized عشوائيا 16، الأليلات كتب مشروط 17، أو الأليلات hypomorphic 18). ومع ذلك، فإنها كلها تتطلب إعادة التركيب مثلي، التي قمعت بقوة في الخضري كلاميدوموناس. متفاوت المسافات، interspaced بانتظام تكرار المتناوب قصيرة (كريسبر) / تم تأسيس نظام Cas9 كأداة قوية لتعديل الجينات 19. ومع ذلك، فإنه حتى الآن للعمل بكفاءة في كلاميدوموناس 20. الأهم من ذلك، كل من هذه الأساليب تتطلب معرفة مسبقة من الهدف. هذا هو تقييد شديدإذا كان أحد يرغب في أن تتاح الفرصة لتعلم شيء جديد! ونهجنا تسفر عن الطفرات تحديد الجينات الأساسية، مستقلة عن أي معرفة مسبقة. لذلك، على المستوى الحالي للتكنولوجيا، قد يكون عزل الطفرات العشوائية نهاية الخبر تليها تحديد الجينات التي كتبها تسلسل عميق الطريقة الأكثر فعالية لكسب الدخول السريع في بيولوجيا الخلايا الميكروبية في superkingdom النبات.
تحديد الطفرات المسببة (من بين 100 ~ الترميز تسلسل تغيير الطفرات في كل استنساخ) هو خارج نطاق هذه الورقة. تسلسل عميق حمامات المعزول متضخم 1 فعالا لكنه يحتاج إلى عمالة كثيفة. استراتيجية تجمع اندماجي لتحديد جميع الطفرات في عدد كبير من السلالات، وبعد تسلسل عدد قليل من برك، هو من حيث التكلفة وفعالة جدا والعمل. استراتيجية جديدة لاندماجي التسلسل المعزول متضخم قيد التطوير التي من شأنها أن تسمح بتحديد الطفرات المسببة في العشرات من المسوخ سيمultaneously في تشغيل تسلسل واحد (قيد الإعداد). هذه الكفاءات هي مهمة جدا للسماح للخطوة تحديد الجينات الهامة لمواكبة التراكم السريع جدا من المسوخ التي أصبحت ممكنة بفضل الإجراءات الموضحة هنا.
Disclosures
الكتاب تعلن أي مصالح مالية كبيرة.
Acknowledgments
نشكر أعضاء المختبر عبر للحصول على المشورة ومناقشة مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل خدمات الصحة العمومية 5RO1-GM078153 و جائزة زميل جديد من مؤسسة سيمونز لميكال Breker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
References
- Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
- Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
- Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
- Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
- Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
- Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
- Harris, E. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
- Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
- Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
- Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
- Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
- Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
- Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).
