Introduction
הטכנולוגיה hybridoma שהוצגו בפרוטוקול זה תוארה לראשונה על ידי קוהלר ומילשטיין 1 בשנת 1975, למעט כמה שיפורים טכניים, ההליך העיקרי לא השתנה באופן דרמטי במהלך 40 השנים האחרונות 2. מטרת פרוטוקול זה היא להסביר אסטרטגית חיסון מתאימה יותר, שיטה סטנדרטית ההדורה של נוגדנים חד שבטיים, ודוגמא שיטת אימות (ELISA).
נוגדנים הם כלים מדהימים לתרום למגוון רחב של גישות טכנולוגיות, כגון cytometry זרימה, מיון תא מגנטי, או immunofluorescence, כמו גם אפשרויות אבחון וטיפול לניטור מחלה וטיפול 3. הזמינות המסחרית של נוגדנים חד שבטיים עבור מטרות רצויות מודגמת על ידי הנוכחות של מעל 24 מסדי נתוני אינטרנט שונים עם כמויות אינספור כמעט של נוגדנים או מוצרים הקשורים נוגדן 4. בשנת 2015,מולקולות ntibody היו חלק בדיון בינלאומי 5-7 בשל בעיות חמורות אימות נאה ואפיון של נוגדנים זמינים מסחרי.
זה יכול להיות קשה ויקר למצוא נוגדנים ספציפיים לנוגדן ממוקד, ולעתים קרובות, אין להם הזיקה או הסגולי צורכת. למרות שהניב נוגדן עדיין זמן רב ודורש כוח אדם מיומן לפתח ולאמת את הנוגדן, ייצור נוגדן בנפרד אולי טוב יותר מאשר לקנות אחד.
בשל העובדה כי ייצור נוגדנים הוא גוזל זמן ודורש ניסיון, שיטות חלופיות לייצור מולקולות מחייב פותחו כדי להתגבר על בעיות אלה. בשיטה החלופית הנפוצה ביותר היא ייצור רקומביננטי של נוגדנים חד-שרשרת באמצעות תצוגה הפאג. הגנים לאזור המחייב משתנה המחולצים תאים ובשילוב עם חלבון הציפוי של הפאג. ה- sשרשרת ingle מתבטאת אז על פני השטח של בקטריופאג ו הוקרנה בכמה פנורמי צעדים 8. הפקת נוגדנים חד שרשרת היא קצת יותר מהר, אבל זה גם דורש בניסויים מיומנים. החסרונות של כמה נוגדנים חד שרשרת רקומביננטי הם יציבות עניות וחוסר התאמת לאבחון במבחנה. ברוב הבדיקות דיאגנוסטי בנוסף קולטן Fc לגילוי יש צורך, אשר צריך להתווסף נוגדן חד שרשרת רקומביננטי לאחר מכן. שוב, זה זמן רבים עוד יותר מורכב מאשר טכניקת hybridoma. אבחון במבחנה, עכבר חד שבטי באורך מלא ונוגדני ארנב הוכחו להיות הבחירה הטובה ביותר.
אחד הצעדים המרכזיים ביצירת נוגדנים חד שבטיים חייב להיעשות לפני העבודה במעבדה מתחילה: העיצוב של immunoconjugate. שאלות שצריכות לטפל הן: מהו הרכב הפיזי של היעד הסופי מוצר היישוםיון, ואשר מטריצות נוכחות? איזה ריכוז יהיה היעד ביישום? מהו היישום הסופי, ומה הן הדרישות כי הנוגדן חייב למלא?
תמיד לקחת בחשבון שאם שבר פפטיד ליניארית משמש, זה גם צריך להיות ליניארי של epitope הסופי ביעד של בחירה; אחרת, הנוגדן לא יחייב. כמובן, ללא תלות בשיטת ההקרנה, נוגדנים יכולים להיבחר להכיר פורמטים אנטיגני שונים ביישומים שונים, אך זה חייב להיות מאומת בדיוק רב. אלו הן הסיבות מדוע פיתוח ותיקוף נוגדנים הם תהליכים כאלה שאפתנים.
הבחירה של פורמט אנטיגני לחיסון הוא בסיסי לפיתוח נוגדנים וקובע את ההצלחה או הכישלון של תהליך זה. לאחר העכברים להביע כיילו נוגדנים רלוונטיים, תאי הטחול מבודדים התמזגו עם תאי מיאלומה. שורות התאים מיאלומה הנפוצות ביותר עבורפיתוח נוגדנים חד שבטיים murine הם X63-Ag 8.653 9 ו- SP2 / 0-Ag 14 10 מתוך זן עכבר Balb / c. תאי צאצאים של לימפומה של תאי B ממאירים נבחרו כי הם לא מפרישים כל חלק מהרשתות קלות או כבד משלהם. התאים יכולים להיות מותאמים יחס בין 1:10 ו 10: 1 (splenocytes לעומת תאי מיאלומה). בפרוטוקול זה, התאים הותאמו יחס של 3: 1 ו התמזגו ידי פוליאתילן גליקול (PEG) ו electrofusion, על פי Stoicheva ו הואי 11.
השילוב של תאי B ותאי מיאלומה הוא תהליך אקראי. לכן, בני כלאיים של שני B לימפוציטים או שני תאי מיאלומה יכולים להיוצר, אבל אלה הכלאיים לא יוכל לשרוד במשך זמן רב בתרבות. התאים עוברים hypoxanthine, aminopterin, ו thymidine (HAT) בחירה, שבאמצעותו התמזגו רק תאי hybridoma יכולים לשרוד בשל האפשרות של שימוש במסלול דה נובו של סינתזת פירימידין. עבור הדור של monנוגדני oclonal, יש צורך להשיג קו תא שמקורם בתא אמא אחת. Monoclonality מובטחת על ידי הגבלת טכניקות דילול ואת הניתוח המיקרוסקופי של גדילת תא. את supernatants תרבות hybridoma מוקרנים על ייצור נוגדנים ספציפיים, בעיקר על ידי ELISA או cytometry זרימה, ואת קלסרים הטובים ביותר נבחרו. אחרי תרבות המונים וטיהור, מולקולת הנוגדן יכול סוף סוף להיות מאופיינת ומאומתת עבור היישום הרצוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / c או עכברים NMRI (musculus Mus) מהמושבה הרבייה שלנו באוניברסיטת פוטסדאם (Potsdam, גרמניה) שימשו לייצור נוגדנים חד שבטיים. עבודת החיה נערכת על פי הנחיות לאומיות ובינלאומיות הנוגעות לעניין. המחקר אושר על ידי ברנדנבורג המשרד לאיכות הסביבה, בריאות, הגנת הצרכן (מספר אסמכתא V3-2347-A16-4-2012).
1. הכנת Immunoconjugates
- עבור צימוד האנטיגן על מפעיל, להשתמש בפרוטוקולים צימוד רגיל באמצעות amino-, carboxy, או sulfo-קבוצות, כגון על ידי glutaraldehyde, N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC), או N - [y-maleimidobutyryloxy ] אסתר succinimide (sulfo-GMBS).
- עבור צימוד (למשל, עם glutaraldehyde) 13, השתמש חלבון המטרה או הפפטיד לבין הספק (ovalbumin, אלבומין בסרום שור, או hemocyanin עלוקה חור המנעול) ביחס של 1: 1. לדלל את יחסי ציבור היעדotein או פפטיד בופר פוספט (PBS) ואת החלבון המוביל 50 מ"מ NaHCO 3 חיץ. להתאים את עוצמת הקול ואת הריכוז את הסכום הדרוש עבור חיסונים.
- מערבבים שני פתרונות ולהוסיף 1.25% glutaraldehyde. מערבבים דגירה המדגם עבור 4 שעות בטמפרטורת החדר (RT). לבחירת תאי hybridoma, להפיק את אותה immunoconjugate, אבל עם חברת תעופה אחרת, על מנת למנוע את הבחירה של קלסרים מובילים נוקבים.
- Dialyze המדגם צימוד על ידי ביצוע דיאליזה מהר עם שרף גס מסחרי (למשל, Sephadex G25).
- לחורר בתחתית בקבוקון 1.5 תגובה מ"ל עם מחט חלולה ומניחים אותו בתוך שפופרת 15 מ"ל. שים צמר זכוכית בתחתית לאיטום ולכסות אותו עם 300 מ"ג של שרף גס (על גובה הכיול של 0.5 מיליליטר).
- בזהירות, לשים 1 מ"ל PBS dropwise לתוך צינור 1.5 תגובה מ"ל ולוודא כי צמר זכוכית עדיין איטום הניקוב. תן s השרף הגסהגם צנטריפוגות הטור ב XG 500 במשך 2 דקות. ניתן להשתמש עמודה אחת כזו dialyze 200 μL של מדגם הצימוד. עבור אמצעי אחסון גבוה יותר, להרוויח יותר עמודות.
- שנה את הצינור ושחררת פתרון הצימוד על השרף הגס תפח. צנטריפוגה שוב XG ב 500 במשך 2 דקות. הסר את eluent מהצינור ולהשתמש בו עבור חיסון.
חיסון 2. של בעלי חיים
- בחר שניים או שלושה 6 ל- 12 שבועות בן עכברים Balb / c לחיסון.
- עבור חיה אחת, להכין 150 - 200 מיקרוגרם של immunoconjugate ב 200 μL של PBS ומערבב אותו עם 100 μL של אדג'ובנט Freund's המלא (CFA). מערבבים את הפתרון 3 פעמים עם מחט נמוכה ורזה (0.6 מ"מ קוטר) על מזרק 1 מ"ל. להזריק את הפתרון intraperitoneally לתוך העכבר.
- תן הזרקה מאיצה 6 שבועות לאחר מכן עם אותה הכמות של immunoconjugate, אבל בלי CFA. קח דם 7 ימים לאחר מכן (מתוך הסינוס retroorbital) ו prepaמחדש את הנסיוב על ידי דוגרי הדם במשך 3 - 4 שעות בטמפרטורת חדר (RT).
- צנטריפוגה את התערובת על 3,000 XG במשך 5 דקות. קח את supernatant בסרום ולהעביר אותו לתוך צינור חדש. ולאחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס. וזורק את הכדור.
- נתח את סרה באמצעות ELISA, כמתואר שלב 3. היתוך, לבחור את העכבר עם כייל בסרום הגבוה ביותר.
- לקראת איחוי תאים, להגביר את העכבר עם 150 - 200 מיקרוגרם של immunoconjugate ב 300 μL של PBS ללא אדג'ובנט רק 4 ימים לפני ההיתוך.
3. ELISA
- הכן פתרון אנטיגן עם ריכוז של 5 מיקרוגרם / מ"ל PBS ולהעביר 50 μL לתוך כל ELISA גם צלחת 96-היטב.
- דגירה את הצלחת למשך 2 שעות ב 37 ° C או לילה ב 4 מעלות צלזיוס בתא לח.
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז. חסום את הבארות עם 80 μL של PBS / 5% נסיוב עגל בילוד (NCS) לכל טוב עבור 1 ש 'ב RT בתוך פרק לחעַנבָּר. כן הדילולים בסרום של 1: סדרת 5 החל 1:50. לניתוח של תרבית תאים, השתמש supernatant התרבות חי.
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז. פיפטה 50 μL של המדגם לכל היטב דגירה של 1 ש 'ב RT בתא לח. הכן את הפתרון נוגדנים משני ביחס של 1: דילול -5,000 נוגדן עיזים אנטי עכבר IgG מצומדות כדי peroxidase חזרת (HRP).
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם מי ברז ולהוסיף 50 μL של פתרון נוגדנים משני לכל טוב. דגירה במשך 45 דקות ב RT בתא לח.
- כן פתרון מצע טרי. הפוך פתרונות מניות של 0.1 M לאא 2 PO 4 ו -0.1 מי חמצן%. קח 5 חלקים לאא 2 PO מי חמצן 4, 4 חלקים, חלק 1 tetramethylbenzidine לפתרון המצע הטרי.
- לשטוף את הצלחת 10 פעמים עם מי ברז. פיפטה 50 μL של פתרון מצע טרי לתוך בארות דגירה במשך 5 - 10 דק 'באפל.
- עצור את התגובה עם 50 μL 1 MH 2 SO 4 לכל טוב. באמצעות קורא צלחת, למדוד את הצפיפות האופטית ב 450 ננומטר עם אורך גל התייחסות ב 630 ננומטר.
4. הכנת תא תרבויות מיאלומה
- מעתה ואילך, לבצע כל עבודה בתנאים סטריליים.
- כן בינוני תרבות טרי לגידול תאים. מוסף 500 מ"ל של RPMI1640 עם 10% נסיוב עגל עוברית (50 מ"ל), 2 מ"מ L- גלוטמין (5 מ"ל), ו -50 מיקרומטר mercaptoethanol (5 מ"ל). החליפו את גלוטמין כל 7 ימים.
- להפשיר בקבוקון של murine SP2 / 0 תאים במים חמים. מעבירים את הפתרון הנייד לתוך 10 מ"ל של מדיום צנטריפוגות תרבות טרי במשך 10 דקות ב 200 x ז. בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 1 מ"ל של מדיום תרבות טריים.
- העברת התאים בבקבוק 25 ס"מ 2 דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור. הרחב את התאים לשני 75-מ 2 צלוחיות BEFהיתוך עפרות. חסוך aliquots עבור אחסון לטווח ארוך, כמתואר שלב 7.
5. הכנת תאים מזינים
- קורבן עכבר NMRI 12 שבועות בן (על פי הנחיות לאומיות ומוסדיות; למשל, על ידי שאיפת CO 2). הסר את הפרווה ולנקות את הבטן עם 70% אתנול.
- להזריק 5 מ"ל של מדיום RPMI קר קרח לתוך הבטן, לעסות את הבטן עם פינצטה, לשאוב את ההשעיה תא מזין. מניחים את התאים בצינור 50 מ"ל ריק. בצע פעולה זו שוב. 7 עד 10 מ"ל של ההשעיה תא מזין צריך להישלף.
- כן השעית תא מזין 100 מיליליטר על ידי הוספת 90 מיליליטר של מדיום תרבית תאים מלאים (RPMI 1640, 10% נסיוב עגל עוברי, גלוטמין מ"מ 2, ו -50 מיקרומטר mercaptoethanol). מערבבים אותה ולהעביר 100 μL / גם לתוך 10 x צלחות תרבית תאים 96-היטב. דגירה צלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור.
6. איחוי תאים
- להקריב את העכבר שחוסנו על ידי נקע בצוואר הרחם או שאיפת CO 2, ולהסיר את הטחול 14. קח דם נוסף מהלב ולהכין את הנסיוב, כמתואר בשלב 2.3, כביקורת חיובית ELISA.
- כן השעית תא טחול על ידי לחיצה על הטחול דרך מסננת תא. מלאו עד 20 מ"ל עם תרבית תאים בינוניים מלא. קציר התאים ב 50 מ"ל צינורות ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק ', ו -4 מעלות צלזיוס). בטל supernatant.
- יש לשטוף את בקבוק תרבית תאים ו לקצור את תאי מיאלומה ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק ', ו -4 מעלות צלזיוס) וזורקי supernatant.
- Resuspend את כדורי תא 20 מ"ל של חיץ מלח מאוזנת (BSS) (125 mM NaCl, KCl 5 מ"מ, 4 מ"מ 2 CaCl, 2.5 מ"מ MgCl 2, ו -5 מ"מ טריס-HCl; pH 7.4) ו צנטריפוגות שוב. חזור על כביסת שלבי שלוש פעמים.
- להתאמת splenocyte: יחס תא מיאלומה, לספור את התאים לאחר שלב הכביסה השני על ידי אשוחרח resuspending גלולה ב 1 מ"ל של חיץ BSS. הפוך 1:10 דילול ולהעביר 10 μL אל חדר ספירת תאים. ספירת התאים לקבוע את הריכוז תא 1 מ"ל.
- התאם את המספרים תא למאגר BSS כדי splenocytes שלושה חלקים ותאי מיאלומה חד חלק בנפח סופי 1 מ"ל. קח 200 μL של ההשעיה תא ומערבבים אותו עם 200 μL של PEG8000 (1 גרם 4 מ"ל של חיץ BSS). מעבירים את 400 μL לתוך קובט electroporation בקוטר של 2 מ"מ ולהגדיר את הדופק (600 - 650 V ו -25 מילי-שניות).
- אחרי הדופק, דגירה התאים ב RT במשך 3 דקות קובט. הסרת תאים ולשים אותם dropwise לתוך בקבוק Erlenmeyer עם 100 מ"ל של HAT בינוני (RPMI 1640, 10% FCS, 2 מ"מ גלוטמין, 50 מיקרומטר mercaptoethanol, 100 מיקרומטר hypoxanthine, 5.8 מיקרומטר azaserine, ו -16 מיקרומטר thymidine).
- חזור על היתוך 4 פעמים עד אצווה 1 מ"ל הוא בילה. דגירה את הבקבוק Erlenmeyer במשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2באינקובטור.
- להשלים את ההשעיה תא שוב עם hypoxanthine, azaserine, ו thymidine לפני ציפוי התאים על שכבת מזין. הוספת 100 μL של השעית התא לכל היטב את צלחות שכבת מזין דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (באינקובטור). הריכוז הסופי בתוך הבאר צריך להיות 100 מיקרומטר hypoxanthine, 5.8 מיקרומטר azaserine, ו -16 thymidine מיקרומטר.
- ביצוע ניתוח מיקרוסקופי (גדלה: עדשה אובייקטיבית 10X, 10X עין מקשה) לצמיחה משובטת היטב בכל הצלחת לאחר 7 ימים על מנת לקבוע אם הבארות הם מונו או polyclonal. תאים חד-שבטיים הם מקבץ אחד של תאים שמקורם תא בודד אחד. תאי Polyclonal הם אשכולות מרובים של תאים היטב אחד. שנה את התקשורת המלאה לאחר 7 ימי דגירה שוב למשך 7 ימים במדיום HAT.
- שינוי המדיום HAT ולטפח את התאים בינוני תרבית תאים מלאה. השתמש supernatant לבצע ELISA, כמתואר בשלב 3. תאי hybridoma חיוביים חייבים להיות מורחב ב 24 גם צלחות פי המבחנים לייצור נוגדנים ספציפיים. אם התאים הם polyclonal, דילול מוגבל צריכה להתבצע (כמתואר בשלב 8).
7. Cryoconservation של Hybridomas
- Cryoconserve מונה חיובי hybridomas polyclonal עבור אחסון לטווח ארוך. קציר תאים מצלחת 24 גם עם מפגש של> 60% על ידי צנטריפוגה (200 XG, 10 דק ', ו -4 מעלות צלזיוס).
- Resuspend גלולה ב 500 μL של תקשורת בתרבות מלאה תא ולהעביר אותו לתוך cryotube. הוספת 500 μL של מדיום הקפאה (RPMI 1640, 20% FCS, ו -15% dimethylsulfoxide), לערבב אותו, ולשים אותו בתוך קופסא קלקר או קופסא הקפאה מיוחדת. חנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לאחר 3 ימים, cryotube ניתן להעביר חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.
8. הגבלת דילול של Polyclonal Hybridomas
- Makתרבות שכבת מזין ea, כמתואר שלב 5. תאי polyclonal חיוביים קציר, כמתואר שלב 7.1. ספירת התאים, כמתואר שלב 6.5, ולהתאים את מספר הסלולרי עד 10 תאים / מ"ל, עם נפח סופי של 10 מ"ל עבור צלחת 96-היטב. הוספת 100 μL / גם על שכבת מזין.
- הדגירה של 7 ימים ב 37 מעלות צלזיוס ולנתח את הצמיחה המשובטת (גדלה: עדשה אובייקטיבית 10X, מקשת עין 10X) מיקרוסקופי. תן ELISA של supernatant התרבות, כמתואר שלב 3, ולזהות את hybridomas monoclonal המתאים תרבות המונים.
תרבות טיהור 9. המוניים של חד-שבטיים נוגדנים
- מעבירים את hybridomas חד שבטיים עם אותות ELISA המתאים ל -25 ס"מ 2 או 75 ס"מ 2 צלוחיות ולאסוף עד 500 מ"ל של supernatant התרבות. בדוק את שבועי תרבות לייצור נוגדנים ספציפיים לחסוך 3 - 5 aliquots לכל hybridoma עבור אחסון לטווח ארוך, כמתואר בשלב 7.
- הכינו חלבון טור על ידי שטיפה עם חיץ כביסה (לדלל למאגר מחייב 1: 3 ב DH 2 O). להעביר את supernatant משלב 9.2 על העמודה לאסוף את הזרימה דרך. Elute הנוגדן כבול עם 0.1 M ציטראט, pH 3.5 ולנטרל את ה- pH מיד עם 500 μL של טריס-HCl, 9.0 pH.
- לאפיין את הנוגדן eluted על ידי SDS-PAGE, כתם המערבי, ELISA, ולאמת אותה עבור היישום הסופי.
- עבור עמוד SDS, לקחת 3 - 5 מיקרוגרם של פתרון נוגדנים מטוהרים לכל ליין (מדגם 20-μL), להוסיף 5 μL של חיץ טעינת מדגם 4x SDS (% 8 SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 40% גליצרין, ו 0.015 bromophenol%, מופחת), ומחממים חלליות על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. כביקורת, השתמש מדגם זהה עם א א מטוהריםntibody מאותו אלוטיפ אך סגוליות רלוונטי.
- טען את הדגימות על ג'ל 12.5% SDS, מקום 5 μL של סולם חלבון בלא כתם בתוך נתיב נוסף, ולהפריד אותם על ידי אלקטרופורזה. הכתם ג'ל עם Coomassie מבריק כחול ולתעד את התוצאות. פרוטוקול בסיסי SDS הוקם על ידי Laemmli בשנת 1970 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג דוגמה של כייל בסרום אנטיגן ספציפי עבור חיסון אחד ביצע במעבדה. בנתון זה, א הסרה החיסונית ו- B היו טיטרציה מ 01:50 עד 1: 5,000,000 בהשוואת סרום של עכבר נאיבי. האנטיגן היה מצופה על השלב המוצק, ואת הנוגדנים הספציפיים התגלו עם נוגדן POD-מצומדות עז נגד העכבר איג. סר שני העכברים שחוסנו הראה כייל אנטיגן ספציפי גבוהה משמעותי לעומת העכבר הנאיבי. האות בדילול של 1: 5000 היא מספיק כדי לעבור לשלב הבא, איחוי התאים.
הצמיחה של hybridomas הייתה גלויה לאחר 7 עד 10 ימים של מבחר HAT ידי הפיתוח של שיבוטי תא, כפי שמוצג באיור 2. התמונה צולמה מתוך צלחת 96-היטב 10 ימים לאחר ההיתוך. משובטי התא ואת aminopterinemono- או polyclonality של הבארותנוטרו על ידי ניתוחים מיקרוסקופים פרט (גדלה: עדשה אובייקטיבית 10X, עין-חתיכת 10X). בארות חד שבטיים תויגו עם נקודה על גבי הצלחת. כאשר צלחות נבדקו ELISA, אותות-specific antigen מ hybridomas monoclonal ניתן היה לזהות בקלות. תרבויות hybridoma חיוביות היו recloned, מתרחבות cryoconserved עד התרבות הייתה חד שבטית, יציב, אנטיגן ספציפי. Supernatant התרבות נאסף בזמן הטיפוח כדי לטהר את נוגדן חד-שבטי המיוצר באמצעות חלבון כרומטוגרפיה זיקה A-בתיווך. איור 3 מציג פרופיל elution תקן של נוגדנים חד שבטיים עם אלוטיפ IgG1.
נוגדנים חד שבטיים מטוהרים התאפיינו נוספת על ידי עמוד SDS, כפי שמוצג באיור 4. בשעת 50 ו -25 kDa, הרשתות הכבדות וקלות נראו בבירור, המציינים את הטיהור של מולקולת נוגדן. ליין 2 showed נוגדן מלא עם אותו אלוטיפ.
איור 1: טיטרציה סרום לאחר חיסון. סרה משני העכברים היו טיטרציה ב דילולים מ 01:50 עד 1: 5,000,000 ונבדקו על סגוליות אנטיגן על ידי ELISA. כמו בסרום שליטה על העכבר הלא מחוסנים שימש דילול של 1:50. האותות-specific antigen היו חיוביות עבור שני עכברים שחוסנו ואת splenocytes של עכבר שימשו לייצור hybridoma. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: תצלומים של ובי-Polyclonal Hybridomas. ובי-הי"ד polyclonalbridomas נותח מיקרוסקופי 10 ימים לאחר איחוי תאים. התמונות מראות את התוצאה הקונבנציונלית עבור שורות תאי hybridoma יציבות עם חד שבטי (א) ו polyclonal (ב) נכסים. סרגל קנה-מידה: 10 מיקרומטר; B סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: פרופיל Elution תקן עבור נוגדן חד-שבטי עם IgG1 אלוטיפ. נוגדן מונוקלונאלי שנוצר היה מטוהרים באמצעות חלבון כרומטוגרפיה זיקה A-בתיווך, ופרופיל elution של נוגדן IgG1 מוצג באיור. השיא הראשון מציין את מולקולת נוגדן חד-שבטי eluted ב- pH 5.0. הפסגות הבאות מעידות pH 3.5 ו 2.0 pH. ירידת pH יש צורךלנקות את העמודה של כל החומרים להתחדש מטריצת טור purifications הבא לחלוטין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: עמוד SDS תקן עבור נוגדן חד-שבטי עם IgG1 אלוטיפ. הטוהר של eluent נוגדן נקבע על ידי Coomassie מוכתם SDS-PAGE. 5 מיקרוגרם של פתרון הנוגדן יושמו L2 ולעומת 5 מיקרוגרם של נוגדן IgG1 סטנדרטי L3 בתנאים מופחתים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הדור של נוגדנים חד שבטיים ידי טכנולוגיית hybridoma דורש ניתוח epitope אינטנסיבי ומפורט, במיוחד בכל הנוגע ליישום הסופי, כאשר הנוגדן אמור לזהות את היעד. זה לזלזל לעתים קרובות על ידי משתמשים ומוביל נוגדנים עם הופעות חלשות. תהליך ההיתוך הוא תמיד אקראי, כלומר שתוצאת hybridomas הספציפי תלויה מאוד על יחס התא ואת החיוניות בנקודה זו. לאחר דילול מוגבל, התאים הם מאוד לא יציבים ודורשים פיקוח קפדני של צמיחת תאי ייצור נוגדנים. יש לנתח פרמטרים אלו בזהירות בעת פתרון השיטה.
הגבלות נוספות של הטכניקה כוללות את הזמן דרוש לייצור תא קו ואת הבחירה של תא נוגדן-ייצור הרצוי. בשל סט tetraploid הכרומוזומים לאחר היתוך, התאים הם מאוד לא יציבים ואחר כך להפחית את הסט כדי הפלואידים שוב. הדבר עלול ליצורלהוביל לאובדן של גנים הקשורים נוגדנים, גרימת התאים לא לייצר נוגדנים יותר. מגבלה נוספת היא כי הבחירה של התאים הרצויים מייצרי הנוגדנים מבוססות על supernatant התרבות ולא על פתרונות נוגדנים המטוהרים. לכן, אפיון סופי של הנוגדן הוא, ברוב המקרים, אפשרי רק לאחר תרבות המונים של שיבוט hybridoma שנבחר. לפיכך, את הסיכון כי הנוגדן אינו מסוגל לעבוד ביישום הסופי הוא גבוה מאוד.
כמה שינויים טכנולוגיים, כגון ניתוח ליזר מאופשר וטכנולוגיית עיבוד (LEAP) 16, תצוגת משטח לכיד זיקה (ACSD) 17, או ג'ל microdrop טכנולוגיית 18, תוארו על מנת לעקוף את החסרונות במהלך הבחירה של נוגדנים מתאימים. כל השיטות הללו יכולים לשפר היבטים שונים של דור hybridoma וברירה, אבל רובם דורשים ציוד או אופטימיזציה יקר לכל li תא בודדne 16.
שכלול או שינוי אחרים אשר פותח במעבדה שלנו הוא אסטרטגית חיסון רומן עם חלקיקים נגיפיים דמויים כימרי (VLPs), כמתואר מסרשמידט ואח 19. החלקיקים יכולים להיות שונים על ידי רצפי אפיטופ הרצויים מוטמע במבנה המעייל ויראלי והציגו על פני השטח של חלקיקים אלה. זה מוביל מהר מאוד חיסון ספציפי לאחר 4 שבועות החיות המקבילות. נוגדנים חד שבטיים שנוצר יש isotypes IgG2 או IgG1 והם תלויים בבחירה epitope מאוד ספציפיות עבור אנטיגן הילידים. אנחנו גם פתחנו בשלב של בחירה ספציפית עבור תאי hybridoma באמצעות סמנים פני תא מלאכותיים. תאי מיאלומה מהונדסים בשימוש להציג סמן משטח מוכנס ביציבות. סמן משטח זה יכול לשמש כדי antigen- או אלוטיפ-במיוחד למיין תאים hybridoma ישירות לאחר היתוך, ללא הגבלת דילול וללא סינון ELISA מוגזם,כפי נדרשים באמת בטכנולוגית hybridoma הקונבנציונלית 20.
כאמור, יש כמה חלופות מבטיחות זמינות בדור נוגדן חד-שבטים כי, בעתיד, עשוי לשפר את הטיפול ולהפחית את החסרונות של טכנולוגית hybridoma הנוכחית. עם זאת, ההליך תמיד ידרוש זיהוי המפורט של epitope הרצוי בשילוב עם יישום מחמיר ומתוכנן בקפידה כך נוגדן מונוקלונאלי שנוצר עובד בהצלחה. הדור של נוגדנים חד שבטיים ידי טכנולוגיית hybridoma יהיה צעד חשוב והכרחי בעתיד בשל הביקוש העצום במדע, אבחון וטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
