Introduction
Tekniken hybridom som presenteras i detta protokoll beskrevs först av Köhler och Milstein en 1975 och, med undantag för vissa tekniska förbättringar, har huvudproceduren inte förändrats dramatiskt under de senaste 40 åren 2. Syftet med detta protokoll är att förklara en mer lämplig immunisering strategi, en standardmetod för generering av monoklonala antikroppar, och ett exempel för en valideringsmetod (ELISA).
Antikroppar är otroligt verktyg och bidra till ett brett spektrum av tekniska metoder, såsom flödescytometri, magnetisk cellsortering, eller immunofluorescens, samt diagnostiska och terapeutiska möjligheter för övervakning och behandling 3 sjukdom. Den kommersiella tillgängligheten av monoklonala antikroppar för önskade mål demonstreras av närvaron av över 24 olika webbdatabaser med nästan oräkneliga mängder av antikroppar eller antikroppsrelaterade produkter 4. År 2015, enntibody molekyler var en del av en internationell diskussion 5-7 på grund av allvarliga problem i korrekt validering och karaktärisering av kommersiellt tillgängliga antikroppar.
Det kan vara svårt och dyrt att hitta specifika antikroppar för en målinriktad antigen, och ofta, har de inte affiniteten eller specificiteten behövs. Även generera en antikropp är fortfarande tidsödande och kräver kunnig personal för att utveckla och validera antikroppen, som producerar en antikropp individuellt kanske bättre än att köpa en.
På grund av det faktum att antikroppsproduktion är tidskrävande och kräver erfarenhet, var alternativa metoder för produktion av bindande molekyler som utvecklats för att övervinna dessa problem. Den vanligast använda alternativ metod är rekombinant produktion av enkelkedjiga antikroppar via faguppvisning. Generna för den variabla bindningsregionen extraheras från celler och kombineras med beläggningsprotein av en fag. sIngle kedjan sedan uttrycks på ytan av en bakteriofag och screening i flera vaskningssteg 8. Produktion av enkelkedjiga antikroppar är lite snabbare, men det kräver också en skicklig experimentalist. Nackdelarna med vissa rekombinanta enkelkedjiga antikroppar är dålig stabilitet och brist på lämplighet för in vitro-diagnostik. I de flesta diagnostiska tester, är ett Fc-receptor för detektering krävs, som måste tillsättas till en rekombinant enkelkedjig antikropp efteråt. Återigen är detta tidskrävande och ännu mer komplext än hybridomtekniken. I in vitro-diagnostik, har full längd monoklonal mus- och kaninantikroppar visat sig vara det bästa valet.
En av de viktigaste stegen i att generera monoklonala antikroppar måste göras innan arbetet i labbet startar: utformningen av immunkonjugatet. Frågor som måste lösas är: Vad är den fysiska sammansättningen av målet i den slutliga applicatjon, och vilka matriser är närvarande? Vilken koncentration kommer målet har i ansökan? Vad är den slutliga ansökan, och vilka är de krav som antikroppen måste uppfylla?
tar alltid hänsyn till att om en linjär peptidfragment används, måste det också vara linjär i slut epitopen i målet val; annars kommer antikroppen inte binder. Naturligtvis, oberoende av screeningmetoden, antikroppar kan väljas för att känna igen olika antigena format i olika applikationer, men detta måste valideras mycket exakt. Dessa är skälen till antikroppsutveckling och validering är sådana ambitiösa processer.
Valet av antigena format för immunisering är grundläggande för utveckling av antikroppsläkemedel och bestämmer framgång eller misslyckande av denna process. När mössen uttrycker en relevant antikroppstiter ges mjältcellerna isolerades och fuserades med myelomceller. De vanligaste myelomcellinjer förmurin monoklonal antikroppsutveckling är X63-Ag 8,653 9 och Sp2 / 0-Ag 14 10 från en Balb / c-mus stam. Cellerna härstammar från en malign B-cell-lymfom och valdes ut eftersom de inte utsöndrar någon av sina egna tunga eller lätta kedjor. Cellerna kan anpassas till ett förhållande mellan 1:10 och 10: 1 (splenocyter kontra myelomceller). I detta protokoll ades cellerna anpassas till ett förhållande av 3: 1 och sammansmältes genom polyetylenglykol (PEG) och elektrofusion, enligt Stoicheva och Hui 11.
Fusion av B-celler och myelomceller är en slumpmässig process. Därför hybrider av två B-lymfocyter eller två myelomceller skulle kunna genereras, men de hybrider skulle inte kunna överleva under lång tid i odling. Cellerna genomgå en hypoxantin, aminopterin och tymidin (HAT) selektion, genom vilken endast fuserade hybridomcellerna kan överleva på grund av möjligheten att använda den vägen för pyrimidinsyntes de novo. För generering av månoclonal antikroppar, är det nödvändigt att erhålla en cellinje som härrör från en modercell. Den monoklonasäkerställs genom att begränsa utspädningstekniker och mikroskopisk analys av celltillväxt. De hybridomodlingssupernatanter screenas med avseende på specifik antikroppsproduktion, mestadels av ELISA eller flödescytometri, och de bästa bindemedlen är valda. Efter masskultur och rening, kan antikroppsmolekylen slutligen karaktäriseras och validerats för den önskade applikationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balb / c eller NMRI-möss (Mus musculus) från vår avel koloni vid University of Potsdam (Potsdam, Tyskland) användes för produktion av monoklonala antikroppar. Djuret arbete har utförts enligt gällande nationella och internationella riktlinjer. Studien godkändes av Brandenburg ministeriet för miljö, hälsa och konsumentskydd (referensnummer V3-2347-A16-4-2012).
1. Framställning av Immunkonjugat
- För koppling av antigenet till en bärare, använd standardkopplingsprotokoll via amino-, karboxi eller sulfo-grupper, såsom genom glutaraldehyd, N - (3-dimetylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC), eller N - [y-maleimidobutyryloxy ] succinimidester (sulfo-GMBS).
- För koppling (t.ex. med glutaraldehyd) 13, använder mål-proteinet eller peptiden och bäraren (ovalbumin, bovint serumalbumin eller keyhole limpet hemocyanin) i en 1: 1-förhållande. Späd målet protein eller peptid i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) och bärarproteinet i 50 mM NaHCOs 3-buffert. Anpassa volymen och koncentrationen till det belopp som krävs för vaccinationer.
- Blanda båda lösningarna och tillsätt 1,25% glutaraldehyd. Blanda och inkubera provet under 4 h vid rumstemperatur (RT). För att välja de hybridomceller, göra samma immunokonjugatet, men med annan transportör, för att undvika val av ospecifika bärare bindemedel.
- Dialysera kopplings provet genom att utföra en snabb dialys med kommersiell grova harts (t.ex. Sephadex G25).
- Perforerar botten av en 1,5-ml reaktionsflaska med en ihålig nål och placera den i en 15-ml rör. Sätt glasull i botten för att täta och täcka den med 300 mg av grova harts (till märket på 0,5 ml).
- Försiktigt satte 1 ml PBS droppvis i en 1,5 ml reaktionsröret och se till att glasullen fortfarande tätar perforeringen. Låt den grova harts sväl och centrifugera kolonnen vid 500 xg under 2 min. En sådan kolonn kan användas för att dialysera 200 pl av kopplings provet. För större volymer, göra fler kolumner.
- Ändra röret och släpp kopplingslösningen på svällde grova harts. Centrifugera igen vid 500 x g under 2 min. Avlägsna elueringsmedlet från röret och använda den för immunisering.
2. Immunisering av djur
- Välj två eller tre 6 till 12 veckor gamla Balb / c-möss för immunisering.
- För ett djur, förbereda 150-200 pg av immunokonjugatet i 200 mikroliter av PBS och blanda det med 100 mikroliter av komplett Freund's adjuvans (CFA). Blanda lösningen 3 gånger med en kort och tunn nål (0,6 mm diameter) på en 1-ml spruta. Injicera lösningen intraperitonealt i musen.
- Ge en boosterinjektion 6 veckor senare med samma mängd av immunkonjugatet, men utan CFA. Ta blod 7 dagar senare (av den retroorbitala sinus) och prepare serumet genom inkubation av blod för 3 - 4 h vid rumstemperatur (RT).
- Centrifugera blandningen vid 3000 x g under 5 min. Ta serum supernatanten och överföra den till ett nytt rör. Förvara den vid -20 ° C. Kassera pellet.
- Analysera sera via ELISA, såsom beskrivits i steg 3. För fusion, väljer musen med den högsta serum titer.
- Som förberedelse för cellfusion, öka musen med 150-200 | ig av immunokonjugatet i 300 mikroliter av PBS utan adjuvans endast 4 dagar före fusionen.
3. ELISA
- Framställa en antigenlösning med en koncentration av 5 | ig / ml i PBS och överför 50 | il till varje ELISA brunn i en 96-brunnsplatta.
- Inkubera plattan under 2 h vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C i en fuktig kammare.
- Tvätta plattan 3 gånger med kranvatten. Blockera brunnarna med 80 mikroliter av PBS / 5% neonatal kalvserum (NCS) per brunn under 1 timme vid RT i en fuktig lmbärnsten. Förbered serumspäd i en 1: 5-serien som börjar med 01:50. För analys av cellkulturen, använd outspädd odlingssupernatant.
- Tvätta plattan 3 gånger med kranvatten. Pipettera 50 | il av provet per brunn och inkubera under 1 h vid RT i en fuktig kammare. Förbered sekundär antikropp lösning i en 1: 5000-spädning av en get-anti-mus-IgG-antikropp konjugerad till pepparrotsperoxidas (HRP).
- Tvätta plattan 3 gånger med kranvatten och tillsätt 50 | il av den sekundära antikroppen lösning per brunn. Inkubera under 45 min vid RT i en fuktig kammare.
- Bered en färsk substratlösning. Gör förrådslösningar av 0,1 M NaH 2 PO 4 och 0,1% väteperoxid. Ta 5 delar NaH 2 PO 4, 4 delar väteperoxid, och en del tetrametylbensidin för färsksubstratlösningen.
- Tvätta plattan 10 gånger med kranvatten. Pipett 50 mikroliter av färsk substratlösning i brunnarna och inkubera i 5-10 min imörk.
- Stoppa reaktionen med 50 mikroliter 1 MH 2 SO 4 per brunn. Med användning av en plattläsare, mäta den optiska densiteten vid 450 nm med en referensvåglängd på 630 nm.
4. Framställning av myelomcell kulturer
- Från och med nu, kan utföra allt arbete under sterila förhållanden.
- Bered en färsk odlingsmedium för cellodling. Komplettera 500 ml av RPMI1640 med 10% fetalt kalvserum (50 ml), 2 mM L-glutamin (5 ml) och 50 ^ M merkaptoetanol (5 ml). Ersätt glutamin var 7 dagar.
- Tina en flaska med murina SP2 / 0-celler i varmt vatten. Överför cell lösningen i 10 ml färskt odlingsmedium och centrifugera i 10 min vid 200 x g. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml färskt odlingsmedium.
- Överföra celler i en 25-cm 2 kolv och inkubera dem vid 37 ° C och 5% CO2 i en inkubator. Expandera cellerna till två 75-m 2 flaskor BEFmalm fusion. Bevara portioner för långtidsförvaring, som beskrivs i steg 7.
5. Beredning av matarceller
- Offra en 12 veckor gammal NMRI-mus (enligt nationella och institutionella riktlinjer, t.ex. genom CO 2 inandning). Ta pälsen och rengör buken med 70% etanol.
- Injicera 5 ml iskall RPMI-medium i buken, massera buken med en pincett, och aspirera matarcellsuspension. Placera cellerna i en tom 50-ml rör. Utför detta steg en gång. 7 till 10 ml av matar cellsuspensionen ska hämtas.
- Bered en 100-ml matarcellsuspension genom att tillsätta 90 ml av fullt cellodlingsmedium (RPMI 1640, 10% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin och 50 | iM merkaptoetanol). Blanda det och överför 100 pl / brunn i 10 x 96-brunnars cellodlingsplattor. Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C och 5% CO2 i en inkubator.
6. Cellfusion
- Offra immuniserade musen genom halsdislokation eller CO 2 inandning och skära mjälten 14. Ta ytterligare blod från hjärtat och förbereda serum, såsom beskrivs i steg 2,3, som en positiv kontroll i ELISA.
- Bered en mjältcellsuspension genom att trycka på mjälten genom en cell sil. Fyll upp till 20 ml med full cellkulturmedium. Skörda cellerna i 50-ml rör genom centrifugering (200 xg, 10 min och 4 ° C). Kassera supernatanten.
- Skölj cellkultur kolv och skörda myelomceller genom centrifugering (200 xg, 10 min och 4 ° C) och kassera supernatanten.
- Resuspendera cellpelletarna i 20 ml av balanserade saltbuffert (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl2, 2,5 mM MgCl2, och 5 mM Tris-HCl; pH 7,4) och centrifugera igen. Upprepa tvättningsstegen tre gånger.
- För justering av splenocyter: myelom cellförhållande, räkna cellerna efter det andra tvättsteget av granst återsuspendering av pelleten i 1 ml BSS-buffert. Gör en spädning 1:10 och överföra 10 mikroliter till en cellräkningskammare. Räkna celler och bestämma cellkoncentrationen i 1 ml.
- Justera cellnumren i BSS-buffert till tre-parts splenocyter och en-del-myelomceller i ett 1-ml slutlig volym. Ta 200 mikroliter av cellsuspensionen och blanda det med 200 mikroliter av PEG8000 (1 g i 4 ml BSS-buffert). Överför 400 | il till en elektroporeringskyvett med en diameter av 2 mm och ställ in puls (600-650 V och 25 ms).
- Efter pulsen, inkubera cellerna vid RT under 3 min i kuvetten. Avlägsna cellerna och sätta dem droppvis in i en Erlenmeyer-kolv med 100 ml av HAT-medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutamin, 50 ^ M merkaptoetanol, 100 | iM hypoxantin, 5,8 ^ M azaserin och 16 | iM tymidin).
- Upprepa fusion 4 gånger tills en ml sats används. Inkubera Erlenmeyerkolven i 3 h vid 37 ° C och 5% CO2i en inkubator.
- Komplettera cellsuspensionen igen med hypoxantin, azaserin och tymidin före utstrykning av celler på matarlager. Tillsätt 100 mikroliter av cellsuspensionen per brunn till matarskiktsplattor och inkubera plattorna vid 37 ° C och 5% CO2 (i en inkubator). Den slutliga koncentrationen i brunnen bör vara 100 iM hypoxantin, 5,8 | iM azaserin, och 16 ^ M tymidin.
- Utföra en mikroskopisk analys (förstoring: 10X objektivlins, 10X okular) för klonal tillväxt i varje brunn i plattan efter 7 dagar för att bestämma om brunnarna är mono- eller polyklonal. Monoklonala celler är ett kluster av celler som härstammar från en enda cell. Polyklonala celler finns flera kluster av celler i en brunn. Ändra komplett medium efter 7 dagar och inkubera igen i 7 dagar i HAT-medium.
- Ändra HAT-medium och odla cellerna i fullcellodlingsmediet. Använda supernatanten för att utföra en ELISA, som beskrivs i steg 3. Positiva hybridomceller måste expanderas i 24-brunnsplattor enligt tester för produktion av specifika antikroppar. Om cellerna är polyklonala, har en begränsad utspädning som skall utföras (beskrivs i steg 8).
7. kryokonservering av hybridom
- Cryoconserve positiv mono- och polyklonala hybridom för långtidsförvaring. Skörda cellerna från en 24-brunnsplatta med ett sammanflöde av> 60% genom centrifugering (200 xg, 10 min och 4 ° C).
- Suspendera pelleten i 500 mikroliter full cellodlingsmedier och överföra den till en cryotube. Tillsätt 500 mikroliter av frysmedium (RPMI 1640, 20% FCS, och 15% dimetylsulfoxid), blanda den och lägga den i en frigolitlåda eller en speciell frysboxen. Lagra vid -80 ° C under 3 dagar. Efter 3 dagar, kan cryotube överföras till flytande kväve för långtidslagring.
8. Begränsande Utspädning av Polyklonal Hybridom
- makmatarskikt ea kultur, såsom beskrivits i steg 5. Harvest positiva polyklonala celler, såsom beskrivits i steg 7,1. Räkna celler, såsom beskrivits i steg 6,5, och justera cellantalet till 10 celler / ml, med en slutlig volym av 10 ml för en 96-brunnars platta. Tillsätt 100 | il / brunn på matarskikt.
- Inkubera under 7 dagar vid 37 ° C och analysera den klonala tillväxten mikroskopiskt (förstoring: 10X objektivlins, 10X okular). Gör en ELISA av kultursupernatanten, som beskrivs i steg 3, och fastställa lämpliga monoklonala hybridomen för masskultur.
9. masskultur och rening av monoklonala antikroppar
- Överför monoklonala hybridomen med lämpliga ELISA-signaler till 25 cm 2 eller 75 cm 2 kolvar och samla upp till 500 ml kultursupernatanten. Testa kultur varje vecka för specifik antikroppsproduktion och bevara 3 - 5 portioner per hybridom för långtidsförvaring, som beskrivs i steg 7.
- Förbered en protein A-kolonn genom att tvätta den med tvättbuffert (späd bindningsbufferten 1: 3 i dH 2 O). Passera supernatanten från steg 9,2 över kolonnen och samla genomströmning. Eluera den bundna antikroppen med 0,1 M citrat, pH 3,5 och neutralisera pH-värdet omedelbart med 500 | il av Tris-HCl, pH 9,0.
- Karakterisera den eluerade antikroppen med hjälp av SDS-PAGE, Western Blöt och ELISA, och validera den för den slutliga tillämpningen.
- För SDS PAGE, ta 3-5 ug av renad antikroppslösning per bana (en 20-mikroliter prov), tillsätt 5 mikroliter av 4x SDS-provladdningsbuffert (8% SDS, 20% 2-merkaptoetanol, 40% glycerin, och 0,015 % bromfenol, reducerad), och värm proberna vid 95 ° C under 5 min. Som en kontroll, använder samma prov med en renad enntibody av samma isotyp men irrelevant specificitet.
- Ladda proverna på en 12,5% SDS-gel, placera 5 mikroliter av en ofärgad protein stege i en extra körfält, och separera dem genom elektrofores. Fläcka gelén med Coomassie Brilliant Blue och dokumentera resultaten. En grundläggande SDS protokoll ades av Laemmli 1970 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett exempel på den antigenspecifika serumtiter för en immunisering utförs i labbet. I denna figur, var immunsera A och B titrerades från 1:50 till 1: 5000000 i jämförelse med en serum från en naiv mus. Antigenet belades på den fasta fasen, och de specifika antikropparna detekterades med en POD-konjugerad get-anti-mus-Ig-antikropp. Både sera från de immuniserade mössen visade en signifikant högre antigenspecifik titer jämfört med naiva mus. Signalen vid en utspädning av 1: 5000 är tillräcklig för att gå vidare till nästa steg, cellfusionen.
Tillväxten av hybridom var synlig efter 7 till 10 dagar efter HAT-selektion av utvecklingen av cellkloner, såsom visas i figur 2. Bilden togs från en 96-brunnars platta 10 dagar efter fusion. De cellkloner och aminopterinemono- eller polyclonality av brunnarnaövervakades av enskilda mikroskopiska analyser (förstoring: 10X objektiv, 10X okular). Monoklonala brunnar märktes med en punkt på toppen av plattan. När plattorna testades i ELISA, kan antigenspecifika signaler från monoklonala hybridom lätt identifieras. Positiva hybridomkulturerna återklonades, utvidgas, och cryoconserved tills kulturen var monoklonala, stabil, och antigen-specifik. Odlingssupernatanten samlades under tiden för odling i syfte att rena den producerade monoklonala antikroppen via protein A-medierad affinitetskromatografi. Figur 3 visar en standard elueringsprofil av en monoklonal antikropp med en lgG1-isotyp.
Renade monoklonala antikroppar karakteriserades ytterligare genom en SDS PAGE, såsom visas i fig 4. Vid 50 och 25 kDa, de tunga och lätta kedjorna var klart synliga, vilket tyder på rening av en antikroppsmolekyl. Lane 2 showed en kontrollantikropp som har samma isotyp.
Figur 1: Serumtitreringsmetod efter immunisering. Sera från två möss titrerades i utspädningar från 1:50 till 1: 5 miljoner och testas för antigenspecificitet genom en ELISA. Som kontroll serum från en icke-immuniserad mus användes i en spädning av 1:50. De antigenspecifika signaler var positiva för både immuniserade möss och splenocyterna från mus A användes för hybridom generation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Photographs av mono- och polyklonala hybridom. Mono- och polyklonala hybridomas var mikroskopiskt analyserat 10 dagar efter cellfusion. Bilderna visar den konventionella utfallet för stabila hybridoma cellinjer med monoklonal (A) och polyklonala (B) egenskaper. En skala bar: 10 pm; B skala bar: 10 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Standard Eluering Profil en monoklonal antikropp med en lgG1 isotyp. Den genererade monoklonala antikroppen renades via protein A-medierad affinitetskromatografi och elueringsprofilen för en IgG 1-antikropp visas i figuren. Den första toppen indikerar den eluerade monoklonala antikroppsmolekylen vid pH 5,0. Följande toppar indikerar pH 3,5 och pH 2,0. Den pH-sänkning är nödvändigtatt helt rengöra kolumnen i alla ämnen och att regenerera kolonnmatrisen för nästa reningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Standard SDS PAGE för en monoklonal antikropp med en lgG1-isotyp. Renheten av antikroppen elueringsmedel bestämdes genom en Coomassie-färgad SDS-PAGE. 5 mikrogram av antikroppslösningen applicerades på L2 och jämfört med 5 mikrogram av en standard IgG1 antikropp i L3 under reducerade förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Genereringen av monoklonala antikroppar genom hybridomteknik kräver en intensiv och detaljerad epitop analys, särskilt när det gäller den slutliga tillämpningen, när antikroppen bör erkänna målet. Detta är ofta underskattas av användare och leder till antikroppar med svaga prestationer. Fusionsprocessen är alltid slumpmässigt, vilket innebär att resultatet av specifika hybridom är i hög grad beroende av cellförhållandet och vitaliteten vid denna punkt. Efter begränsad utspädning, cellerna är mycket instabila och kräver strängare övervakning av celltillväxt och antikroppsproduktion. Dessa parametrar bör noggrant analyseras vid felsökning metoden.
Ytterligare begränsningar av tekniken inkluderar den tid som behövs för cellinje generering och val av den önskade antikroppsproducerande cell. På grund av den tetraploida uppsättning av kromosomer efter fusion, cellerna är mycket instabil och därefter reducera den inställda till haploida igen. detta kundeleda till förlust av antikroppsrelaterade gener, vilket orsakar att cellerna inte producerar antikroppar längre. En annan begränsning är att valet av de önskade antikroppsproducerande cellerna är baserad på odlingssupernatanten och inte på de renade antikroppslösningar. Därför kan en slutlig karakterisering av antikroppen är, i de flesta fall endast möjlig efter masskultur för den valda hybridomklon. Således är risken för att antikroppen inte är i stånd att arbeta i den slutliga tillämpningen mycket hög.
Flera tekniska modifieringar, såsom laser-aktiverade analys och processteknik (LEAP) 16, affinitetsinfångningsytan display (ACSD) 17, eller gel microdrop teknik 18, beskrevs i syfte att kringgå nackdelarna under valet av lämpliga antikroppar. Alla dessa metoder kan förbättra olika aspekter av hybridom generation och val, men de flesta av dem kräver dyr utrustning eller optimering för varje enskild cell line 16.
En annan förbättring eller modifiering som utvecklats i vårt labb är en ny immunisering strategi med chimära viruslika partiklar (VLP), som beskrivs i Messerschmidt et al 19. Partiklarna kan modifieras av de önskade epitopsekvenser inbäddade i virala höljesstruktur och som presenteras på ytan av dessa partiklar. Detta leder till mycket snabb och specifik immunisering efter 4 veckor i motsvarande djur. De alstrade monoklonala antikropparna har IgG2 eller lgG1-isotyper och är beroende av den epitop urvalet mycket specifika för det nativa antigenet. Vi utvecklade också en specifik selektionssteg för hybridomceller genom att använda konstgjorda cellytmarkörer. De använda transgena myelomceller visar en stabilt införas yta markör. Denna yta markör kan användas för att antigen- eller isotyp-specifikt sortera hybridomceller direkt efter fusion, utan att begränsa utspädning och utan överdriven ELISA screening,som är faktiskt nödvändigt konventionell hybridomteknologi 20.
Såsom nämnts ovan, det finns några lovande alternativen som finns i den monoklonala antikroppen generation som, i framtiden, skulle kunna förbättra hanteringen och minska nackdelarna med den nuvarande hybridomteknologi. Ändå kommer förfarandet alltid kräver en noggrann avgränsning av den önskade epitopen i kombination med en strikt och noggrant planerad program så att det genererade monoklonala antikroppen fungerar framgångsrikt. Genereringen av monoklonala antikroppar genom hybridomteknik blir ett viktigt och nödvändigt steg i framtiden på grund av den enorma efterfrågan inom vetenskap, diagnostik och terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
- Köhler, G., Milstein, C. Continous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 7 (256), 495-497 (1975).
- Hanack, K., Messerschmidt, K., Listek, M. Antibodies and Selection. Protein Targeting Compounds. Böldicke, T. , Springer Verlag. Berlin Heidelberg. 11-22 (2015).
- Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks. Nat Biotechnol. 32 (10), 992-1000 (2014).
- Pauly, D., Hanack, K. How to avoid pitfalls in antibody use. F1000 Res. 7 (4), 691-698 (2015).
- Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature. 5 (518), 27-29 (2015).
- Polakiewicz, R. D. Antibodies: The solution is validation. Nature. 26 (518), 483 (2015).
- Baker, M. Antibody anarchy: A call to order. Nature. 26 (527), 545-551 (2015).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Kearney, J. F., Radbruch, A., Liesegang, B., Rajewsky, K. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J Immunol. 123 (4), 1548-1550 (1979).
- Shulman, M., Wilde, C. D., Köhler, G. A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature. 16 (276), 269-270 (1978).
- Stoicheva, N. G., Hui, S. W. Electrically induced fusion of mammalian cells in the presence of polyethylene glycol. J Membr Biol. 141 (2), 177-182 (1994).
- Osterhaus, A. D., Uytdehaag, A. G. Current developments in hybridoma technology. Tijdschr Diergeneeskd. 15 (110), 835-839 (1985).
- Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 798-802 (2004).
- Vitetta, E. S., Baur, S., Uhr, J. W. Cell Surface Immunoglobulin II. Isolation and characterization of immunoglobulin from mouse splenic lymphocytes. Journal of experimental medicine. 134, 242-264 (1971).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Browne, S. M., Al-Rubeai, M. Selection methods for high-producing mammalian cell lines. Trends Biotechnol. 25 (9), 425-432 (2007).
- Holmes, P., Al-Rubeai, M. Improved cell line development by a high throughput affinity capture surface display technique to select for high secretors. J Immunol Methods. 19 (230), 141-147 (1999).
- Weaver, J. C., McGrath, P., Adams, S. Gel microdrop technology for rapid isolation of rare and high producer cells. Nat Med. 3 (5), 583-585 (1997).
- Messerschmidt, K., Hempel, S., Holzlöhner, P., Ulrich, R. G., Wagner, D., Heilmann, K. IgA antibody production by intrarectal immunization of mice using recombinant major capsid protein of hamster polyomavirus. Eur J Microbiol Immunol. 2 (3), 231-238 (2012).
- Listek, M., Micheel, B., Hanack, K. Biomoleküle freisetzende zelle und deren selektion mittels eines oberflächenproteins. neweramabs GmbH. , PCT/DE2014/000205 (2014).
