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Immunology and Infection

हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा Murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी

Published: January 2, 2017 doi: 10.3791/54832
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Biology, University of Potsdam

Introduction

हाइब्रिडोमा इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत प्रौद्योगिकी पहले कोहलर और 1975 में Milstein 1 से वर्णित किया गया था और कुछ तकनीकी सुधार के अलावा, मुख्य प्रक्रिया नहीं नाटकीय रूप से पिछले 40 वर्षों के दौरान 2 बदल गया है। इस प्रोटोकॉल के उद्देश्य के लिए एक अधिक उचित टीकाकरण रणनीति, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए एक मानक तरीका है, और एक सत्यापन विधि (एलिसा) के लिए एक उदाहरण समझाने के लिए है।

एंटीबॉडी अविश्वसनीय उपकरण हैं और रोग निगरानी और उपचार 3 के लिए नैदानिक और चिकित्सीय विकल्प के रूप में, इस तरह से फ्लो, चुंबकीय सेल छँटाई, या immunofluorescence के रूप में तकनीकी दृष्टिकोण, की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए योगदान के रूप में अच्छी तरह से। वांछित लक्ष्यों के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की वाणिज्यिक उपलब्धता एंटीबॉडी या एंटीबॉडी से संबंधित उत्पादों 4 के लगभग अनगिनत मात्रा के साथ 24 से अधिक विभिन्न वेब डेटाबेस की मौजूदगी से प्रदर्शन किया है। 2015 में, एकntibody अणुओं उचित सत्यापन और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के लक्षण वर्णन में गंभीर समस्याओं के कारण एक अंतरराष्ट्रीय चर्चा 5-7 का हिस्सा थे।

यह एक लक्षित प्रतिजन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी खोजने के लिए मुश्किल और महंगा हो सकता है, और अक्सर, वे समानता या विशिष्टता की जरूरत नहीं है। हालांकि एक एंटीबॉडी पैदा अभी भी समय लेने वाली है और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है विकसित करने और एंटीबॉडी मान्य करने के लिए, अलग-अलग हो सकता है एक खरीदने की तुलना में बेहतर है एक एंटीबॉडी का निर्माण किया।

तथ्य यह है कि एंटीबॉडी उत्पादन समय लेने वाली है और अनुभव की आवश्यकता के कारण, बाध्यकारी अणुओं के उत्पादन के लिए वैकल्पिक तरीकों इन समस्याओं को दूर करने के लिए विकसित किए गए। सबसे अधिक इस्तेमाल किया वैकल्पिक विधि फेज प्रदर्शन के माध्यम से एकल श्रृंखला एंटीबॉडी की पुनः संयोजक उत्पादन होता है। चर बाध्यकारी क्षेत्र के लिए जीन कोशिकाओं से निकाले और एक फेज की कोटिंग प्रोटीन के साथ संयुक्त कर रहे हैं। रोंचिमनी श्रृंखला फिर एक जीवाणुभोजी की सतह पर व्यक्त की है और कई पैनिंग कदम 8 में जांच की है। एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के उत्पादन थोड़ा तेज है, लेकिन यह भी एक कुशल experimentalist की आवश्यकता है। कुछ पुनः संयोजक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी का नुकसान गरीब स्थिरता और इन विट्रो निदान के लिए उपयुक्तता की कमी कर रहे हैं। सबसे नैदानिक ​​परीक्षणों में, पता लगाने के लिए एक एफसी रिसेप्टर जो बाद में एक पुनः संयोजक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी को जोड़ा जाना चाहिए आवश्यक है। फिर, यह समय लेने वाली और हाइब्रिडोमा तकनीक की तुलना में भी अधिक जटिल है। इन विट्रो निदान में, पूर्ण लंबाई मोनोक्लोनल एंटीबॉडी माउस और खरगोश सबसे अच्छा विकल्प हो करने के लिए प्रदर्शन किया गया है।

immunoconjugate के डिजाइन: इससे पहले कि प्रयोगशाला में काम शुरू होता है मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पैदा करने में प्रमुख कदमों में से एक किया जाना चाहिए। सवालों को संबोधित किए जाने की जरूरत है कि कर रहे हैं: अंतिम अनुप्रयोगों में लक्ष्य की शारीरिक संरचना क्या हैआयन, और जो matrices मौजूद हैं? जो एकाग्रता लक्ष्य आवेदन में होगा? क्या अंतिम आवेदन है, और आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए कि एंटीबॉडी क्या कर रहे हैं?

हमेशा खाते में लेने के लिए अगर एक रेखीय पेप्टाइड टुकड़ा प्रयोग किया जाता है, यह भी पसंद का लक्ष्य फाइनल में मिलान में रैखिक हो गया है कि; अन्यथा, एंटीबॉडी के लिए बाध्य नहीं होंगे। बेशक, स्क्रीनिंग विधि के स्वतंत्र, एंटीबॉडी विभिन्न अनुप्रयोगों में विभिन्न स्वरूपों प्रतिजनी पहचान करने के लिए चयनित किया जा सकता है, लेकिन यह बहुत ठीक मान्य किया जाना चाहिए। इन वजहों से एंटीबॉडी विकास और सत्यापन ऐसी महत्वाकांक्षी प्रक्रियाओं कर रहे हैं।

टीकाकरण के लिए प्रतिजनी प्रारूप के चुनाव एंटीबॉडी के विकास के लिए मौलिक है और सफलता या इस प्रक्रिया की विफलता निर्धारित करता है। एक बार जब चूहों एक प्रासंगिक एंटीबॉडी अनुमापांक एक्सप्रेस, तिल्ली कोशिकाओं को अलग और मायलोमा कोशिकाओं के साथ जुड़े हुए हैं। के लिए सबसे आम मायलोमा सेल लाइनोंmurine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकास X63-एजी 8.653 9 और SP2 / एक / Balb ग माउस तनाव से 0-एजी 14 10 हैं। कोशिकाओं को एक घातक बी सेल लिंफोमा से उतरना और क्योंकि वे अपने ही भारी या हल्के चेन के किसी भी छिपाना नहीं है चयन किया गया था। 1 (मायलोमा कोशिकाओं बनाम splenocytes): कोशिकाओं 1:10 और 10 के बीच एक अनुपात करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Stoicheva और हुई 11 के अनुसार 1 और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) और Electrofusion से इनकार,: इस प्रोटोकॉल में, 3 कोशिकाओं का एक अनुपात करने के लिए अनुकूलित किया गया।

बी कोशिकाओं और मायलोमा कोशिकाओं के संलयन एक यादृच्छिक प्रक्रिया है। इसलिए, दो बी लिम्फोसाइट या दो मायलोमा कोशिकाओं की संकर उत्पन्न किया जा सकता है, लेकिन उन संकर संस्कृति में एक लंबे समय के लिए जीवित करने में सक्षम नहीं होगा। कोशिकाओं को एक hypoxanthine, aminopterin, और thymidine (टोपी) चयन, जिसके द्वारा ही जुड़े हुए हाइब्रिडोमा कोशिकाओं pyrimidine संश्लेषण की नए सिरे से मार्ग के उपयोग की संभावना के कारण जीवित रह सकते हैं गुज़रना पड़ता है। सोम की पीढ़ी के लिएoclonal एंटीबॉडी, यह एक सेल लाइन एक मां सेल से होने वाले प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। monoclonality कमजोर पड़ने तकनीकों और सेल के विकास के सूक्ष्म विश्लेषण के सीमित द्वारा सुनिश्चित किया जाता है। हाइब्रिडोमा संस्कृति supernatants, विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए जांच कर रहे हैं ज्यादातर एलिसा द्वारा या प्रवाह cytometry, और सबसे अच्छा बाँधने चुने गए हैं। जन संस्कृति और शुद्धि के बाद, एंटीबॉडी अणु अंत में विशेषता है और वांछित आवेदन के लिए मान्य किया जा सकता।

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Protocol

Balb / सी या पॉट्सडैम विश्वविद्यालय (पॉट्सडैम, जर्मनी) में हमारे प्रजनन कॉलोनी से NMRI चूहों (मस मस्कुलस) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया। पशु काम प्रासंगिक राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया। अध्ययन पर्यावरण, स्वास्थ्य के ब्रांडेनबर्ग मंत्रालय, और उपभोक्ता संरक्षण (संदर्भ संख्या V3-2347-A16-4-2012) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. Immunoconjugates की तैयारी

  1. एक वाहक करने के लिए प्रतिजन युग्मन के लिए, amino- के माध्यम से मानक युग्मन प्रोटोकॉल का उपयोग करें, इस तरह के glutaraldehyde, एन के रूप में carboxy, या sulfo-समूहों, - (3-dimethylaminopropyl) - एन -ethylcarbodiimide (ईडीसी), या एन - [वाई-maleimidobutyryloxy ] succinimide एस्टर (sulfo-GMBS)।
  2. : 1 के अनुपात युग्मन (जैसे, glutaraldehyde) के साथ 13 के लिए, एक 1 में लक्ष्य प्रोटीन या पेप्टाइड और वाहक (ovalbumin, गोजातीय सीरम albumin, या ताली लगाने का छेद लंगड़ाहट hemocyanin) का उपयोग करें। लक्ष्य जनसंपर्क पतलाotein या फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) और 50 मिमी 3 NaHCO बफर में वाहक प्रोटीन में पेप्टाइड। मात्रा और राशि टीकाकरण के लिए आवश्यक करने के लिए एकाग्रता को अपनाना।
    1. दोनों के समाधान मिक्स और 1.25% glutaraldehyde जोड़ें। मिक्स और कमरे के तापमान पर 4 घंटे (आरटी) के लिए नमूना सेते हैं। हाइब्रिडोमा कक्षों का चयन करने के लिए, एक ही immunoconjugate बना है, लेकिन एक और वाहक के साथ, क्रम में unspecific वाहक बाँधने के चयन से बचने के लिए।
  3. वाणिज्यिक मोटे राल (जैसे, Sephadex G25) के साथ एक तेजी से डायलिसिस प्रदर्शन से युग्मन नमूना Dialyze।
    1. एक खोखले सुई के साथ एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया शीशी के नीचे छेदना और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह है। सील करने के लिए नीचे में कांच ऊन रखो और मोटे राल (0.5 एमएल की जांच के निशान के लिए) के 300 मिलीग्राम के साथ कवर।
    2. ध्यान से, एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब में 1 एमएल पीबीएस dropwise डाल दिया है और यकीन है कि कांच ऊन अभी भी वेध सील करना है। चलो मोटे राल रोंअच्छी तरह से और सेंट्रीफ्यूज 2 मिनट के लिए 500 XG पर स्तंभ। ऐसा ही एक स्तंभ युग्मन नमूना के 200 μL dialyze के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अधिक मात्रा के लिए, अधिक स्तंभ हैं।
    3. ट्यूब बदलने और बढ़कर मोटे राल पर युग्मन समाधान ड्रॉप। अपकेंद्रित्र फिर 2 मिनट के लिए 500 XG पर। ट्यूब से eluent निकालें और टीकाकरण के लिए इस्तेमाल करते हैं।

2. पशु के टीकाकरण

  1. टीकाकरण के लिए दो या तीन 6 से 12 सप्ताह पुराने Balb / ग चूहों चुनें।
  2. पीबीएस के 200 μL में immunoconjugate के 200 माइक्रोग्राम और पूर्ण Freund's सहायक के 100 μL (सीएफए) के साथ मिश्रण - एक जानवर के लिए, 150 तैयार करते हैं। एक 1 एमएल सिरिंज पर समाधान मिश्रण (0.6 मिमी व्यास) एक छोटी और पतली सुई के साथ 3 बार। समाधान माउस में intraperitoneally इंजेक्षन।
  3. एक बूस्टर इंजेक्शन 6 हफ्ते बाद immunoconjugate का एक ही राशि के साथ दें, लेकिन सीएफए के बिना। रक्त 7 दिन बाद (retroorbital साइनस के बाहर) और prepa ले लोकमरे के तापमान पर 4 घंटे (आरटी) - 3 के लिए रक्त सीरम incubating द्वारा पुन।
    1. 5 मिनट के लिए 3,000 XG पर मिश्रण अपकेंद्रित्र। सीरम सतह पर तैरनेवाला ले लो और यह एक नया ट्यूब में हस्तांतरण। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। गोली त्यागें।
  4. एलिसा के माध्यम से सीरा का विश्लेषण करें, चरण 3. संलयन के लिए में वर्णित के रूप में, उच्चतम सीरम अनुमापांक के साथ माउस चुनें।
  5. केवल 4 दिन संलयन से पहले सहायक के बिना 200 पीबीएस के 300 μL में immunoconjugate की माइक्रोग्राम - सेल संलयन के लिए तैयार करने में, 150 के साथ माउस को बढ़ावा देने।

3. एलिसा

  1. पीबीएस में 5 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के साथ एक प्रतिजन समाधान तैयार है और एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह एलिसा में 50 μL हस्तांतरण।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर या रात एक नम कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
  3. नल के पानी के साथ थाली 3 बार धोएं। एक नम चर्चा में आरटी पर 1 घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रति पीबीएस / 5% नवजात बछड़ा सीरम के 80 μL (NCS) के साथ कुओं ब्लॉकएम्बर। 5 सीरीज 01:50 से शुरू: एक 1 में सीरम dilutions तैयार करें। सेल संस्कृति के विश्लेषण के लिए, undiluted संस्कृति सतह पर तैरनेवाला का उपयोग करें।
  4. नल के पानी के साथ थाली 3 बार धोएं। अच्छी तरह से प्रति नमूना के पिपेट 50 μL और एक नम कक्ष में आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। एक बकरी विरोधी माउस आईजीजी एंटीबॉडी हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित के 5,000 कमजोर पड़ने: एक 1 में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है।
  5. नल के पानी के साथ थाली 3 बार धोएं और अच्छी तरह से प्रति माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 50 μL जोड़ें। एक नम कक्ष में आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. एक ताजा सब्सट्रेट समाधान तैयार है। 0.1 एम नः 2 पीओ 4 और 0.1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के शेयर समाधान करें। 5 भागों नः 2 पीओ 4, 4 भागों हाइड्रोजन पेरोक्साइड, और ताजा सब्सट्रेट समाधान के लिए 1 भाग tetramethylbenzidine ले लो।
    1. नल के पानी के साथ थाली धो 10 बार। कुओं में ताजा सब्सट्रेट समाधान के पिपेट 50 μL और 5 के लिए सेते हैं - में 10 मिनटअंधेरा।
  7. 50 μL 1 महाराष्ट्र 2 इतनी अच्छी तरह से प्रति 4 के साथ प्रतिक्रिया बंद करो। एक प्लेट रीडर का उपयोग, 630 एनएम पर एक संदर्भ तरंग दैर्ध्य के साथ 450 एनएम ऑप्टिकल घनत्व को मापने।

4. Myeloma सेल संस्कृति की तैयारी

  1. अब से, बाँझ शर्तों के तहत सभी काम करते हैं।
  2. सेल की खेती के लिए एक ताजा संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (50 एमएल), 2 मिमी एल glutamine (5 एमएल), और 50 माइक्रोन के mercaptoethanol (5 एमएल) के साथ RPMI1640 के 500 एमएल अनुपूरक। glutamine स्थानापन्न हर 7 दिनों के लिए।
  3. गर्म पानी में murine SP2 / 0 कोशिकाओं की एक शीशी पिघलना। 200 x जी पर 10 मिनट के लिए नए सिरे से संस्कृति के माध्यम से और सेंट्रीफ्यूज के 10 एमएल में सेल समाधान स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा संस्कृति के माध्यम से 1 एमएल में गोली resuspend।
  4. एक 25 सेमी 2 फ्लास्क में कोशिकाओं स्थानांतरण और एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं और 5% सीओ 2। दो 75-मीटर कोशिकाओं का विस्तार 2 बोतल BEFअयस्क संलयन। लंबी अवधि के भंडारण के लिए aliquots संरक्षण, चरण 7 में वर्णित है।

5. फीडर कोशिकाओं की तैयारी

  1. एक 12 सप्ताह पुरानी NMRI माउस (राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार, जैसे, सीओ 2 साँस लेना द्वारा) बलिदान। फर निकालें और 70% इथेनॉल के साथ पेट साफ।
  2. पेट में बर्फ के ठंडे RPMI माध्यम के 5 मिलीलीटर इंजेक्षन एक चिमटी से नोचना के साथ पेट की मालिश, और फीडर सेल निलंबन aspirate। एक खाली 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं की जगह। यह कदम एक बार फिर से प्रदर्शन करते हैं। फीडर सेल निलंबन के 7 से 10 एमएल पुनः प्राप्त किया जाना चाहिए।
  3. पूर्ण सेल संस्कृति के माध्यम से 90 एमएल (RPMI 1640, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी glutamine, और 50 माइक्रोन के mercaptoethanol) जोड़कर एक 100 एमएल फीडर सेल निलंबन तैयार करें। यह मिश्रण और 10 x 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों में 100 μL / स्थानांतरण अच्छी तरह से। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% एक मशीन में सीओ 2 में प्लेटें सेते हैं।

6. सेल फ्यूजन

  1. ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 साँस लेना द्वारा प्रतिरक्षित माउस बलिदान और तिल्ली 14 आबकारी। 2.3 कदम के रूप में वर्णित एलिसा में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, दिल से अतिरिक्त रक्त ले लो और सीरम तैयार करते हैं,।
  2. एक सेल झरनी के माध्यम से तिल्ली दबाकर एक तिल्ली सेल निलंबन तैयार करें। पूर्ण सेल संस्कृति के माध्यम से 20 एमएल के लिए भरें। centrifugation द्वारा 50 एमएल ट्यूबों में कोशिकाओं फसल (200 XG, 10 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस)। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. सेल संस्कृति फ्लास्क कुल्ला और centrifugation द्वारा मायलोमा कोशिकाओं फसल (200 XG, 10 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस) और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  4. फिर और सेंट्रीफ्यूज; संतुलित नमक बफर के 20 एमएल (बीएसएस) में सेल छर्रों Resuspend (7.4 पीएच 125 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 4 मिमी 2 CaCl, 2.5 मिमी 2 MgCl, और 5 मिमी Tris एचसीएल)। दोहराएँ धोने तीन बार दोहराएँ।
  5. splenocyte एडजस्ट करने के लिए: मायलोमा सेल अनुपात, FIR से दूसरे चरण धोने के बाद कोशिकाओं की गिनतीसेंट बीएसएस बफर के 1 एमएल में गोली resuspending। 1:10 कमजोर पड़ने और एक सेल गिनती चैम्बर के लिए 10 μL हस्तांतरण। कोशिकाओं की गणना और 1 एमएल में सेल एकाग्रता का निर्धारण।
  6. एक 1 एमएल अंतिम मात्रा में तीन भागों splenocytes और एक हिस्सा मायलोमा कोशिकाओं को बीएसएस बफर में सेल नंबर समायोजित करें। सेल निलंबन के 200 μL ले लो और PEG8000 के 200 μL (बीएसएस बफर के 4 एमएल में 1 ग्राम) के साथ मिश्रण। 2 मिमी की एक व्यास के साथ एक electroporation क्युवेट में 400 μL स्थानांतरण और नाड़ी सेट (600 - 650 वी और 25 एमएस)।
    1. नाड़ी के बाद, क्युवेट में 3 मिनट के लिए आरटी पर कोशिकाओं सेते हैं। कोशिकाओं को हटाने और उन्हें टोपी माध्यम के 100 एमएल (RPMI 1640, 10% एफसीएस, 2 मिमी glutamine, 50 माइक्रोन के mercaptoethanol, 100 माइक्रोन के hypoxanthine, 5.8 माइक्रोन के azaserine, और 16 माइक्रोन thymidine) के साथ एक Erlenmeyer फ्लास्क में dropwise डाल दिया।
    2. फ्यूजन दोहराएँ 4 गुना तक 1-एमएल बैच खर्च किया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर 3 घंटे के लिए Erlenmeyer फ्लास्क सेतेएक मशीन में।
  7. सेल निलंबन फिर अनुपूरक hypoxanthine, azaserine, और thymidine साथ फीडर परत पर चढ़ाना कोशिकाओं से पहले। फीडर परत प्लेटों के लिए अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 100 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 (एक मशीन में) प्लेटें सेते हैं। अच्छी तरह से भीतर अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन के hypoxanthine, 5.8 माइक्रोन के azaserine, और 16 माइक्रोन thymidine होना चाहिए।
  8. निर्धारित करती है कि कुओं मोनो या पॉलीक्लोनल हैं क्रम में 7 दिनों के बाद थाली के प्रत्येक कुएं में प्रतिरूप के विकास के लिए: एक सूक्ष्म विश्लेषण (10X उद्देश्य लेंस, 10X आंख टुकड़ा बढ़ाई) प्रदर्शन करना। मोनोक्लोनल कोशिकाओं कोशिकाओं है कि एक एकल कोशिका से उत्पन्न में से एक क्लस्टर कर रहे हैं। पॉलीक्लोनल कोशिकाओं एक कुएं में कोशिकाओं के कई समूहों रहे हैं। 7 दिनों के बाद पूरा मीडिया बदलें और टोपी माध्यम में 7 दिनों के लिए फिर से सेते हैं।
  9. टोपी मध्यम बदलें और पूर्ण सेल संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं खेती। एक ई प्रदर्शन करने के लिए सतह पर तैरनेवाला का प्रयोग करेंलीज़ा, चरण में वर्णित के रूप में 3. सकारात्मक हाइब्रिडोमा कोशिकाओं विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए परीक्षण के अनुसार 24 अच्छी तरह प्लेटें में विस्तार किया जाना चाहिए। कोशिकाओं पॉलीक्लोनल कर रहे हैं, एक सीमित कमजोर पड़ने प्रदर्शन किया जाएगा (चरण 8 में वर्णित) है।

7. हाईब्रीडोमास की Cryoconservation

  1. सकारात्मक मोनो और लंबी अवधि के भंडारण के लिए पॉलीक्लोनल हाइब्रिडोमास Cryoconserve। centrifugation द्वारा> 60% की एक संगम के साथ एक 24 अच्छी तरह से थाली से कोशिकाओं फसल (200 XG, 10 मिनट, और 4 डिग्री सेल्सियस)।
  2. पूर्ण सेल संस्कृति मीडिया के 500 μL में गोली Resuspend और यह एक cryotube में स्थानांतरित। फ्रीज माध्यम के 500 μL (RPMI 1640, 20% एफसीएस, और 15% dimethylsulfoxide) जोड़ें यह मिश्रण है, और एक स्टायरोफोम बॉक्स या एक विशेष ठंड बॉक्स में इसे में डाल दिया। 3 दिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। 3 दिनों के बाद, cryotube लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है।

8. पॉलीक्लोनल हाईब्रीडोमास के कमजोर पड़ने सीमित

  1. Makईए फीडर परत संस्कृति, चरण 7.1 में वर्णित के रूप में चरण 5. फसल सकारात्मक पॉलीक्लोनल कोशिकाओं, वर्णित है। चरण 6.5 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं की गणना, और एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए 10 एमएल के अंतिम मात्रा के साथ, 10 कोशिकाओं / एमएल सेल नंबर समायोजित करें। 100 μL / अच्छी तरह पर फीडर परत जोड़ें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए सेते हैं और microscopically (बढ़ाई: 10x उद्देश्य लेंस, 10X आंख टुकड़ा) प्रतिरूप विकास का विश्लेषण। चरण 3 में वर्णित के रूप में संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के एक एलिसा बनाओ, और जन संस्कृति के लिए उपयुक्त मोनोक्लोनल हाइब्रिडोमास की पहचान।

9. मास संस्कृति और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की शुद्धि

  1. 25 सेमी 2 या 75 सेमी 2 बोतल के लिए उपयुक्त एलिसा संकेतों के साथ मोनोक्लोनल हाइब्रिडोमास स्थानांतरण और संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के 500 एमएल के लिए जमा। विशिष्ट एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए संस्कृति साप्ताहिक टेस्ट और 3 के संरक्षण - चरण 7 में वर्णित के रूप में, लंबी अवधि के भंडारण के लिए हाइब्रिडोमा प्रति 5 aliquots।
  2. एक प्रोटीन धोने बफर के साथ इसे धोने से एक स्तंभ तैयार (: 3 DH 2 हे में बाध्यकारी बफर पतला 1)। स्तंभ पर कदम 9.2 से सतह पर तैरनेवाला पास और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा। 0.1 एम साइट्रेट, पीएच 3.5 के साथ बाध्य एंटीबॉडी Elute और Tris एचसीएल के 500 μL, पीएच 9.0 के साथ तुरंत पीएच बेअसर।
  3. एसडीएस पृष्ठ, वेस्टर्न ब्लाट, और एलिसा द्वारा eluted एंटीबॉडी विशेषताएँ, और अंतिम आवेदन के लिए यह मान्य।
    1. , 5 लेन (20 μL नमूना) के अनुसार शुद्ध एंटीबॉडी समाधान के माइक्रोग्राम 5 4x एसडीएस नमूना लोड हो रहा है बफर (8% एसडीएस, 20% 2-मर्केप्टोइथेनाल, 40% ग्लिसरीन, और 0.015 के μL जोड़ - एसडीएस पृष्ठ के लिए, 3 ले % bromophenol, कम), और 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर जांच की गर्मी। एक नियंत्रण के रूप में, एक शुद्ध एक साथ एक ही नमूने का उपयोगएक ही निर्धारण लेकिन अप्रासंगिक विशिष्टता के ntibody।
    2. 12.5% ​​एसडीएस जेल पर नमूने लोड, एक अतिरिक्त लेन में एक बेदाग प्रोटीन सीढ़ी के 5 μL जगह है, और वैद्युतकणसंचलन से अलग करें। Coomassie खूब ब्लू के साथ जेल दाग और परिणाम दस्तावेज़। एक बुनियादी एसडीएस प्रोटोकॉल 1970 15 में Laemmli द्वारा स्थापित किया गया था।

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Representative Results

चित्रा 1 एक प्रतिरक्षण प्रयोगशाला में प्रदर्शन के लिए विशिष्ट प्रतिजन सीरम अनुमापांक का एक उदाहरण दिखाता है। एक भोले माउस की एक सीरम की तुलना में 5,000,000: इस चित्र में, प्रतिरक्षा सीरा ए और बी 1:50 करने के लिए 1 से titrated किया गया। प्रतिजन ठोस चरण पर लेपित किया गया था, और विशिष्ट एंटीबॉडी एक फली-संयुग्मित बकरी विरोधी माउस पुलिस महानिरीक्षक एंटीबॉडी के साथ पाया गया। प्रतिरक्षित चूहों के दोनों सीरा भोले माउस की तुलना में काफी अधिक विशिष्ट प्रतिजन अनुमापांक दिखाया। 1 के एक कमजोर पड़ने पर संकेत: 5,000 अगले कदम, सेल संलयन के लिए पर स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त है।

हाइब्रिडोमास के विकास के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है, सेल क्लोन के विकास के द्वारा टोपी चयन के 7 से 10 दिनों के बाद दिखाई दे रहा था। चित्र को 10 दिनों फ्यूजन के बाद एक 96 अच्छी तरह से थाली से लिया गया है। सेल क्लोन और aminopterinemono- या कुओं की polyclonalityव्यक्तिगत सूक्ष्म विश्लेषण (: 10x उद्देश्य लेंस, 10X आंख टुकड़ा बढ़ाई) द्वारा निगरानी की गई। मोनोक्लोनल कुओं थाली के शीर्ष पर एक बिंदु के साथ लेबल रहे थे। जब प्लेटों एलिसा में परीक्षण किया गया, मोनोक्लोनल हाइब्रिडोमास से विशिष्ट प्रतिजन संकेतों को आसानी से पहचाना जा सकता है। सकारात्मक हाइब्रिडोमा संस्कृतियों, recloned विस्तार किया है, और जब तक cryoconserved संस्कृति मोनोक्लोनल, स्थिर, और विशिष्ट प्रतिजन था। संस्कृति सतह पर तैरनेवाला आदेश प्रोटीन एक मध्यस्थता आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से उत्पादित मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को शुद्ध करने में खेती के समय के दौरान एकत्र की गई थी। चित्रा 3 एक IgG1 निर्धारण के साथ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का एक मानक क्षालन प्रोफ़ाइल से पता चलता है।

शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आगे के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, एक एसडीएस पृष्ठ की विशेषता थे। 50 और 25 केडीए में, भारी और हल्के चेन स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, एक एंटीबॉडी अणु की शुद्धि के संकेत मिलते हैं। लेन 2 Sएक ही निर्धारण के साथ एक नियंत्रण एंटीबॉडी howed।

आकृति 1
चित्रा 1: टीकाकरण के बाद सीरम अनुमापन। दो चूहों से सीरा 01:50 1 तक से dilutions में titrated गया: 5,000,000 और एक एलिसा द्वारा प्रतिजन विशिष्टता के लिए परीक्षण किया। एक गैर-प्रतिरक्षित माउस का नियंत्रण सीरम के रूप में 1:50 कमजोर पड़ने में इस्तेमाल किया गया था। विशिष्ट प्रतिजन संकेतों दोनों प्रतिरक्षित चूहों और माउस एक की splenocytes के लिए सकारात्मक हाइब्रिडोमा पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: मोनो और पॉलीक्लोनल हाईब्रीडोमास की तस्वीरें। मोनो और पॉलीक्लोनल hybridomas microscopically 10 दिनों सेल संलयन के बाद विश्लेषण किया गया। चित्रों मोनोक्लोनल (ए) और पॉलीक्लोनल (बी) के गुणों के साथ स्थिर हाइब्रिडोमा सेल लाइनों के लिए पारंपरिक परिणाम दिखा। एक पैमाने पर पट्टी: 10 माइक्रोन; बी पैमाने पर पट्टी: 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: एक IgG1 निर्धारण के साथ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए मानक क्षालन प्रोफ़ाइल। उत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रोटीन एक मध्यस्थता आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्ध किया गया था, और एक IgG1 एंटीबॉडी की क्षालन प्रोफ़ाइल चित्र में दिखाया गया है। पहली शिखर 5.0 पीएच पर eluted मोनोक्लोनल एंटीबॉडी अणु इंगित करता है। निम्नलिखित चोटियों पीएच 3.5 और पीएच 2.0 से संकेत मिलता है। पीएच कमी आवश्यक हैपूरी तरह से सभी पदार्थों के स्तंभ साफ करने के लिए और अगले शुद्धिकरण के लिए स्तंभ मैट्रिक्स को पुनर्जीवित करने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एक IgG1 निर्धारण के साथ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए मानक एसडीएस पृष्ठ। एंटीबॉडी eluent की शुद्धता एक Coomassie से सना हुआ एसडीएस पृष्ठ द्वारा निर्धारित किया गया था। एंटीबॉडी समाधान के 5 माइक्रोग्राम एल 2 के लिए आवेदन किया और कम की शर्तों के तहत L3 में एक मानक IgG1 एंटीबॉडी के 5 माइक्रोग्राम की तुलना में थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से अंतिम आवेदन के संबंध में, एक गहन और विस्तृत मिलान विश्लेषण की आवश्यकता है, जब एंटीबॉडी लक्ष्य की पहचान करनी चाहिए। यह अक्सर उपयोगकर्ताओं द्वारा कम करके आंका और कमजोर प्रदर्शन के साथ एंटीबॉडी की ओर जाता है। संलयन की प्रक्रिया हमेशा यादृच्छिक जिसका अर्थ है कि विशिष्ट हाइब्रिडोमास के परिणाम इस बिंदु पर सेल अनुपात और जीवन शक्ति पर बहुत निर्भर है। सीमित कमजोर पड़ने के बाद, कोशिकाओं को बहुत अस्थिर कर रहे हैं और सेल के विकास और एंटीबॉडी के उत्पादन के कड़े निगरानी की आवश्यकता है। उन मानकों को ध्यान से विश्लेषण किया जाना चाहिए जब विधि समस्या निवारण।

तकनीक के आगे सीमाओं समय सेल लाइन पीढ़ी के लिए आवश्यक और वांछित एंटीबॉडी का निर्माण सेल के चयन में शामिल हैं। फ्यूजन के बाद गुणसूत्रों के सेट टेट्राप्लोइड के कारण, कोशिकाओं को बहुत अस्थिर कर रहे हैं और बाद में फिर से अगुणित करने के लिए सेट को कम। यह कर सकता हैएंटीबॉडी से संबंधित जीन की हानि हो, जिससे कोशिकाओं को अब और एंटीबॉडी पैदा करने के लिए नहीं। एक और सीमा वांछित एंटीबॉडी उत्पादक कोशिकाओं का चयन संस्कृति सतह पर तैरनेवाला पर और शुद्ध एंटीबॉडी समाधान पर नहीं आधारित है। इसलिए, एंटीबॉडी के अंतिम लक्षण वर्णन है, ज्यादातर मामलों में, संभव ही चयन किया हाइब्रिडोमा क्लोन के जन संस्कृति के बाद। इस प्रकार, जोखिम है कि एंटीबॉडी अंतिम आवेदन में काम करने में सक्षम नहीं है बहुत अधिक है।

ऐसी लेजर-सक्षम विश्लेषण और प्रसंस्करण प्रौद्योगिकी (छलांग) 16, संबंध कब्जा सतह प्रदर्शन (ACSD) 17, या जेल microdrop प्रौद्योगिकी 18, के रूप में कई तकनीकी संशोधनों, आदेश उपयुक्त एंटीबॉडी के चयन के दौरान कमियां नाकाम करने के लिए में वर्णित किया गया। इन सभी तरीकों हाइब्रिडोमा पीढ़ी और चयन के विभिन्न पहलुओं में सुधार करने में सक्षम हैं, लेकिन उनमें से ज्यादातर महंगे उपकरण या हर एकल कोशिका ली के लिए अनुकूलन की आवश्यकताne 16।

एक और सुधार या संशोधन है कि हमारी प्रयोगशाला में विकसित किया गया था कैमेरिक वायरल कणों की तरह (VLPs), Messerschmidt एट अल 19 में वर्णित के रूप में के साथ एक उपन्यास टीकाकरण की रणनीति है। कणों वायरल कोट संरचना में एम्बेडेड और उन कणों की सतह पर प्रस्तुत वांछित मिलान दृश्यों के द्वारा संशोधित किया जा सकता है। यह बहुत तेजी से और विशिष्ट इसी पशुओं में टीकाकरण के बाद 4 सप्ताह के लिए होता है। उत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी IgG2 या IgG1 isotypes है और मिलान चयन मूल निवासी प्रतिजन के लिए अति विशिष्ट पर निर्भर हैं। हम यह भी कृत्रिम कोशिका की सतह मार्कर का उपयोग करके हाइब्रिडोमा कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट चयन कदम विकसित की है। इस्तेमाल किया ट्रांसजेनिक मायलोमा कोशिकाओं को एक स्थिरतापूर्वक डाला सतह मार्कर प्रदर्शित करते हैं। इस सतह मार्कर antigen- करने के लिए, कमजोर पड़ने सीमित किए बिना और अत्यधिक एलिसा स्क्रीनिंग के बिना, या इस्तेमाल किया जा सकता निर्धारण विशेष रूप से सीधे संलयन के बाद हाइब्रिडोमा कोशिकाओं से हलके रूप में वास्तव में पारंपरिक हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी 20 में आवश्यक है।

जैसा कि ऊपर कहा, वहाँ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी पीढ़ी में कुछ आशाजनक विकल्प उपलब्ध है कि, भविष्य में, हैंडलिंग में सुधार और मौजूदा हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी की खामियों को कम कर सकता हैं। फिर भी, प्रक्रिया हमेशा के लिए एक कठोर और सावधानी से योजना बनाई आवेदन के साथ संयोजन में वांछित मिलान की विस्तृत पहचान की आवश्यकता होगी ताकि उत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सफलतापूर्वक काम करता है। हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी विज्ञान, निदान, और चिकित्सा में भारी मांग की वजह से भविष्य में एक महत्वपूर्ण और आवश्यक कदम होगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) Sigma Aldrich 39391-10ML
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
ovalbumin Sigma Aldrich A5503
bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
Falcon tubes 15 mL Biochrom GmbH P91015
reaction vials, 1.5 mL Carl Roth GmbH & C0.KG CNT2.1
hollow needle Carl Roth GmbH & C0.KG C724.1
glass wool Carl Roth GmbH & C0.KG 6574.1
Sephadex G25 coarse Sigma Aldrich GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich F5881-10ML
ELISA plates, 96 well Greiner bio-one 655101
neonatal calf serum Biochrom GmbH S1025
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Pipette tips 200 µL Greiner bio-one 739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody Dianova 115-035-003
tetramethylbenzidine Carl Roth GmbH & C0.KG 6350.2
Natriumdihydrogenphosphat Carl Roth GmbH & C0.KG K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid Carl Roth GmbH & C0.KG 4623.3
RPMI 1640 Life technologies GmbH 31870074
L-glutamine Carl Roth GmbH & C0.KG HN08.2
beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250
fetal calf serum Invitrogen 10270106
TC-flask 25 cm2 Peske GmbH 86-V025
TC-flask 75 cm2 Peske GmbH 86-V075
ethanol, 96% Carl Roth GmbH & C0.KG P075.1
cell strainer VWR international 734-0002
Falcon tubes 50 mL Biochrom GmbH P91050
PEG 8000 Sigma Aldrich 1546605
electroporation cuvette, 2 mm Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. EKL2,25
hypoxanthine Sigma Aldrich H9636-25G
azaserine Sigma Aldrich A4142
thymidine USB Europa GmbH 22305 1 GM
TC-plates 96 well Biochrom GmbH P92696
TC-plates 24 well Biochrom GmbH P92424
cryotubes, 1 mL Sigma Aldrich V7384-1CS
dimethylsulfoxide Carl Roth GmbH & C0.KG 4720.1
protein A sepharose Sigma Aldrich P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 Carl Roth GmbH & C0.KG K929.1
unstained protein ladder BioRad Laboratories 161-0363
comassie brilliant blue R-250 BioRad Laboratories 161-0406

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 119 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी मायलोमा कोशिकाओं बी लिम्फोसाइट प्रतिजन immunconjugate
हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा Murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी
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Holzlöhner, P., Hanack, K.… More

Holzlöhner, P., Hanack, K. Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology. J. Vis. Exp. (119), e54832, doi:10.3791/54832 (2017).

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