Introduction
Технология гибридомная , представленная в настоящем протоколе впервые был описан Келером и Мильштейн 1 в 1975 году , и, за исключением некоторых технических усовершенствований , за исключением того , основная процедура не сильно изменилась за последние 40 лет 2. Целью данного протокола является разъяснение более подходящей стратегии иммунизации, стандартный метод для генерации моноклональных антител, а также пример для метода проверки (ELISA).
Антитела представляют собой невероятные инструменты и внести свой вклад в широкий диапазон технологических подходов, таких как поточной цитометрии, магнитной сортировки клеток, или иммунофлюоресценции, а также для диагностических и терапевтических возможностей для контроля и лечения заболеваний 3. Коммерческой доступности моноклональных антител для желаемых целей свидетельствует наличие более чем 24 различных веб - баз данных с почти бесчисленные количества антител или продуктов антител , связанных с 4 -х . В 2015 годуntibody молекулы были частью международной дискуссии 5-7 из - за серьезных проблем в надлежащей проверки и определения характеристик коммерчески доступных антител.
Это может быть трудным и дорогостоящим, чтобы найти специфические антитела для целевого антигена, и часто, они не имеют сродства или специфичности необходимо. Несмотря на то, генерируя антитела по-прежнему отнимает много времени и требует квалифицированного персонала для разработки и проверки антитела, получения антитела по отдельности может лучше, чем покупать один.
В связи с тем, что продукция антител отнимает много времени и требует опыта, были разработаны альтернативные способы получения связывающих молекул, чтобы преодолеть эти проблемы. Наиболее часто используемым альтернативным методом является рекомбинантное получение одноцепочечных антител с помощью фагового дисплея. Гены вариабельной области связывания извлекаются из клеток и в сочетании с белком покрытия фага. В sIngle цепь затем экспрессируется на поверхности бактериофага и подвергают скринингу в нескольких панорамирование 8 шагов. Получение одноцепочечных антител немного быстрее, но он также требует квалифицированного экспериментатора. К недостаткам некоторых рекомбинантных одноцепочечных антител являются бедными стабильность и отсутствие пригодности для диагностики в лабораторных условиях . В большинстве диагностических тестов, ЯК-рецептор для обнаружения необходимо, которая должна быть добавлена к рекомбинантным одноцепочечных антител после этого. Опять же, это отнимает много времени и еще более сложным, чем техника гибридом. В диагностике в пробирке, полнометражные моноклональное мыши и антитела кролика были продемонстрированы быть лучшим выбором.
Одним из важнейших шагов в создании моноклональных антител должно быть сделано до того, как работа в лаборатории начинается: дизайн иммуноконъюгата. Вопросы, которые необходимо решить, являются: Каков физический состав мишени в конечном APPLICATиона, и где матрицы присутствуют? Какая концентрация будет иметь цель в приложении? Что такое окончательное приложение, и каковы требования, что антитело должен удовлетворять?
Всегда принимать во внимание, что если используется линейный пептидный фрагмент, он также должен быть линейным в конечном эпитоп в мишени выбора; в противном случае, это антитело не будет связываться. Конечно, независимо от метода скрининга, антитела могут быть выбраны, чтобы распознавать различные антигенные форматы в различных приложениях, но это должно быть подтверждено очень точно. Вот причины, почему антитела разработки и валидации являются такие амбициозные процессы.
Выбор антигенной формата для иммунизации имеет основополагающее значение для развития антител и определяет успех или неудачу этого процесса. После того, как мыши, проявляющие соответствующий титр антител, клетки селезенки выдел ют и сливают с клетками миеломы. Наиболее распространенные миеломы клеточные линии дляРазвитие мышиные моноклональные антитела являются X63-Ag 8,653 9 и Sp2 / 0-Ag 14 10 из / с мышиного штамма Balb. Клетки происходят от злокачественной лимфомы В-клеток, и были выбраны потому, что они не секретируют какие-либо из своих собственных тяжелой или легкой цепи. Клетки могут быть адаптированы к соотношении от 1:10 до 10: 1 (спленоциты в сравнении с клетками миеломы). В этом протоколе клетки были адаптированы к соотношении 3: 1 , и слитый с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и электросваркой, в соответствии с Stoicheva и Hui 11.
Слияние В-клеток и клеток миеломы является случайным процессом. Следовательно, гибриды двух В-лимфоциты или две клетки миеломы может быть сгенерирован, но эти гибриды не смогли бы выжить в течение длительного времени в культуре. Клетки проходят отбор гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), в которой только слитые клетки гибридомы могут выжить из - за возможности использования De Novo пути синтеза пиримидинов. Для поколения пнoclonal антитела, необходимо, чтобы получить линию клеток, происходящих из одной материнской клетки. Моноклональности обеспечивается путем ограничения методов разрежения и микроскопический анализ клеточного роста. Супернатанты культуры гибридомы подвергают скринингу на специфических антител, в основном, с помощью ELISA или проточной цитометрии, и лучшие связующие выбраны. После массовой культуры и очистки, молекула антитела, наконец, могут быть охарактеризованы и утверждены для желаемого применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / с или NMRI мышей (Mus Musculus) из нашей гнездовой колонии в университете Потсдама (Потсдам, Германия) были использованы для получения моноклональных антител. Работа животных была проведена в соответствии с соответствующими национальными и международными стандартами. Исследование было одобрено Министерством Бранденбург окружающей среды, здоровья и защиты прав потребителей (номер ссылки V3-2347-A16-4-2012).
1. Приготовление иммуноконъюгатов
- Для связывания антигена с носителем, используют стандартные протоколы связи через амино-, карбокси или сульфо-группы, такие как глутаровый альдегид, путем N - (3-диметиламинопропил) - N -ethylcarbodiimide (EDC), или N - [Y-maleimidobutyryloxy ] сукцинимид эфир (сульфо-GMBS).
- Для связи (например, с помощью глутарового альдегида) 13, используют целевой белок или пептид и носитель (овальбумина, бычий сывороточный альбумин, или гемоцианин) в соотношении 1: 1. Развести целевой прotein или пептида в фосфатно-солевом буфере (PBS) и белком - носителем , в 50 мМ NaHCO 3 буфера. Адаптировать объем и концентрацию в количестве, необходимом для иммунизации.
- Смешайте оба раствора и добавить 1,25% глутаральдегида. Смешать и инкубировать образец в течение 4 ч при комнатной температуре (RT). Для того, чтобы выбрать гибридомные клетки, сделать то же самое иммуноконъюгата, но с другим носителем, для того, чтобы избежать выбора неспецифических связующих носителей.
- Диализировать образец муфты путем выполнения быстрого диализ с коммерческой грубой смолой (например, Sephadex G25).
- Перфорируйте в нижней части реакционной ампуле 1,5 мл с полой иглой и поместить его в пробирку объемом 15 мл. Поместите стекловату в нижней части для уплотнения и покрыть ее с 300 мг грубой смолы (до калибровочной отметки 0,5 мл).
- Осторожно, положить 1 мл PBS по каплям в реакционную пробирку 1,5 мл и убедитесь, что стекловата еще герметизация перфорацию. Пусть грубой смолы Sну и центрифуга колонку при 500 мкг в течение 2 мин. Один такой столбец может быть использован для диализировать 200 мкл образца связи. Для большего объема, сделать несколько столбцов.
- Измените трубку и поместите раствор муфты на опухшей грубой смолой. Центрифуга снова при 500 мкг в течение 2 мин. Извлеките элюент из трубы и использовать его для иммунизации.
2. Иммунизация животных
- Выберите два или три от 6 до 12-недельного возраста Balb / C мышей для иммунизации.
- Для одного животного, подготовить 150 - 200 мкг иммуноконъюгата в 200 мкл PBS и смешать его с 100 мкл полной Freund's адъювантной (CFA). Приготовьте раствор 3 раза с короткой и тонкой иглой (0,6 мм в диаметре) на шприц 1 мл. Вводят раствор внутрибрюшинно в мышь.
- Дайте ревакцинации через 6 недель с тем же самым количеством иммуноконъюгата, но без CFA. Возьмите кровь через 7 дней (из ретроорбитального пазухи) и Подготовительномповторно сыворотке путем инкубирования крови в течение 3-х - 4 ч при комнатной температуре (RT).
- Центрифуга смесь при 3000 х г в течение 5 мин. Возьмите сывороточный супернатант и перенести его в новую пробирку. Хранить при -20 ° С. Выбросите осадок.
- Анализ сывороток с помощью ELISA, как описано в шаге 3. Для слияния, выбрать мышь с наивысшим титром сыворотки.
- В рамках подготовки к слиянию клеток, повысить мышь с 150 - 200 мкг иммуноконъюгата в 300 мкл PBS без адъюванта всего 4 дня до слияния.
3. ELISA
- Готовят раствор антигена с концентрацией 5 мкг / мл в PBS и переносят 50 мкл в каждую ELISA лунку 96-луночного планшета.
- Инкубируйте планшет в течение 2 ч при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 ° С во влажной камере.
- Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой. Блок лунки 80 мкл PBS / 5% неонатальной сыворотки теленка (NCS) на лунку в течение 1 ч при комнатной температуре во влажной чянтарный. Подготовьте разведений сыворотки в соотношении 1: 5 серии, начиная с 1:50. Для анализа клеточной культуры, используют неразбавленный супернатант культуры.
- Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой. 50 мкл образца на лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре во влажной камере. Приготовьте раствор вторичного антитела в отношении 1: 5000 разбавлением козьего анти-мышиного IgG антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP).
- Промыть пластины 3 раза с водопроводной водой и добавляют 50 мкл вторичного раствора антител на лунку. Инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре во влажной камере.
- Приготовить свежий раствор субстрата. Сделайте исходные растворы 0,1 М NaH 2 PO 4 и 0,1% перекиси водорода. Взять 5 частей NaH 2 PO 4, 4 части перекиси водорода и 1 часть тетраметилбензидина для раствора свежего субстрата.
- Промыть пластины 10 раз водопроводной водой. 50 мкл свежего раствора субстрата в лунки и инкубировать в течение 5 - 10 мин втемно.
- Остановить реакцию с 50 мкл 1 М H 2 SO 4 в каждую лунку. С помощью планшет-ридера, измеряют оптическую плотность при длине волны 450 нм с эталонной длины волны при 630 нм.
4. Подготовка миеломы клеточных культур
- С этого момента, выполнить все работы в стерильных условиях.
- Приготовьте свежую культуральную среду для культивирования клеток. Дополнение 500 мл RPMI1640 с 10% эмбриональной сыворотки теленка (50 мл), 2 мМ L-глутамина (5 мл) и 50 мкМ меркаптоэтанола (5 мл). Подставьте глютамин каждые 7 дней.
- Оттепель флакон мышиных SP2 / 0 клеток в теплой воде. Переносят раствор клеток в 10 мл свежей культуральной среды и центрифугировать в течение 10 мин при 200 х г. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 1 мл свежей культуральной среды.
- Передача клеток в 25 см 2 колбу и инкубировать их при 37 ° С и 5% СО 2 в инкубаторе. Расширить клетки к двум 75-м 2 колбах BEFРуда фьюжн. Сбережение аликвоты для длительного хранения, как описано в шаге 7.
5. Подготовка питающих клеток
- Пожертвуйте 12-недельных NMRI мыши ( в соответствии с национальными и институциональных руководящих принципов; например, CO 2 ингаляции). Удалите мех и очистить живота с 70% этанола.
- Вводят 5 мл охлажденного льдом RPMI среды в живот, массаж живота с пинцета, и аспирация суспензии клеток-фидеров. Поместите клетки в пустой 50-мл пробирку. Выполните этот шаг еще раз. От 7 до 10 мл клеточной суспензии фидера должна быть восстановлена.
- Приготовьте 100 мл питатель суспензии клеток путем добавления 90 мл культуральной среды с полной клеток (RPMI 1640, 10% фетальной сыворотки теленка, 2 мМ глутамина и 50 мкМ меркаптоэтанола). Смешайте его и передать 100 мкл / лунку в 10 х 96-луночный культуральный пластин. Инкубируйте пластин в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в инкубаторе.
6. Cell Fusion
- Жертвуют иммунизированной мыши путем смещения шейных позвонков или CO 2 ингаляции и акцизный селезенку 14. Взять дополнительную кровь от сердца и готовят сыворотку, как описано на стадии 2.3, в качестве положительного контроля в ELISA.
- Подготовка суспензии клеток селезенки, нажав на селезенку через клеточный фильтр. Наполните до 20 мл с полной клеточной культуральной среды. Сбора клеток в 50 мл пробирки с помощью центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С). Удалите супернатант.
- Смыва колбы для культивирования клеток и сбора клеток миеломы путем центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С) и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют клеточный дебрис в 20 мл сбалансированного солевого буфера (БСС) (125 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 4 мМ CaCl 2, 2,5 мМ MgCl 2 и 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4) и центрифугируют снова. Повторить стадии промывки три раза.
- Для регулировки спленоцитов: соотношение клеток миеломы, подсчет клеток после второй стадии промывки пихтовымиулица ресуспендирования осадка в 1 мл буфера ПБС. Сделать разведение 1:10 и передачи 10 мкл в камере подсчета клеток. Граф клеток и определяют концентрацию клеток в 1 мл.
- Регулировка числа клеток в буфере БС, на три части спленоцитов и однокомпонентных клетками миеломы в конечном объеме 1 мл. Взять 200 мкл клеточной суспензии и смешать его с 200 мкл PEG8000 (1 г в 4 мл буфера BSS). Перенести 400 мкл в кювету для электропорации с диаметром 2 мм и установить импульс (600 - 650 В и 25 мс).
- После того, как импульс, инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 3 мин в кювету. Удалить клетки и поместить их по каплям в колбу Эрленмейера с 100 мл среды НАТ (RPMI 1640, 10% FCS, 2 мМ глутамина, 50 мкМ меркаптоэтанола, 100 мкМ гипоксантина, 5,8 мкМ azaserine, и 16 мкМ тимидина).
- Повторите слитого 4 раза до тех пор, партия 1-мл не расходуется. Выдержите коническую колбу в течение 3 ч при 37 ° С и 5% CO 2в инкубаторе.
- Дополнение клеточной суспензии снова с гипоксантин, azaserine и тимидин, прежде чем покрытие клеток на фидерного слоя. Добавьте 100 мкл суспензии клеток на лунку на слой пластин фидерных и инкубировать пластин при 37 ° С и 5% CO 2 (в термостате). Конечная концентрация в скважине должна быть не менее 100 мкМ гипоксантина, 5,8 мкМ azaserine и 16 мкМ тимидина.
- Провести микроскопический анализ (увеличение: 10х объектив, 10x окуляр) для клонального роста в каждую лунку пластины через 7 дней для того, чтобы определить, есть ли данные скважины моно- или поликлональными. Моноклональные клетки один кластер из клеток, происходящих из одной единственной клетки. Поликлональные клетки множественные скопления клеток в одной скважине. Изменение полной среды через 7 дней и снова инкубировать в течение 7 дней в среде НАТ.
- Изменение среды НАТ и культивирования клеток в полной среде для культивирования клеток. Используйте супернатант для выполнения ELISA, как описано в шаге 3. Позитивные гибридомные клетки должны быть расширены в 24-луночные планшеты в соответствии с тестами для получения специфических антител. Если клетки поликлональные, ограниченное разведение должно быть выполнено (описано на шаге 8).
7. Криоконсервация гибридом
- Cryoconserve положительный моно- и поликлональные гибридом для длительного хранения. Сбора клеток из 24-луночного планшета с впадения> 60% путем центрифугирования (200 мкг, 10 мин и 4 ° С).
- Ресуспендируют осадок в 500 мкл полной среды для культивирования клеток и перевести его в криоскопической пробирки. Добавить 500 мкл сублимационной среды (RPMI 1640, 20% FCS и 15% диметилсульфоксида), смешать его, и положил его в в пенопластовую коробку или специальный ящик замерзания. Хранить при температуре -80 ° С в течение 3-х дней. После 3-х дней, криоскопической может быть переведен в жидкий азот для длительного хранения.
8. Ограничение разбавление поликлональных гибридом
- Makеа фидерного слоя культуры, как описано в шаге 5. Урожай положительные поликлональные клетки, как описано в шаге 7.1. Граф клеток, как описано в шаге 6.5, и регулировать количество клеток до 10 клеток / мл, с получением конечного объема 10 мл в течение 96-луночного планшета. Добавьте 100 мкл / лунку на фидерный слой.
- Выдержите в течение 7 дней при 37 ° С и анализируют рост клонов микроскопически (увеличение: 10х Линза объектива, 10x окуляр). Сделать ELISA из супернатанта культуры, как описано в шаге 3, и определить соответствующие моноклональные гибридом в массовой культуре.
9. Массовая культура и очистка моноклональных антител
- Перенесите моноклональные гибридом с соответствующими сигналами ELISA на 25 см 2 или 75 см 2 колбах и собирают до 500 мл супернатанта культуры. Тестирование культуры еженедельно для специфических антител и сохранить 3 - 5 аликвот за гибридом для длительного хранения, как описано в шаге 7.
- Готовят колонку с белком А путем ее промывки промывочным буфером (разбавить связывающим буфером 1: 3 в дН 2 O). Пропускают супернатант со стадии 9.2 над колонной и собирать проточные. Элюции связанное антитело с помощью 0,1 М цитрата, рН 3,5, и сразу же нейтрализуют рН с 500 мкл Трис-HCl, рН 9,0.
- Охарактеризовать элюированного антитела в SDS-PAGE, вестерн-блот и ELISA, и проверить его для конечного применения.
- Для PAGE SDS, принимают 3 - 5 мкг очищенного раствора антител на полосу (образец 20-мкл), добавляют 5 мкл 4х SDS загрузки образца буфера (8% SDS, 20% 2-меркаптоэтанола, 40% глицерина и 0.015 % бромфенол, снижается), и нагревать зонды при 95 ° с в течение 5 мин. В качестве контроля используют один и тот же образец с очистилиntibody того же изотипа, но нерелевантной специфичности.
- Загрузка образцов на SDS геле 12,5%, поместите 5 мкл неокрашенной белка лестницы в дополнительной полосе, и разделить их с помощью электрофореза. Пятно гель Кумасси бриллиантовым синим и документировать результаты. Основной протокол SDS был создан Лаеммли в 1970 году 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан пример антиген-специфического сывороточного титра для одной иммунизации , выполняемой в лаборатории. На этой фигуре, иммунных сывороток А и В были титрованию от 1:50 до 1: 5000000 по сравнению с сывороткой наивных мыши. Антиген был нанесен на твердой фазе, и специфические антитела были обнаружены с бобе-конъюгированные козьи антитела против мышиного Ig антителом. Оба сыворотках иммунизированных мышей показали значительно более высокий антигенспецифический титра по сравнению с наивным мыши. Сигнал при разведении 1: 5000, достаточно, чтобы перейти к следующему шагу, слияния клеток.
Рост гибридом был виден после 7 до 10 дней селекции HAT развитием клеточных клонов, как показано на рисунке 2. Снимок был сделан из 96-луночного планшета через 10 дней после слияния. Клеточные клоны и aminopterinemono- или поликлональность скважинконтролировали с помощью отдельного микроскопического анализа (увеличение: 10х объектив, 10x окуляр). Моноклональные скважины были помечены с точкой на верхней части пластины. Когда пластины тестировали в ELISA, антиген-специфические сигналы от моноклональных гибридом, могут быть легко идентифицированы. Положительные культур гибридомы клонировали, расширены, и криоконсервированных, пока культура не была моноклональное, стабильным, и антиген-специфические. Культуральный супернатант собирали в течение времени культивирования с целью очистки полученного с помощью моноклонального антитела, белок А-опосредованной аффинной хроматографии. На рисунке 3 показан стандартный профиль элюции моноклональное антитело с IgG1 изотипа.
Очищенные моноклональные антитела дополнительно характеризуется Страницу SDS, как показано на рисунке 4. На 50 и 25 кДа, тяжелые и легкие цепи были хорошо видны, что указывает на очищение молекулы антитела. Lane 2 showed контрольного антитела с тем же изотипа.
Рисунок 1: Сыворотка Титрование после иммунизации. Сыворотки от двух мышей титруют в разведениях от 1:50 до 1: 5000000 и испытаны для антигенной специфичности с помощью ELISA. В качестве контрольной сыворотке неиммунизированных мышей использовали в разведении 1:50. Антиген-специфические сигналы были положительными для обоих иммунизированных мышей, а спленоцитов мыши A были использованы для генерации гибридом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Фотографии Моно- и поликлональные гибридом. Моно- и поликлональные гипbridomas были микроскопически проанализированы через 10 дней после слияния клеток. Изображения показывают обычный результат для стабильных гибридомных клеточных линий с помощью моноклональных (А) и поликлональных (B) свойств. Шкала бар: 10 мкм; B Шкалы: 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Стандартный элюирования профиль для моноклональному антителу с изотип IgG1. Сгенерированный моноклональное антитело очищали с помощью протеин А-опосредованной аффинной хроматографии, и элюирование профиль из антитела IgG1 показано на рисунке. Первый пик указывает, элюированного моноклональное молекулу антитела, при рН 5,0. Следующие пики показывают, рН 3,5 и рН 2,0. Снижение рН необходимочтобы полностью очистить колонку всех веществ и регенерации матрицы столбцов для последующих очисток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Стандартный SDS PAGE для моноклональное антитело с IgG1 изотипа. Чистота элюента антител определяли с помощью Кумасси-окрашенном SDS-PAGE. 5 мкг раствора антител были применены к L2 и по сравнению с 5 мкг стандартного антитела IgG1 в L3 в условиях уменьшенного. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Генерирование моноклональных антител с помощью гибридомной технологии требует интенсивного и детального анализа антигенной детерминанты, в особенности в отношении конечного применения, когда антитело должно распознавать цели. Это часто недооценивается пользователей и приводит к антителам со слабыми выступлениями. Процесс сварки всегда случайным образом, а это значит, что исход специфических гибридом сильно зависит от соотношения клеток и жизнеспособность в этой точке. После ограниченного разбавления, клетки очень неустойчивы и требуют строгого контроля роста клеток и выработки антител. Эти параметры должны быть тщательно проанализированы при устранении метода.
Дальнейшие ограничения методики включают в себя время, необходимое для генерации клеточной линии и выбор требуемого, продуцирующих антитела клетки. В связи с тетраплоидном набором хромосом после слияния, клетки очень нестабильны, а затем уменьшить набор, чтобы снова гаплоидных. Это могло, это можетприводят к потере генов антител, связанных, в результате чего клетки не продуцируют антитела больше. Другим ограничением является то, что выбор требуемых клеток, продуцирующих антитела, основан на культуральный супернатант и не на очищенных растворов антител. Таким образом, окончательное характеристика антитела, в большинстве случаев, только после того, как это возможно массовой культуры выбранного гибридом клона. Таким образом, риск того, что антитело не может работать в конечном применении очень высока.
Некоторые технологические модификации, такие как анализ лазерной поддержкой и технологии обработки (LEAP) 16, сродства поверхности захвата экрана (УПВРД) 17, или гель технологии микрокапельной 18, были описаны для того , чтобы обойти недостатки при выборе подходящих антител. Все эти методы способны улучшить различные аспекты производства гибридом и отбора, но большинство из них требуют дорогостоящего оборудования или оптимизацию для каждой отдельной ячейки Liпе 16.
Еще одно усовершенствование или модификация , которая была разработана в нашей лаборатории является новая стратегия иммунизации химерных вирусных частиц (VLPs), как описано в Мессершмидт и др 19. Частицы могут быть модифицированы с помощью искомых последовательностей эпитопов, встроенных в вирусной структуре оболочки и отображенных на поверхности этих частиц. Это приводит к очень быстрой и конкретной иммунизации через 4 недели в соответствующих животных. Сформированные моноклональные антитела IgG2 или IgG1 изотипы и зависят от выбора эпитопов высокой специфичностью к нативным антигеном. Мы также разработали конкретный шаг выбора для гибридомных клеток с помощью искусственных маркеров клеточной поверхности. Используемые трансгенные клетки миеломы отображать стабильно вставленный поверхностный маркер. Этот поверхностный маркер может использоваться для антиген- или изотипу специально сортировки клеток гибридомы непосредственно после плавления, без ограничения разбавления и без чрезмерного скрининга ELISA,а на самом деле необходимо в традиционной гибридомной технологии 20.
Как упоминалось выше, существуют некоторые перспективные альтернативы, имеющиеся в моноклонального антитела поколения, которые, в будущем, может улучшить обработку и уменьшить недостатки существующей технологии гибридом. Тем не менее, эта процедура всегда будет требовать подробной идентификации желаемый эпитоп в сочетании с жестким и тщательно спланированного приложения таким образом, что генерируемая моноклональное антитело работает успешно. Поколение моноклональных антител гибридомой технологии будет важным и необходимым шагом в будущем из-за огромного спроса в области науки, диагностики и терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
