Introduction
Fænotypisk karakterisering af systematiske mutant samlinger af modelorganismer er en gennemprøvet metode til dissekering cellulære kompleksitet. Den haploide encellede grønalger Chlamydomonas reinhardtii har et anlæg-lignende gen sæt, men det afveg fra landplanter, før flere genom gentagelser i landet plante afstamning 2. I princippet manglende gen overlapning og en hovedsagelig haploid livscyklus i høj grad letter tab-af-funktion genetiske tilgange. Men er næsten umuligt målrettet afbrydelse af gener af interesse på grund af manglen på en effektiv homolog genomisk integration. En tilfældig indførelsesmutationen forstyrrelser biblioteket er under opførelse, kombineret med identifikation af forstyrret site, hidtil hvilket giver en array sæt af 1.935 kortlagte forstyrrelser, der repræsenterer 1.562 gener 3. Men denne tilgang (forventet generelt at producere null mutationer) gælder ikke for væsentlige gener. Temperatur-følsomme (ts) mutationer kan recovered i essentielle gener, og de seneste metoder muliggør effektiv identifikation af det muterede gen og den forårsagende læsion. Fænotypisk analyse ved høj temperatur giver derefter øjeblikkelig information om funktionen af det muterede gen. Vi rapporteret om isolering og karakterisering af ts dødelige mutationer i ~ 70 essentielle gener i Chlamydomonas, især med fokus på gener involveret i cellecyklus progression og kontrollere 1,4.
Ts dødbringende skærme har været en grundpille i genetisk analyse i mikroorganismer i årtier 5,6. I princippet et ønskeligt træk er at nærme "mætning", hvilket betyder, at alle gener, der kan mutere til ts letalitet identificeres ved mindst en mutant, som tillader en fuldstændig analyse. Men i praksis, flere faktorer begrænser, tilgangen til mætning. Først, mens næsten alle gener kan muteret til tab af aktivitet ved høj temperatur, effektiviteten af udvinding af sådanne mutanter varierer over mindsten størrelsesorden 7,8. Derfor begynder en tilfældig skærm at afhente tilbagevendende hits i "frequent flyers" længe før mætning er kontaktet. For det andet, mens ts mutationer normalt resultere i reduktion af funktion, de kan ikke være sande nuller på en restriktiv temperatur (og omvendt, er ofte ikke fuldt funktionel ved en tolerant temperatur). Dette problem kan løses i et vist omfang ved at sammenligne flere alleler; hvis de alle deler en fælles fænotype, det er mere sandsynligt at afspejle resultatet af simpel inaktivering af genet. Flere alleler er også meget nyttigt for definitiv molekylær identifikation af den sygdomsfremkaldende læsion en. den "frequent flyer" problem betyder dog, at flere alleler i sjældent ramt gener kan være svært at komme sig.
Af disse grunde har vi udviklet en forbedret rørledning til at isolere og fænotypisk karakterisere ts mutanter. Vi har samlet over 3.000 ts mutanter hidtil, jegncluding omkring 200 nye kandidat cellecyklus mutationer. Molekylær og fænotypisk analyse af denne samling, som allerede sandsynligvis indeholder mutationer i de fleste eller alle celle-væsentlige veje, skal give ny indsigt og hypoteser i anlæg cellebiologi. Vigtigt er det, kan denne rørledning anvendes på enhver mikroorganisme, der vokser på agar til effektivt konstruere ts mutant samlinger.
Et notat om udstyr: to robotter er meget vigtige for effektivitet i denne procedure (en koloni picker og en kombination replika plater / cherry picker). Plukkerne har typisk metal ben. Plukkede kolonier holdes i luft på disse stifter til nogle periode (sekunder til minutter, afhængigt af modellen). Chlamydomonas dør i omkring 20 sek på en metal pind i luften. Dette begrænser model valg for organismen. Nøjagtighed spørgsmål. Vores koloni picker er rimelig præcis; Men det er lidt voldsom i sin indsats og har en vis mulighed for spray-baserede krydskontaminering. Den bruges ikke ved højis end 384 densitet (4,5 mm center-center); på denne tæthed, nøjagtigheden er helt acceptabelt. Replika plating / cherry picking robot (forskellige redskaber, der anvendes til disse applikationer) er meget langsommere på plukning, men er præcis nok til 1536 densitet (6144 er en udfordring, selv for denne meget præcise robot, vi har evalueret denne tæthed men valgte ikke at bruge den på grund af sine forskellige vanskeligheder). Robotten vil ikke fungere godt, hvis pladerne er indlæst ujævnt, osv. Det er vigtigt at få øje-check for at være sikker de rigtige ting sker; selvfølgelig vil robotten køre uden opsyn og i almindelighed, alt vil gå godt, hvis de første par plader var korrekte.
Protocol
1. UV mutagenese
- Forbered et parti på 100 - 200 rektangulære agarplader med Tris-acetat-fosfat (TAP) medium 9,10. Forbered disse plader et par dage forude og holde dem på bænken tørre for at sikre hurtig absorption af de suspenderede celler i de næste trin.
- Kultur Chlamydomonas celler op til 0,2 - 0,5 optisk densitet (OD 750; ~ 2 dage) i 100 ml flydende TAP under lys ved 25 ° C og omrystning ved 100 rpm.
BEMÆRK: UV mutagenese udføres uafhængigt i to genetiske baggrunde: Mat- hygro r (bibringer resistens over for hygromycin B) og Mat + Paro r (giver resistens over Paromomycin). Antibiotika valg er vilkårlig, forudsat de to parring typer har komplementære narkotika modstande. - Check en prøve af hver af kulturerne under mikroskop for at sikre, at cellerne er levedygtige, sunde (svømning og intakt), og uden forurening.
BEMÆRK: Overgrown kulturer "crash" ogmister levedygtighed, der optræder som "spøgelser" i fase kontrast mikroskopi. Må ikke holde shaker kulturer går, når de når mætning. Den "ghost" fænomen er let påviselig i trin 1.3. - Fortynd kulturen til 0,003 OD 750. Wrap flasken med aluminiumsfolie for at sikre homogen densitet, da stammen er bevægelig og svømmer retningsbestemt som reaktion på lys.
- Justere tætheden af suspensionen baseret på den planlagte UV-dosis, således at der tegner sig for celledrab, 200 - vil 600 overlevende kolonier dannes på pladerne (figur 1). Se tabel 1 for information om UV eksponeringstider.
- Vedhæfte et rør kassette, der passer til en væskedispenser og udføre en række vaskninger for sterilisation, ifølge producentens instruktioner for at undgå kontaminering.
- Ved hjælp af en 8 x 12 flydende dispenser, dispensere 4 x 96 dråber 2 pi hver på rektangulære plader (figur 1
- For at sikre meget jævn enkelt celle spredning med tørre plader, som nævnt ovenfor, og hurtigt dække pladerne for at forhindre cellerne i svømning i respons på lys. Hold dækkede plader og i mørke, indtil al væsken er absorberet.
- For at sikre maksimal styrke af UV-bestråling uden reversion på grund af lys-afhængig DNA reparation 11,12, arbejde i mørke ved dette trin og straks pakkeplader i en mørk kasse efter bestråling.
BEMÆRK: Årsagen til denne sekundære plating er, at ts dødelige mutanter kan i nogle tilfælde ophobes betydelige biomasse, selv om cellerne anholdt i den første celle cyklus efter plating. Det sekundære replika eliminerer dette signal og øger følsomheden.
BEMÆRK: Forskellige inkubationstider bruges til at udligne vækst siden vildtype vokser markanthurtigere ved 33 ° C end ved 21 ° C.
2. Identifikation af ts Mutant Kandidater: Første skærm
- Behandle de parrede 21/33 plade billeder med en brugerdefineret Matlab billede analyse software til at fjerne baggrunden og at segmentere billederne ind i en 1536-array. Programmet vil bestemme det detekterede biomasse (total pixel intensitet) i hver position (figur 5).
BEMÆRK: software (leveres i SI sammen med instruktioner), vil bruge grid-plade billede for at bestemme placeringen af cellerne (individuelle firmaer) i en 1536-matrix ved forstørrelse og plade tilpasning brugt og beregne den samlede pixel intensitet i hver celle . Disse værdier for hver mutant sammenlignes derefter mod justerbare parametre til at bestemme ønskede vækst ved 21 ° C i forhold til en ts + standard og graden af temperatur-følsomhed, defineret som: S (Mut 33) / S (WT 33) / S (Mut 21) / S (WT 21), hvor S er signal (pixel itensitet efter baggrundssubtraktion), Mut er en individuel mutant, og "WT" er en tilfældigt valgt ikke- temperaturfølsomt koloni (mutageniseret stamme, der havde ts + fænotype). Vækst ved 21 ° C defineres som S (Mut 21) / S (WT 21). I denne første skærmbillede, anvende afslappede udvælgelseskriterier (tillader relativt lav vækst ved 21 ° C og en relativ lav grad af temperatur følsomhed) for at holde den falske negative rente lav. - Læg listen over udvalgte kolonier genereret af software som en instruktion fil til enkelt-koloni plukke robotteknologi (typisk i en 384-array). Forbered kilde- og mål- plader i henhold til robotteknologi instruktioner og plukke kolonier til matrix (figur 6).
BEMÆRK: Konventionelle plukkere kræver en instruktion fil i nogle format, såsom .csv, .txt eller .xls. Alle plukkerne vil have kapacitet til at være fil-drevet; forskellige formater vil kræve mindre redigering af MATLAB-koden (kildekode medfølger). Placer målplader i 21 ° C inkubator i ~ 5 dage at vokse en stamplade.
3. Identifikation ts mutanter: Second Screen
- Gentag trin 2.1 til genteste plukkede kolonier. Typisk 30 - 50% af kolonierne vil retest som klare ts lethals, for et udbytte på 2% - 5% ts lethals forhold til oprindelige kolonier overlevende UV mutagenese.
- Gentag trin 2.2 til at vælge de to gange screenet ts lethals, men med en modificeret instruktion fil designet til array-kolonier i blokke af 100 kolonier på rektangulære plader ved en 384-densitet. Dette er til praktisk mikroskopisk undersøgelse i det næste trin. instruktion filformatet er angivet på kørselstidspunktet af MATLAB-koden.
- Sørg for at inkludere flere WT kolonier som en kontrol og placere pladerne ved 21 ° C i ~ 5 dage.
4. Første Fænotype Bestemmelse
- Repliker de 100-blok plader opstillede i trin 3.2 og placere dem i 21 ° C INCUBator for ~ 2 dage at opnå frisk voksende kolonier.
- Repliker den ny kopi af de 100-blok plader (4.1) til tre eksemplarer. Placer en kopi i 21 ° C inkubator og en i 33 ° C inkubator som kontroller.
- Placer tredje eksemplar ( "screening plader") i en robot setup, og spotte kolonierne med lange ben rørt med steriliseret vand.
BEMÆRK: Chlamydomonas celler fastgjort til agar robotersvejsede tendens til at lande oprindeligt som en temmelig tæt plet af celler, med få enkelte celler til rådighed for mikroskopisk inspektion. For at optimere kolonierne til mikroskopisk undersøgelse, spotte oprindeligt overførte celler med en dråbe vand (den mængde vand, overføres af de robot lange ben er ~ 100 nl). Dette resulterer i dispersion af cellerne i en lille radius (~ 1 mm) omkring den oprindelige pinning centrum, med mange isolerede enkeltceller. - Tag mikrofotografier af en region i hver plet af screening pladerne til tiden 0 (mens stadig single, udelte celler) (Figur 7) og placere pladerne ved 33 ° C til inkubation. Bestem billede beliggenhed ved manuel fase kontrol af en modificeret tetrade dissektion mikroskop indstillet til at give stopper ved 4,5 mm centrum-til-center af en 384-density array.
- Fjern screening plader fra 33 ° C inkubator og tage mikrofotografier, som i trin 4.4, ved varierende tidspunkter (10 timer, 20 timer, 48 timer). Sørg for, at scenen, holder pladen, og scenen controller er præcist kalibreret til at få billeder af de samme celler i hver gang punkt. Udføre en hurtig erhvervelse mikrofotografi (~ 10 min).
- Brug den anden kopi i 33 ° C inkubator for at kontrollere ts fænotype og sørge for, at temperatursvingninger under billedoptagelse har ingen større effekt på ts fænotype.
- Analyser mikroskopiske billeder og selektere for mutanter baseret på de ønskede kriterier (figur 8). Spot den endelige udvalgt sæt i en 96-klædt agarplade. Sørg for, at hverplade indeholder mutanter af samme parring type og resistens.
- For hver plade, optage to sidste kolonner en positiv (query mutation) og en negativ (WT) kontrol for komplementering assay.
5. Komplementering og Linkage afprøvning af nye mutanter til "Hyppige Flyers"
- Overføre store mængder af de grupperede kolonier til nitrogen-free gamet-induktion medium 10 i mikroplader med 96 brønde (densitet af hver koloni bør være omkring 0,2 OD). Pladerne inkuberes under lys (13-20 W kviksølv pærer) for ~ 5 timer for at tillade gametogenese.
BEMÆRK: Dette trin kan udføres enten med en replikerende robot setup eller manuelt med en simpel plating enhed. - Suspendér forespørgsler med de modsatte parring typer huser de alternative modstand kassetter i rør med nitrogen-fri gamet-induktion medium 10 for gametogenese.
- Bland prøverne i en måltavle i en parring mixture volumen på 20 pi (figur 9). Efter ~ 10 min under lyset, spot 5 pi fra hver brønd to gange: én gang på en TAP plade til sammenkædning test og gang på TAP + 5 uM Paro + 9 uM hygro til komplementering test.
- Inkubér linkage plader i 21 ° C inkubator natten over, og derefter pak dem ind i folie. Holde dem i mørke i 5 dage for at tillade zygospore formation.
- Inkuber komplementering-test plader til ~ 10 dage i lys ved 21 ° C.
BEMÆRK: drug beløb er kalibreret til at tillade overlevelse dobbelt heterozygote diploider, men de er stadig tilstrækkelig til at eliminere de samvirkende haploider. Disse beløb blev kalibreret til standard modstand kassette integrationer anvendes i denne specifikke projekt; med nye integrationer, skal dosis kalibreres. Mest biomasse er bekræftet at være diploider ved flowcytometri (figur 9), selv om et variabelt niveau af haploider (sandsynligvis fra meiosen og vækst dobbeltdestilleret resistentesegreganter) er normalt observeres så godt. - Repliker komplementeringen-test plader i to eksemplarer til TS fænotype identifikation. Placer en kopi ved 21 ° C og en kopi ved 33 ° C i ~ 5 dage.
- Test kolonier til TS fænotype, som beskrevet i afsnit 2.1 (figur 5). Kolonier, der ikke supplerer med forespørgslen sandsynligvis repræsenterer alleller af det samme gen som forespørgslen (diploider hetero-allele for mutationer i det samme gen).
- For kobling test, efter trin 5.4, skift pladerne tilbage til lys for at tillade meiose og udvækst af haploide segreganter for ~ 7 dage.
- Gentagne kobling test plader til TAP + 10 uM Paro og 10 pM Hygro at vælge for dobbelt-resistente afkom (forudsagt til at være 25% af det haploide afkom, da kassetterne er sammenkædet) og inkuberes ved 21 ° C i en uge.
BEMÆRK: Øg narkotika dosis for dobbelt resistente haploider. - Test kolonier for TS fænotype, som jegn trin 2.1.
BEMÆRK: Der forventes en TS fænotype (og observeret) for mutanter i samme komplementering gruppe som forespørgslen. Derudover en TS fænotype i koblingen assay for en mutant, der supplerer forespørgslen, kan afspejle tæt forbindelse mellem forespørgslen og den ny mutation. Mutanter, der supplerer de testede forespørgsler er sandsynlige nye gener, der vil komme ind i rørledningen for bioinformatisk identifikation af den sygdomsfremkaldende læsion, og i sidste ende for yderligere fænotypisk analyse.
Representative Results
Vi viser en accelereret rørledning til isolering ts mutanter i Chlamydomonas. Celler dispenseres på agarplader, og kort efter hurtig validering under mikroskopet for enkelt-celletæthed, plader er UV bestrålet (figur 1). Typiske bestrålede kolonier identificeres og opsamlet i en opstillet format efter 10 dages vækst ved en permissiv temperatur (figur 2). De fremkomne plader i 384 format flettes til en 1536-array (figur 3). Fra disse første skridt til indsamling bestrålede kolonier, har vi klædt ~ 200.000 kolonier hidtil. Tætheden af suspensionen justeres udgangspunkt i den planlagte UV-dosis, så, der tegner sig for død, 200 - vil 600 overlevende kolonier dannes på pladerne. Tre eksponeringstider UV (1,5 min, 1 min, og 0,5 min) og tre densiteter blev testet i overensstemmelse hermed (tabel 1). Empirisk den 1,5 min eksponeringstid gav de fleste af ts- mutanter (~ 50%); imidlertid langt, 1 min gav de fleste af cellecyklus kandidater. Derfor blev fremtidige UV mutagenese runder gjort med kun 1 min. En vigtig bekymring er stænk under indledende plukning og krydskontaminering (især i high-density-formater). Dette kan resultere i overlapning og yderligere fænotypebestemmelse af samme mutant to gange. For at minimere sandsynligheden for et sådant scenario, sørge for at indsamle kolonier på den optimale størrelse, og sørg for, at tilstødende kolonier ikke er plukket i den indledende analyse.
Derefter blev to sekventielle TS- fænotype assays (figur 5) udføres, og omkring 3.000 TS- mutanter blev isoleret og fænotypisk karakteriseret ved time-lapse mikroskopi (figur 8). På grund af den biologiske fokus i at studere cellens cyklus af interesse i fænotyper, der opfylder visse kriterier, vi er ikke interesseret i at indsamle mere end to alleler i hvert mål gene. Derfor udførte vi komplementering og kobling test med allerede karakteriserede gener med mere end to alleler (Query) mod nyligt indsamlede kandidater til at fjerne meget tilbagevendende gener fra nedstrøms rørledning (figur 9).
Figur 1: ensartet spredning af ikke-mutageniserede celler og UV mutagenese. (a) 384 x 2 pi dråber dispenseres på en agarplade anvendelse af et reagens dispenser. (b) Tilfældige plader testes under mikroskop for at kontrollere encellede densitet og er UV bestrålet med en 1-min eksponering. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. UV-mutageniseret Kolonier plukket til de 384-arrays. (a) UV-bestrålede enkeltceller dyrkes i ~ 10 dage inde synlige kolonier. Scale bar = 2 cm. (b) Billedanalyse program genkender adskillelige kolonier efter visse parametre og robot arrays dem i 384 plader. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Fletning til 1.536-array. Fire 384-format plader er slået sammen til én 1536-plade; når vokset, er de replikerede igen for at teste for TS fænotype. Klik her for at se enstørre version af denne figur.
Figur 4. Imaging til Kvantificering. (a) Pladerne holdes i en ramme under et dokument fotografering stativ, således at alle plader i en serie er fotograferet med samme forstørrelse og positionering. (b) Det første billede er af en 1536-brøndsmikrotiterplade med røde prikker placeret på hjørner og midtpunkter. Denne "grid-plade" billede definerer positionen af grupperingen. (c) Eksempel på en 1.536-matrix efter inkubation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Identifikation af TS fænotype ved Semi-automated Image Analysis. Plate billeder analyseres ved brugerdefinerede MATLAB software (leveres i SI). Billedet bliver automatisk segmenteret i cellearrays (96, 384, eller 1.536), og signalet i hver celle er kvantificeret. Vækst ved 21 ° C er markeret med blåt, og væksten ved 33 ° C er markeret med gult. Kolonier udviser markant højere vækst ved 21 ° C i forhold til 33 ° C (standardiseret til ts +) er valgt og markeret i sorte firkanter med en grøn prik. Disse valg kan redigeres manuelt. Endelige valg overføres til en fil som anvendes af kolonien-picking robot. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Robotic Picking i Første runde ts Lethal Kandidater. Cherry-picking robot følger instrukser fra en fil genereret som beskrevet i trin 2.1 at plukke kandidater til en ny matrix. Det øverste panel viser indlæsningen af en steriliseret stift. Det nederste panel viser den præcise plukning fra en bestemt koloni i kildepladen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Time-lapse Screening for Initial Sortering af ts dødelige fænotyper. Kloner, der gik to runder af screening protokollen illustreret i figur 5 replikeres til plader ved en celledensitet sådan, at individuelle celler kan løses mikroskopisk. En modificeret tetrade dissektion mikroskop anvendes til at identificere positioner, ved hvilke mikrofotografier er taget efter 0 timer, 10 timer og 20 timer inkubationer en t 33 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: De Chlamydomonas Cell Cycle mutanter identificeret ved tidsforskudt Microscopy. (a) Illustration af Chlamydomonas unikke cellecyklus beskriver den lange G1-fasen kendetegnet ved cellulær vækst, efterfulgt af fission SM cyklusser, som ender med skravering på nyfødte datterceller. (b) Mikroskopiske billeder demonstrerer WT celler under cellecyklus og identifikation af typiske cellecyklus mutanter, der undlader at fuldføre mitose. Scale bar = 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Komplementeringsanalyse og Linkage Test. (a) Et antibiotikum resistente (f.eks Hygro) forespørgsel med en ofte gentaget muteret gen krydses i en 96-brønds plade med et sæt mutanter af den modsatte parringstype, som skjuler en anden antibiotikaresistens kassette (f.eks Paro). Komplementering plader opnåelse høj brøkdel af diploider, vist ved den nukleinsyre-farvning og analyse i flowcytometri (nederste venstre panel i en). (b) parring blanding testes både for komplementering i diploider og kobling i dobbelt-resistente meiotisk afkom. Den positive kontrol er forespørgslen selv i den modsatte parringstype, og som forventet, viser TS fænotype ved 33 ° C, hvorimod den negative kontrol er WT og viser ts + fænotype. De kredsede kolonier viser ingen komplementering med forespørgslen og er derfor new TS- alleler for forespørgslen genet. Disse er generelt udelukket fra yderligere karakterisering, da kun "frequent flyers" er i komplementeringstest sæt. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tid | OD | Kolonier plukket (#) | TS fænotype | Celle-cyklus kandidater |
| 1.5 ' | 0,012 | 6000 (Gennemsnitlig = ~ 200) | 200 (3,3%) | 7 (3,5%) |
| 1 ' | 0,003 | 11.000 | 131 (1,19%) | 15 (11,4%) |
| (Gennemsnitlig = ~ 360) | ||||
| 6E-04 | 9000 | 40 (0,45%) | 1 (2,5%) | |
| (Gennemsnitlig = ~ 300) |
Tabel 1: Kalibrering af Bestråling Times for at maksimere udbyttet af cellecyklus Mutant Kandidater. Tre bestrålingstider blev testet (30 plader hver) med tilsvarende OD at sikre overlevende koloni numre (200 - 600).
Discussion
Den her beskrevne for højt udbytte isolering af ts dødelige mutanter rørledning sikrer, at formentlig alle cellulære-essentiel veje i Chlamydomonas genomet er repræsenteret. De to mest kritiske trin til effektiv opsamling af potentielle cellecyklus gener og til fjernelse af gentagne "frequent flyer" alleler er: 1) en sammenhængende definition af anholdelse fænotype egenskaber for ufuldstændige cellecyklus og 2) den parallelle komplementering assay mod allerede identificerede forespørge gener for at forstørre samlingen med nyligt isolerede dem.
Når synkroniseret af lys-mørke cyklus, Chlamydomonas vokser fotosyntetisk i dagtimerne og stigninger i cellestørrelse> 10x uden DNA-replikation eller celledeling 13. Tilnærmelsesvis sammenfaldende med indtræden af natten, celler undergår derefter flere cyklusser af alternerende DNA-replikation, mitose og celledeling (figur 8). Denne lovgivningsmæssige Scheme tilvejebringer en naturlig skelnen mellem gener primært nødvendige for cellevækst og integritet og gener nødvendige specielt til celledelingscyklussen. Vi fandt, at 10-timers og 20-timers tidspunkter er meget oplysende for en indledende ru fænotypisk cut 1. De brede klasser af ts dødelige mutanter, som vi genkender i øjeblikket, baseret på disse billeder (se SI i Tulin og Cross, 2014) 1, er: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, tidlig lyse, og flere cyklus (figur 8 ).
De tre mest relevante kategorier, vi fokuserer på, er Notch, Popcorn, og runden. De "Notch" og "Popcorn" fænotyper blev vist tidligere at være karakteristisk for de fleste cellecyklus-specifikke læsioner (f.eks mitotisk cyklin-afhængige kinase, DNA-replikation maskiner, og topoisomerase II) 1. Fremkomsten af en (Notch) eller flere (Popcorn) tilsyneladende planer af begyndende men forgæves celledeling er en bekvem Morphological indikator for cellecyklus indvielse. Disse mutanter udviser generelt få eller ingen vækstdefekter med stigninger i cellevolumen ligner WT i 10-timers mærket. Kærven og Popcorn fænotyper er tydelig ved 10 timer og er fuldt udviklede (ofte forbundet med cellelyse) ved 20 timer. "Runde" celler vokser på samme måde som WT men med meget reduceret produktion af tilsyneladende begyndende division fly, hvilket således giver store, runde standsede celler. Tidligere mutanter i denne kategori er faldet i komponenter i anafase-fremmende kompleks 14 eller i gener, der er nødvendige for mikrotubuli funktion (tubulin-foldning cofaktorer, gamma-tubulin ring kompleks) 1. På senere tidspunkter, disse celler ofte udviser udtalt cellelysis.
"Small" og "middel" celler vokser enten ubetydeligt (Small) eller betydeligt mindre end WT (Medium). Mange af disse mutanter identificeret til dato har læsioner i gener, hvis anmærkninger tyder roller i grundlæggende cellular vækst processer (oversættelse eller membran biogenese). Den vigtigste mikroskopiske forskelsbehandling mellem Medium og Round hviler på mængden af vækst på 10 timer (Round: ligesom WT; Medium: reduceret). Fordi Små og mellemstore kategorier er ret store og sandsynligvis afspejler læsioner i et stort udvalg af cellulære veje, er vi ikke forsøger at mætte disse kategorier; Men ønsker vi at molekylært identificere repræsentanter fra klassen til at forstå fænotyper af tab i forskellige veje. To unstudied kategorier er: 1) den tidlige lyse af mutanter, der mister integritet (tab af grøn farve, tab af refraktilitet) med 10-timers-mærket, med få tegn på vækst forudgående celle og 2) de mange cykler. Prolifererer på samme måde som Wt ved 10 og 20 timer, selvom de udviser en fuldstændig manglende evne til at udføre langsigtet proliferation.
Vi er for det meste karakteriserer "hak", "popcorn" og "runde" og udelukke små og mellemstore runde celler, samtsom utætte mutanter at komplette par celledelinger. Dette er primært at sikre, at grundlæggende cellulære funktioner, såsom vækst og membran integritet, er funktionelle og berige sandsynligheden for divisionens-relaterede gener. Denne fremgangsmåde viser sig at være empirisk effektive; kan det imidlertid være, at en cellecyklus genet er pleiotropisk og har yderligere roller tidligere i G1, før egentlig division. Sådanne sager, som vi forventer at være sjældne, er savnet. Mere generelt, sigter vi for homogen anholdelse, hvilket i høj sandsynlighed skyldes en sygdomsfremkaldende mutation, som er en helt dysfunktionel protein. Men af samme grund som netop beskrevet, der kan være flere anholdelse point og derfor en vis fleksibilitet er tilrådeligt i valget kandidater.
For at berige samlingen med nyligt identificerede gener, er de valgte kandidater analyseret for komplementering. Vi kræver TS i den positive kontrol (forespørgsel mod forespørgsel mutation) og ts + i den negative kontrol (querå mod WT). Nye mutanter i samme komplementeringsgruppe som forespørgslen er TS. Medlemskab i samme komplementeringsgruppe næsten altid afspejler en molekylær læsion i det samme gen (dette har været tilfældet for enhver sådant gen vi har testet). Derfor, for "frequent flyers", dette kriterium er ekskluderende for yderligere karakterisering. Mutanter, der ikke var på samme komplementeringsgrupper grupper som de testede forespørgsler er kandidater til nye gener og er yderligere karakteriseret ved bioinformatik og eksperimentelle værktøjer. Meget varierende genvinding af TS- alleler i forskellige komplementeringsgrupper grupper er et velkendt fænomen, det vil sige, variabilitet er markant større end Poisson støj, grundet den store iboende variabilitet af foranderlighed til TS- mellem forskellige gener. Årsager kunne omfatte iboende termolabilitet forskelle; forskellige protein størrelser; tilstedeværelsen af et protein som en monomer versus som en stor, stabiliseret kompleks; og mutagene hot spots. Dette er næsten en ren nuisance. , En resulterende positive resultat er imidlertid, at den "frequent flyer" liste er ikke længe (med kun et par mål, besætter det meste af listen), så arbejdskrævende komplementering test er ikke en massiv virksomhed, indtil de senere faser af projektet.
Som en tilgang, udførte vi en binding assay. I dette assay er dobbelt-resistente afkom udvalgt og testes for TS fænotype. En TS fænotype forventes (og observeret) for mutanter i samme komplementeringsgruppe som forespørgslen eller for tæt knyttet mutationer. For hver af de testede gener, forventes en WT afkom skal vises (ts + fænotype) i en vis sandsynlighed afhængigt af genetiske afstand. Vi vurderer, at der er omkring 100 zygospores for hver parring i disse pletter. Under forudsætning af 100% meiotisk effektivitet, vil dette resultere i omkring 100 dobbelt-resistente afkom fra de tilkoblede lægemiddelresistens kassetter (25% af den meiotiske afkom, fire pr meiose, grundet Mendelian arv). Dette ville også være tilfældet for TS mutationer, hvor 25% af de afkom vil være dobbelt-mutant, og 25% vil være WT hvis forespørgslen og test mutationer er sammenkædet. Derfor ud af dobbelt-resistente afkom, vil 25% være WT (omkring 25 celler). Dette er tilfældet for helt tilkoblede mutationer; dog vil moderat binding (inden ~ 20 cm, ca. 2 Mb, eller 2% af genomet 115) kraftigt reducere eller eliminere ts + signal. I tilfælde af binding af den testede mutation for antibiotikummet kassette, ts + haploider som er dobbelt-resistente forefindes i meget lave mængder. Dette manifesterer sig som tilsyneladende manglende rekombinere med alle testede mutanter, på trods af at supplere alle mutanter testet, en afvigende resultat, der er let bemærket; i sådanne tilfælde vil tilbagekrydsning løse problemet.
Både fra forudgående kendskab og fra sekvensanalyse, forventer vi cellecyklus gener i Chlamydomonas at være omkring 500 gener 2, selv om most, men sandsynligvis ikke alle, er afgørende. Vi vil vurdere nødvendigheden af yderligere mutagenese-runder som flere mutanter indsamles og mætningsniveauet stiger.
Denne procedure er unikt designet til at studere fundamentale biologiske processer og de gener og proteiner, der fører dem ud. Andre metoder til at generere forstyrrelser i essentielle gener eksisterer (fx transformation af tilfældigt mutageniserede alleler 16, betinget transskriberede alleler 17 eller hypomorphic alleler 18). Men de alle kræver homolog rekombination, som er stærkt undertrykt i vegetativ Chlamydomonas. Den klynger, regelmæssigt indbyrdes afstand kort palindromiske gentagelse (CRISPR) / Cas9 systemet er blevet etableret som et effektivt værktøj til gen-modifikation 19; det er imidlertid endnu at arbejde effektivt i Chlamydomonas 20. Kritisk, alle disse metoder kræver forudgående kendskab til målet. Dette er en alvorlig begrænsninghvis man ønsker at have mulighed for at lære noget nyt! Vores tilgang vil give mutationer identificerer væsentlige gener, uafhængige af nogen forudgående viden. Derfor på det nuværende niveau af teknologi, kan isolering af tilfældige ts mutationer efterfulgt af gen-identifikation af dyb sekventering være den mest effektive metode til at få hurtig adgang til mikrobiel cellebiologi i anlægget superkingdom.
Identifikation af sygdomsfremkaldende mutationer (blandt ~ 100 kodning-sekvens skiftende mutationer i hver klon) er uden for rammerne af dette papir. Deep sekventering af bulked segregant pools 1 er effektiv, men arbejdskrævende. En kombinatorisk pool strategi til bestemmelse af alle mutationer i et stort antal stammer, efter sekventering af et lille antal puljer, er meget omkostnings- og arbejdskrævende effektiv. En ny strategi for kombinatorisk bulked segregant sekventering er under udvikling, som vil gøre det muligt at identificere sygdomsfremkaldende mutationer i snesevis af mutanter simultaneously i en enkelt sekventering run (under forberedelse). Disse effektivitetsgevinster er meget vigtigt at give den kritiske gen identifikation skridt for at holde trit med den meget hurtig ophobning af mutanter, der er muliggjort af de procedurer, der er beskrevet her.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen væsentlige økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Cross lab medlemmer for råd og nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af PHS 5RO1-GM078153 og ved en Junior Fellow pris fra Simons Foundation til Michal Breker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
| MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
| Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
| Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
| Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials: | |||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |
References
- Tulin, F., Cross, F. R. A microbial avenue to cell cycle control in the plant superkingdom. Plant Cell. 26, 4019-4038 (2014).
- Cross, F. R., Umen, J. G. The Chlamydomonas cell cycle. Plant J. 82, 370-392 (2015).
- Li, X., et al. An Indexed, Mapped Mutant Library Enables Reverse Genetics Studies of Biological Processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell. 28, 367-387 (2016).
- Tulin, F., Cross, F. R. Cyclin-Dependent Kinase Regulation of Diurnal Transcription in Chlamydomonas. Plant Cell. 27, 2727-2742 (2015).
- Simchen, G. Cell cycle mutants. Annu. Rev. Genet. 12, 161-191 (1978).
- Hartwell, L. H., Culotti, J., Reid, B. Genetic control of the cell-division cycle in yeast. I. Detection of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 66, 352-359 (1970).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat. Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell. 30, 248-258 (2008).
- Harris, E. The Chlamydomonas Sourcebook: Introduction into Chlamydomonas and Its Laboratory Use. , Elsevier Academic Press. (2008).
- Dutcher, S. K. Mating and tetrad analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Methods Cell Biol. 47, 531-540 (1995).
- Gill, S. S., Anjum, N. A., Gill, R., Jha, M., Tuteja, N. DNA damage and repair in plants under ultraviolet and ionizing radiations. Sci World J. 2015, 250158 (2015).
- Liu, Z., Wang, L., Zhong, D. Dynamics and mechanisms of DNA repair by photolyase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 11933-11949 (2015).
- Francis, D. Cell cycle control and plant development. Annual Plant Reviews, Volume 32. Ann. Bot. 101, 1049-1050 (2008).
- Zachariae, W., Nasmyth, K. Whose end is destruction: cell division and the anaphase-promoting complex. Genes Dev. 13, 2039-2058 (1999).
- Merchant, S. S., et al. The Chlamydomonas genome reveals the evolution of key animal and plant functions. Science. 318, 245-250 (2007).
- Ben-Aroya, S., et al. Toward a comprehensive temperature-sensitive mutant repository of the essential genes of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. 30, 248-258 (2008).
- Mnaimneh, S., et al. Exploration of essential gene functions via titratable promoter alleles. Cell. 118, 31-44 (2004).
- Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Jiang, W., Brueggeman, A. J., Horken, K. M., Plucinak, T. M., Weeks, D. P. Successful transient expression of Cas9 and single guide RNA genes in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot. Cell. 13, 1465-1469 (2014).
