Introduction
Den hybridomteknologi præsenteres i denne protokol blev først beskrevet af Köhler og Milstein 1 i 1975 og med undtagelse af nogle tekniske forbedringer, har den vigtigste procedure ikke ændret sig dramatisk i løbet af de sidste 40 år 2. Formålet med denne protokol er at forklare et mere passende immunisering strategi, en standard fremgangsmåde til generering af monoklonale antistoffer, og et eksempel for en validering fremgangsmåde (ELISA).
Antistoffer er utrolig værktøjer og bidrager til en bred vifte af teknologiske metoder, såsom flowcytometri, magnetisk cellesortering, eller immunfluorescens, samt til diagnostiske og terapeutiske muligheder for overvågning og behandling 3 sygdom. Den kommercielle tilgængelighed af monoklonale antistoffer for ønskede mål påvises ved tilstedeværelsen af flere end 24 forskellige web databaser med næsten utallige mængder antistoffer eller antistof-relaterede produkter 4. I 2015, etntibody molekyler var en del af en international diskussion 5-7 på grund af alvorlige problemer i ordentlig validering og karakterisering af kommercielt tilgængelige antistoffer.
Det kan være vanskeligt og dyrt at finde specifikke antistoffer for et målrettet antigen, og ofte har de ikke har behov for affiniteten eller specificiteten. Selvom generere et antistof er stadig tidskrævende og kræver uddannet personale til at udvikle og validere antistoffet, der producerer et antistof individuelt måske bedre end at købe en.
På grund af det faktum, at antistofproduktion er tidskrævende og kræver erfaring, blev alternative metoder til fremstilling af bindingsmolekyler udviklet for at overvinde disse problemer. Den mest almindeligt anvendte alternativ metode er den rekombinante produktion af enkeltkædede antistoffer via fag-display. Generne for den variable bindingsregion er ekstraheret fra celler og kombineret med belægningen proteinet af en fag. sIngle kæde udtrykkes derefter på overfladen af en bakteriofag og screenet i flere panorering 8 trin. Produktionen af single-antistoffer er en smule hurtigere, men det kræver også en dygtig eksperimentator. Ulemperne ved nogle rekombinante enkeltkædede antistoffer er dårlige stabilitet og manglende egnethed til in vitro diagnostik. I de fleste diagnostiske test, er det nødvendigt med en Fc-receptor for påvisning, som skal tilsættes til en rekombinant enkeltkædet antistof bagefter. Igen er dette tidsrøvende og endnu mere kompleks end hybridomteknikken. I in vitro-diagnostik, har fuld længde monoklonale muse- og kanin-antistoffer blevet påvist at være det bedste valg.
Et af de store skridt i at generere monoklonale antistoffer skal gøres, før arbejdet i laboratoriet starter: design af immunokonjugatet. Spørgsmål, der skal behandles, er: Hvad er den fysiske sammensætning af målet i den endelige APPLICATion, og hvilke matricer er til stede? Hvilken koncentration vil målet har i ansøgningen? Hvad er den endelige ansøgning, og hvad er kravene, at antistoffet skal opfylde?
tage altid hensyn til, at hvis der anvendes et lineært peptid fragment, har det også at være lineær i den endelige epitop i målet af valg; ellers vil antistoffet ikke binde. Selvfølgelig, uafhængig af screeningsmetode, kunne udvælges antistoffer til at genkende forskellige antigene formater i forskellige programmer, men dette skal valideres meget præcist. Disse er grundene til, at antistof-udvikling og validering er så ambitiøse processer.
Valget af den antigene format til immunisering er grundlæggende for antistofudvikling og afgørende for succes eller fiasko af denne proces. Når mus udtrykker et relevant antistoftiter miltcellerne isoleres og fusioneres med myelomaceller. De mest almindelige myeloma- cellelinier tilmurint monoklonalt antistof udvikling er X63-Ag 8.653 9 og Sp2 / 0-Ag 14 10 fra en Balb / c-mus stamme. Cellerne ned fra en malign B-celle-lymfom og blev udvalgt, fordi de ikke udskiller nogen af deres egne tunge eller lette kæder. Cellerne kan tilpasses til et forhold mellem 1:10 og 10: 1 (splenocytter versus myelomaceller). I denne protokol blev cellerne tilpasset til et forhold på 3: 1 og fusioneres ved polyethylenglycol (PEG) og elektrosvejsning, ifølge Stoicheva og Hui 11.
Fusion af B-celler og myelomaceller er en tilfældig proces. Derfor kunne hybrider af to B-lymfocytter eller to myelomceller blive genereret, men de hybrider ville ikke være i stand til at overleve i lang tid i kultur. Cellerne underkastes en hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT) udvælgelse, ved hvilken kun fusionerede hybridomceller kan overleve på grund af muligheden for at anvende de novo vejen for pyrimidin-syntese. Til generering af monoclonal antistoffer, er det nødvendigt at opnå en cellelinie, der stammer fra en mor celle. Den monoklonalitet sikres ved at begrænse fortyndingsteknikker og den mikroskopiske analyse af cellevækst. De hybridoma kultursupernatanter screenes for specifik antistofproduktion, for det meste ved ELISA eller flowcytometri, og de bedste bindere vælges. Efter massekultur og oprensning, kan antistofmolekylet endelig karakteriseres og valideret til den ønskede anvendelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / c eller NMRI-mus (Mus musculus) fra vores ynglekoloni ved universitetet i Potsdam (Potsdam, Tyskland) blev anvendt til fremstilling af monoklonale antistoffer. Dyret arbejde blev udført i overensstemmelse med relevante nationale og internationale retningslinjer. Undersøgelsen blev godkendt af Brandenburg Miljøministeriet, Sundhed og Forbrugerbeskyttelse (referencenummer V3-2347-A16-4-2012).
1. Forberedelse af immunokonjugater
- Til kobling af antigenet til en bærer, anvender standard koblingsmidler protokoller via amino-, carboxy eller sulfo-grupper, såsom ved glutaraldehyd, N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC) eller N - [y-maleimidobutyryloxy ] succinimidester (sulfo-GMBS).
- Til kobling (fx med glutaraldehyd) 13, bruge målproteinet eller peptidet og bæreren (ovalbumin, bovint serumalbumin, eller keyhole limpet hæmocyanin) i en 1: 1-forhold. Fortynd målet protein eller peptid i phosphatbufret saltvand (PBS) og bærerproteinet i 50 mM NaHCO3-puffer. Tilpas volumen og koncentrationen til det beløb, der er nødvendige for vaccinationer.
- Bland begge løsninger og tilsæt 1,25% glutaraldehyd. Blandes og inkuberes prøven i 4 timer ved stuetemperatur (RT). At vælge hybridomacellerne, får samme immunkonjugat, men med en anden bærer, for at undgå valg af uspecifikke carrier bindemidler.
- Dialysere koblingen prøven ved at udføre en hurtig dialyse med kommerciel grove harpiks (f.eks Sephadex G25).
- Perforere bunden af en 1,5-ml prøveglas med en hul nål og læg den i en 15-ml rør. Put glasuld i bunden til tætning og dække det med 300 mg grove harpiks (til stregen på 0,5 ml).
- Forsigtigt, sætte 1 ml PBS dråbevis i en 1,5-ml reagensglas og sørg for, at glasuld stadig forsegling perforeringen. Lad det grove harpiks sgodt og centrifugeres søjlen ved 500 xg i 2 min. En sådan kolonne kan anvendes til at dialysere 200 pi af koblingen prøven. Ved større mængder, gøre flere kolonner.
- Skift røret og slip koblingen opløsningen på svulmede grove harpiks. Centrifuge igen ved 500 x g i 2 min. Fjern eluenten fra røret og bruge det til immunisering.
2. Immunisering af dyr
- Vælg to eller tre 6- til 12 uger gamle Balb / c mus til immunisering.
- For ét dyr, forberede 150 - 200 ug af immunokonjugatet i 200 pi PBS og bland det med 100 pi komplet Freund's adjuvans (CFA). Bland opløsningen 3 gange med en kort og tynd nål (0,6 mm diameter) på en 1 ml sprøjte. Injicer opløsningen intraperitonealt i musen.
- Giv en booster-injektion 6 uger senere med den samme mængde af immunokonjugatet, men uden CFA. Tag blod 7 dage senere (ud af retroorbitale sinus) og prepare serummet ved inkubering af blodet i 3 - 4 timer ved stuetemperatur (RT).
- Centrifugeres blandingen ved 3000 x g i 5 min. Tag serum supernatanten og hældes et nyt rør. Opbevar den ved -20 ° C. Kassér pelleten.
- Analyser sera via ELISA, som beskrevet i trin 3. Til fusion, vælge musen med den højeste serum titer.
- Som forberedelse til cellefusion, øge mus med 150 - 200 ug af immunokonjugatet i 300 pi PBS uden adjuvans kun 4 dage før fusionen.
3. ELISA
- Forbered en antigenopløsning med en koncentration på 5 ug / ml i PBS og overføre 50 pi til hver ELISA brønd af en 96-brønds plade.
- Inkubér pladen i 2 timer ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer.
- Vask pladen 3 gange med ledningsvand. Bloker brøndene med 80 pi PBS / 5% neonatal kalveserum (NCS) per brønd i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt lmrav. Forbered serumfortyndinger i en 1: 5 serie, der starter med 01:50. Til analyse af cellekulturen, bruge den ufortyndede kultursupernatanten.
- Vask pladen 3 gange med ledningsvand. Pipetter 50 pi af prøven pr brønd og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Forbered det sekundære antistof opløsning i en 1: 5000 fortynding af et gede anti-mus IgG-antistof konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP).
- Vask pladen 3 gange med ledningsvand og tilsættes 50 pi af det sekundære antistof opløsning per brønd. Inkuber i 45 minutter ved stuetemperatur i et fugtigt kammer.
- Forbered en frisk substrat løsning. Gør stamopløsninger af 0,1 M NaH 2 PO4 og 0,1% hydrogenperoxid. Tag 5 dele NaH 2 PO4, 4 dele hydrogenperoxid og 1 del tetramethylbenzidin for frisk substratopløsning.
- Vask pladen 10 gange med ledningsvand. Pipetter 50 pi frisk substratopløsning i brøndene og inkuberes i 5 - 10 min imørk.
- Standser reaktionen med 50 pi 1 MH 2 SO 4 per brønd. Anvendelse af en pladelæser, måle den optiske densitet ved 450 nm med en referencebølgelængde på 630 nm.
4. Fremstilling af myelomcelle Cultures
- Fra nu af, udføre alt arbejde under sterile forhold.
- Forbered en frisk dyrkningsmedium til celledyrkning. Supplement 500 ml RPMI1640 med 10% føtalt kalveserum (50 ml), 2 mM L-glutamin (5 ml), og 50 uM mercaptoethanol (5 ml). Erstat glutamin hver 7. dag.
- Optø et hætteglas af murine SP2 / 0-celler i varmt vand. Overfør cellen opløsning i 10 ml frisk kulturmedium og centrifugeres i 10 minutter ved 200 x g. Supernatanten kasseres og pellet resuspenderes i 1 ml frisk dyrkningsmedium.
- Overfør cellerne i en 25-cm2 kolbe og inkubere dem ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator. Udvid cellerne til to 75-m 2 kolber BEFmalm fusion. Spar portioner til langtidsopbevaring, som beskrevet i trin 7.
5. Fremstilling af fødeceller
- Sacrifice en 12-uger gamle NMRI mus (i henhold til nationale og institutionelle retningslinier, fx ved CO 2 inhalation). Fjern pelsen og rens abdomen med 70% ethanol.
- Injicer 5 ml iskold RPMI-medium i maven, massere maven med en pincet, og aspireres feeder cellesuspension. Placer cellerne i en tom 50 ml rør. Udfør dette trin igen. 7 til 10 ml i feeder cellesuspensionen skal hentes.
- Der fremstilles en 100-ml feeder cellesuspension ved tilsætning 90 ml fuld celledyrkningsmedium (RPMI 1640, 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 50 pM mercaptoethanol). Bland den og overføre 100 pi / brønd i 10 x 96-brønds celledyrkningsplader. Inkubér pladerne natten over ved 37 ° C og 5% CO2 i en inkubator.
6. Cellefusion
- Sacrifice den immuniserede mus ved cervikal dislokation eller CO 2 indånding og punktafgifter milten 14. Tag yderligere blod fra hjertet og forberede serum, som beskrevet i trin 2.3, som en positiv kontrol i ELISA.
- Der fremstilles en miltcellesuspension ved at trykke milten gennem en celle si. Fyld op til 20 ml med fuld celledyrkningsmedium. Cellerne høstes i 50-ml rør ved centrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C). Supernatanten kasseres.
- Skyl cellekultur kolben og høste myelomaceller ved centrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C) og kassér supernatanten.
- Resuspender cellepellets i 20 ml balanceret salt buffer (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCI, 4 mM CaCl2, 2,5 mM MgCl2, og 5 mM Tris-HCI, pH 7,4) og centrifugeres igen. Gentag vasketrin tre gange.
- Til justering af splenocyt: myelomcelle-forhold, tælle cellerne efter det andet vasketrin ved granst resuspendere pelleten i 1 ml BSS-buffer. Lav en 1:10 fortynding og overføre 10 pi til en celle tællekammer. Tæl cellerne og bestemme koncentrationen celle i 1 ml.
- Juster celleantal i BSS-buffer til tre-dele splenocytter og et-del myelomceller i en 1-ml slutvolumen. Tag 200 pi af cellesuspensionen og bland det med 200 pi PEG8000 (1 g i 4 ml BSS-puffer). Overfør 400 uL i en elektroporation cuvette med en diameter på 2 mm og sætte pulsen (600-650 V og 25 ms).
- Efter impulsen, inkuberes cellerne ved stuetemperatur i 3 minutter i kuvetten. Fjerne cellerne og sætte dem dråbevis til en Erlenmeyer-kolbe med 100 ml HAT-medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutamin, 50 uM mercaptoethanol, 100 uM hypoxanthin, 5,8 uM azaserin, og 16 uM thymidin).
- Gentag fusion 4 gange indtil 1-ml batch er brugt. Inkubér Erlenmeyer kolbe i 3 timer ved 37 ° C og 5% CO2i en inkubator.
- Supplement cellesuspensionen igen med hypoxanthin, azaserin og thymidin før udpladning af cellerne på fødelag. Tilsæt 100 pi af cellesuspensionen per brønd til feeder layer plader og inkuberes pladerne ved 37 ° C og 5% CO2 (i en inkubator). Den endelige koncentration i brønden skal være 100 pM hypoxanthin, 5,8 uM azaserin, og 16 uM thymidin.
- Udfør en mikroskopisk analyse (forstørrelse: 10X objektiv linse, 10X okular) for klonal vækst i hver brønd af pladen efter 7 dage for at bestemme, om brøndene er mono- eller polyklonale. Monoklonale celler er en klynge af celler, der stammer fra en enkelt celle. Polyklonale celler er flere klynger af celler i en brønd. Skift komplette medier efter 7 dage og inkuberes igen i 7 dage i HAT-medium.
- Ændre HAT-medium og dyrke cellerne i fuld celledyrkningsmedium. Brug supernatanten til at udføre en ELISA, som beskrevet i trin 3. Positive hybridomceller skal udvides i 24-brønds plader i henhold til prøverne til produktion af specifikke antistoffer. Hvis cellerne er polyklonale, en begrænset fortynding skal udføres (beskrevet i trin 8).
7. kryokonservering af hybridomaer
- Cryoconserve positiv mono- og polyklonale hybridomer til langtidsopbevaring. Cellerne høstes fra en 24-brønds plade med et sammenløb af> 60% ved centrifugering (200 x g, 10 min, og 4 ° C).
- Pellet resuspenderes i 500 pi fuld celledyrkningsmedier og overføre det til en cryotube. Tilføj 500 pi fryse medium (RPMI 1640, 20% FCS, og 15% dimethylsulfoxid), bland det, og sætte det i på en Styrofoam boks eller en speciel frysning kassen. Opbevares ved -80 ° C i 3 dage. Efter 3 dage, kan den cryotube overføres til flydende nitrogen til langvarig opbevaring.
8. begrænsende fortynding af polyklonale Hybridomer
- Makea fødelag kultur, som beskrevet i trin 5. Harvest positive polyklonale celler, som beskrevet i trin 7.1. Tæl cellerne, som beskrevet i trin 6.5, og justere celletallet til 10 celler / ml, med et slutvolumen på 10 ml til en 96-brønds plade. Tilsæt 100 pi / brønd på fødelag.
- Inkuber i 7 dage ved 37 ° C og analysere den klonale vækst mikroskopisk (forstørrelse: 10X objektiv linse, 10X okular). Lav en ELISA af kultursupernatanten, som beskrevet i trin 3, og identificere de relevante monoklonale hybridomer til massekulturen.
9. massekultur og oprensning af monoklonale antistoffer
- Overfør de monoklonale hybridomer med de passende ELISA-signaler til 25 cm2 eller 75 cm2 kolber og samle op til 500 ml af kultursupernatanten. Test kultur ugentligt for specifik antistofproduktion og bevare 3 - 5 portioner pr hybridom for langtidsopbevaring, som beskrevet i trin 7.
- Der fremstilles en protein A-søjle ved at vaske det med vaskebuffer (fortynde bindingsbuffer 1: 3 i dH2O). Passere supernatanten fra trin 9.2 over kolonnen og indsamle gennemløbet. Eluere det bundne antistof med 0,1 M citrat, pH 3,5 og neutralisere pH straks med 500 pi Tris-HCI, pH 9,0.
- Karakterisere eluerede antistof ved SDS-PAGE, Western Blot og ELISA, og validere den til den endelige ansøgning.
- På SDS PAGE, tage 3 - 5 ug oprenset antistofopløsning per bane (en prøve 20-pi), tilsættes 5 pi 4x SDS prøvepåsætningsbuffer (8% SDS, 20% 2-mercaptoethanol, 40% glycerol og 0,015 % bromphenol, reduceret), og opvarm proberne ved 95 ° C i 5 min. Som en kontrol, bruge den samme prøve med en renset enntibody af samme isotype, men irrelevant specificitet.
- Læg prøverne på en 12,5% SDS-gel, placere 5 pi en uplettet protein stige i en ekstra vognbane, og adskille dem ved elektroforese. Farv gelen med Coomassie Brilliant Blue og dokumentere resultaterne. En grundlæggende SDS-protokol blev etableret af Laemmli i 1970 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et eksempel på antigen-specifikke serum titer for en immunisering udført i laboratoriet. I denne figur blev immunsera A og B titreret fra 1:50 til 1: 5.000.000 i sammenligning med en serum fra en naiv mus. Antigenet blev belagt på den faste fase, og de specifikke antistoffer blev påvist med et POD-konjugeret gede-anti-muse-Ig-antistof. Både sera af de immuniserede mus viste en signifikant højere antigenspecifik titer sammenlignet med naive mus. Signalet ved en fortynding på 1: 5.000 er tilstrækkelig til at gå videre til det næste trin, cellefusionen.
Væksten af hybridomer var synlig efter 7 til 10 dages HAT udvælgelse af udviklingen af cellekloner, som vist i figur 2. Billedet blev taget fra en 96-brønds plade 10 dage efter fusion. De cellekloner og aminopterinemono- eller polyklonalitet af brøndeneblev overvåget af de enkelte mikroskopiske analyser (forstørrelse: 10X objektiv, 10X eye-stykke). Monoklonale brønde blev mærket med et punkt på toppen af pladen. Når pladerne blev testet i ELISA, kunne antigenspecifikke signaler fra monoklonale hybridomer kan let identificeres. Positive hybridomakulturer genklonet, ekspanderet, og cryoconserved indtil kulturen var monoklonale, stabil, og antigenspecifik. Kultursupernatanten blev opsamlet i den tid af dyrkning for at oprense det producerede monoklonale antistof via protein A-medieret affinitetschromatografi. Figur 3 viser en standard elueringsprofil af et monoklonalt antistof med et IgG1-isotype.
Oprensede monoklonale antistoffer blev yderligere karakteriseret ved en SDS PAGE, som vist i figur 4. Ved 50 og 25 kDa, de tunge og lette kæder var klart synlige, hvilket viser oprensningen af et antistofmolekyle. Bane 2 showed en kontrol antistof med samme isotype.
Figur 1: Serum Titrering efter immunisering. Seraene fra to mus blev titreret i fortyndinger fra 1:50 till 1: 5.000.000 og testet for antigenspecificitet ved en ELISA. Som kontrol serum fra en ikke-immuniserede mus blev anvendt i en fortynding på 1:50. De antigenspecifikke signaler var positive for både immuniserede mus og splenocytterne af muse A blev anvendt til hybridoma generation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Fotografier af mono- og polyklonale hybridomer. Mono- og polyklonale hybridomas blev mikroskopisk analyseret 10 dage efter cellefusion. Billederne viser den konventionelle resultat for stabile hybridomcellelinier med monoklonalt (A) og polyklonale (B) egenskaber. En skala bar: 10 pm; B skala bar: 10 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Standard elueringsprofilen for et monoklonalt antistof med et IgG1-isotype. Den genererede monoklonale antistof blev oprenset via protein A-medieret affinitetschromatografi, og elueringsprofilen af et IgG1-antistof er vist i figuren. Den første top angiver den eluerede monoklonale antistof molekyle ved pH 5,0. De følgende toppe indikerer pH 3,5 og pH 2,0. Reduktionen pH er nødvendigtil helt at rense kolonne i alle stoffer og til at regenerere kolonnen matrix for de næste oprensninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Standard SDS PAGE for et monoklonalt antistof med et IgG1-isotype. Renheden af antistoffet eluenten blev bestemt ved en Coomassie-farvet SDS-PAGE. 5 ug af antistofopløsningen blev påført på L2 og sammenlignet med 5 ug af en standard IgG1 antistof i L3 under reducerede betingelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Frembringelsen af monoklonale antistoffer ved hybridomteknologi kræver en intens og detaljeret epitop analyse, navnlig med hensyn til den endelige anvendelse, når antistoffet bør anerkende målet. Dette er ofte undervurderet af brugere og fører til antistoffer med svage præstationer. Fusionsprocessen er altid tilfældig, hvilket betyder, at resultatet af specifikke hybridomaer er meget afhængige af den celle-forhold og vitaliteten på dette punkt. Efter begrænset fortynding, cellerne er meget ustabile og kræver strengere kontrol af cellevækst og antistofproduktion. Disse parametre bør nøje analyseret ved fejlfinding af metoden.
Yderligere begrænsninger af teknikken indbefatter nødvendig for cellelinie generationstid og udvælgelsen af det ønskede antistof-producerende celle. På grund af den tetraploide sæt kromosomer efter fusion, cellerne er meget ustabile og bagefter reducere indstillet til haploid igen. Dette kunneføre til tab af antistof-gener, der forårsager, at cellerne ikke producere antistoffer længere. En anden begrænsning er, at udvælgelsen af de ønskede antistof-producerende celler er baseret på kultursupernatanten og ikke på de oprensede antistof-løsninger. Derfor er en endelig karakterisering af antistoffet er, i de fleste tilfælde først mulig efter massekultur af den valgte hybridomklon. Således risikoen for, at antistoffet ikke er i stand til at arbejde på den endelige brug er meget høj.
Adskillige teknologiske ændringer, såsom laser-aktiverede analyse og teknologi (LEAP) 16, capture overflade display (ACSD) 17 affinitet, eller gel MicroDrop teknologi 18, blev beskrevet for at omgå ulemperne ved udvælgelsen af egnede antistoffer. Alle disse metoder er i stand til at forbedre forskellige aspekter af hybridoma generation og udvælgelse, men de fleste af dem kræver kostbart udstyr eller optimering for hver enkelt celle line 16.
En anden forbedring eller modifikation, der blev udviklet i vores laboratorium er en hidtil ukendt immunisering strategi med kimære virale partikler (VLP'er), som beskrevet i Messerschmidt et al 19. Partiklerne kan ændres af de ønskede epitopsekvenser indlejret i det virale coat struktur og præsenteres på overfladen af disse partikler. Dette fører til meget hurtig og specifik immunisering efter 4 uger i de tilsvarende dyr. De genererede monoklonale antistoffer har IgG2 eller IgG1 isotyper og er afhængige af epitop udvælgelse yderst specifik for det native antigen. Vi har også udviklet en specifik selektionstrin for hybridomceller ved anvendelse af kunstige celleoverflademarkører. De anvendte transgene myelomceller vise en stabilt indsat overflademarkør. Denne overflademarkør kan anvendes til antigen- eller isotype-specifikt sortere hybridomceller direkte efter fusion uden at begrænse fortynding og uden større ELISA screening,som er faktisk nødvendigt konventionel hybridomteknologi 20.
Som nævnt ovenfor er der nogle lovende alternativer i monoklonalt antistof generation, som i fremtiden kan forbedre håndteringen og reducerer ulemperne ved den nuværende hybridomteknologi. Ikke desto mindre vil den procedure altid kræve detaljeret identifikation af den ønskede epitop i kombination med en stringent og nøje planlagt program, så den genererede monoklonale antistof fungerer med succes. Frembringelsen af monoklonale antistoffer ved hybridomteknologi vil være et vigtigt og nødvendigt skridt i fremtiden på grund af den enorme efterspørgsel inden for videnskab, diagnostik og terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
