Introduction
Die Hybridom - Technologie in diesem Protokoll vorgestellt wurde zuerst von Köhler und Milstein 1 1975 beschrieben und mit Ausnahme von einigen technischen Verbesserungen hat die Hauptprozedur nicht dramatisch während der letzten 40 Jahre 2 geändert. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine geeignetere Immunisierungsstrategie, eine Standardmethode zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern, und ein Beispiel für eine Validierungsmethode (ELISA) zu erklären.
Antikörper sind unglaubliche Werkzeuge und tragen zu einer breiten Palette von technologischen Ansätzen, wie Durchflusszytometrie, magnetische Zellsortierung oder Immun sowie zu diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten für die Überwachung der Krankheiten und Behandlung 3. Die kommerzielle Verfügbarkeit von monoklonalen Antikörpern für die gewünschten Ziele wird durch die Anwesenheit von mehr als 24 verschiedenen Web - Datenbanken mit fast unzähligen Mengen von Antikörpern oder Antikörper-verwandte Produkte 4 gezeigt. Im Jahr 2015 einntibody Moleküle waren Teil einer internationalen Diskussion 5-7 aufgrund schwerwiegender Probleme in der richtigen Validierung und Charakterisierung von im Handel erhältlichen Antikörpern.
Es kann schwierig und teuer sein, um spezifische Antikörper für eine gezielte Antigen zu finden, und oft haben sie nicht die Affinität oder Spezifität benötigt. Obwohl einen Antikörper zu erzeugen ist immer noch zeitaufwendig und erfordert qualifiziertes Personal um den Antikörper zu entwickeln und zu validieren, einen Antikörper einzeln produzieren könnte besser als ein Kauf.
Aufgrund der Tatsache, dass die Antikörperproduktion ist zeitaufwendig und erfordert Erfahrung, alternative Verfahren zur Herstellung von Bindungsmolekülen wurden entwickelt, um diese Probleme zu überwinden. Die am häufigsten verwendete alternative Methode ist die rekombinante Herstellung von einkettigen Antikörpern mittels Phagen-Display. Die Gene für die variable Bindungsregion aus Zellen und in Kombination mit dem Beschichtungsprotein eines Phagen extrahiert. Die single Kette wird dann auf der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert und in mehreren Schritten Panning 8 gescreent. Die Herstellung von Einzelketten-Antikörper ist ein bisschen schneller, aber es erfordert auch ein erfahrener Experimentator. Die Nachteile einiger rekombinanter Einketten-Antikörper sind schlechte Stabilität und fehlende Eignung für die in vitro Diagnostik. In den meisten diagnostischen Tests, ein Fc-Rezeptor für die Detektion erforderlich ist, die anschließend zu einem rekombinanten Einketten-Antikörper zugegeben werden muss. Auch dies ist zeitaufwendig und sogar noch komplexer ist als die Hybridom-Technik. In In - vitro - Diagnostik, wurden in voller Länge monoklonalen Maus und Kaninchen - Antikörper zeigte die beste Wahl zu sein.
Einer der wichtigsten Schritte in der Herstellung monoklonaler Antikörper erzeugen, muss getan werden, bevor die Arbeit im Labor beginnt: das Design der Immunkonjugat. Fragen, die gelöst werden müssen, sind: Was ist die physikalische Zusammensetzung des Targets in der letzten applicat istIon, und die Matrizen vorhanden sind? Welche Konzentration wird das Ziel in der Anwendung? Was ist die letzte Anwendung, und was sind die Voraussetzungen, dass der Antikörper erfüllen muss?
immer berücksichtigen, dass, wenn ein lineares Peptidfragment verwendet wird, ist es auch in der endgültigen Epitop in der Zielwahl linear zu sein hat; andernfalls, binden die Antikörper nicht. Natürlich unabhängig von der Durchmusterungsverfahren, unterschiedliche antigenische Formate in verschiedenen Anwendungen zu erkennen Antikörper könnten ausgewählt werden, aber dies muss sehr genau überprüft werden. Dies sind die Gründe, warum der Antikörperentwicklung und Validierung sind solche ehrgeizigen Prozesse.
Die Wahl des Antigen-Format für die Immunisierung ist von grundlegender Bedeutung für die Entwicklung von Antikörpern und bestimmt den Erfolg oder das Scheitern dieses Prozesses. Nachdem die Mäuse einen entsprechenden Antikörpertiter exprimieren, werden die Milzzellen isoliert und mit Myelomzellen fusioniert. Die am häufigsten verwendeten Myelom-Zelllinienmurinen monoklonalen Antikörper Entwicklung sind X63-Ag 8.653 9 und Sp2 / 0-Ag 14 10 von einer Balb / c - Maus - Stamm. Die Zellen stammen von einem bösartigen B-Zell-Lymphom und wurden ausgewählt, weil sie alle ihre eigenen schweren oder leichten Ketten nicht absondern. 1 (Splenozyten gegen Myelomzellen): Die Zellen können zwischen 1:10 und 10 bis zu einem Verhältnis angepasst werden. 1 und verschmolzenen durch Polyethylenglykol (PEG) und Elektrofusion , gemäß Stoicheva und Hui 11: In diesem Protokoll wurden die Zellen in einem Verhältnis von 3 angepasst.
Die Fusion von B-Zellen und Myelomzellen ist ein Zufallsprozess. Daher Hybride von zwei B-Lymphozyten oder zwei Myelomzellen könnten erzeugt werden, aber diejenigen Hybride würde nicht für eine lange Zeit in Kultur überleben können. Die Zellen werden einer Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT) Auswahl, nach dem nur fusionierten Hybridomzellen aufgrund der Möglichkeit der Verwendung der de novo - Weg der Pyrimidinsynthese überleben kann. Für die Erzeugung von monoclonal Antikörper ist es notwendig, eine Zelllinie Ursprung von einer Mutterzelle zu erhalten. Die Monoklonalität wird sichergestellt durch die Verdünnungstechniken begrenzen und die mikroskopische Analyse des Zellwachstums. Die Hybridom-Kulturüberstände werden auf spezifische Antikörperproduktion, meist durch ELISA gescreent oder Durchflusszytometrie, und die besten Bindemittel ausgewählt. Nach der Massenkultur und Reinigung kann schließlich das Antikörpermolekül charakterisiert und für die gewünschte Anwendung validiert werden.
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Protocol
Balb / c oder NMRI - Mäuse (Mus musculus) aus unserer Brutkolonie an der Universität Potsdam (Potsdam, Deutschland) wurden für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet. Das Tier Arbeit wurde nach den einschlägigen nationalen und internationalen Richtlinien durchgeführt. Die Studie wurde von dem Brandenburger Ministerium für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz (Referenznummer V3-2347-A16-4-2012) zugelassen.
1. Herstellung von Immunkonjugaten
- Zur Kopplung des Antigens an einen Träger, verwenden Standard - Kopplungsprotokolle über amino-, Carboxy- oder Sulfo-Gruppen, wie zum Beispiel durch Glutaraldehyd, N - (3-dimethylaminopropyl) - N -ethylcarbodiimide (EDC) oder N - [y-Maleimidobutyryloxy ] succinimidester (sulfo-GMBS).
- Zur Kopplung (beispielsweise mit Glutaraldehyd) 13 verwenden , das Zielprotein oder Peptid und dem Träger (Ovalbumin, Rinderserumalbumin oder keyhole limpet hemocyanin) in einem 1: 1 - Verhältnis. Verdünnen Sie die Ziel protein oder Peptid in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und das Trägerprotein in 50 mM NaHCO 3 -Puffer. Passen Sie die Lautstärke und die Konzentration auf die Menge, die für Immunisierungen.
- Das Vermischen der beiden Lösungen und fügen 1,25% Glutaraldehyd. Mischen und Inkubation der Probe für 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT). Um die Hybridomzellen wählen, machen den gleichen Immunkonjugat, aber mit einem anderen Träger, um die Auswahl von unspezifischen Träger Bindemittel zu vermeiden.
- Dialysiere die Kupplung Probe durch eine schnelle Dialyse mit kommerziellen groben Harz durchführen (zB Sephadex G25).
- Perforieren den Boden einer 1,5-ml-Reaktionsgefäß mit einer Hohlnadel und legen Sie sie in einem Rohr 15 mL. Setzen Glaswolle in den Boden zum Abdichten und decken Sie es mit 300 mg groben Harz (bis zur Eichmarke von 0,5 ml).
- Vorsichtig setzen 1 ml PBS tropfenweise in einem Reaktionsröhrchen 1,5 ml und stellen Sie sicher, dass die Glaswolle noch die Perforation dichtet. Lassen Sie das Grob Harz sgut und Zentrifuge die Säule bei 500 × g für 2 min. Eine solche Säule kann verwendet werden, 200 & mgr; l des Kopplungsprobe dialysieren. Für größere Mengen, mehr Spalten machen.
- Ändern Sie den Schlauch und legen Sie die Kupplungslösung auf den gequollenen groben Harz. Zentrifuge wieder bei 500 × g für 2 min. Entfernen Sie das Eluens aus der Tube und verwenden Sie es für die Immunisierung.
2. Immunisierung von Tieren
- Wählen zwei oder drei 6- bis 12 Wochen alte Balb / c-Mäuse für die Immunisierung.
- Für ein Tier, bereiten 150-200 ug des Immunkonjugat in 200 ul PBS und mischen Sie es mit 100 & mgr; l der vollständigen Freund's Adjuvans (CFA). Mischen Sie die Lösung 3 mal mit einem kurzen und dünnen Nadel (0,6 mm Durchmesser) auf einer 1-ml-Spritze. Injizieren Sie die Lösung intraperitoneal in die Maus.
- Geben Sie eine Booster-Injektion 6 Wochen später mit der gleichen Menge der Immunkonjugat, aber ohne CFA. Nehmen Sie Blut 7 Tage später zurück (aus dem retroorbitalen Sinus) und prepare Serum durch das Blut inkubiert wird für 3 bis 4 Stunden bei Raumtemperatur (RT).
- Zentrifugieren der Mischung bei 3000 × g für 5 min. Nehmen Sie die Serumüberstand und gibt sie in eine neue Röhre. Bewahren Sie es bei -20 ° C. Entsorgen Sie das Pellet.
- Analysieren Sie den Seren über ELISA, wie in Schritt 3 beschrieben Für Fusion, wählen Sie die Maus mit dem höchsten Serumtiter.
- In der Vorbereitung für die Zellfusion, erhöhen Sie die Maus mit 150-200 ug des Immunkonjugat in 300 & mgr; l PBS ohne Adjuvans nur 4 Tage vor der Fusion.
3. ELISA
- Bereiten Sie eine Antigen-Lösung mit einer Konzentration von 5 ug / ml in PBS und Transfer 50 ul in jedes ELISA Vertiefung einer 96-Well-Platte.
- Inkubieren der Platte für 2 h bei 37 ° C oder über Nacht bei 4 ° C in einer feuchten Kammer.
- Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser. Blockieren die Vertiefungen mit 80 ul PBS / 5% Neugeborenenkälberserum (NCS) pro Vertiefung für 1 h bei RT in einer feuchten chBernstein. Bereiten Sie die Serumverdünnungen in einem 1: 5-Serie mit 01.50 beginnen. Für die Analyse der Zellkultur, verwenden Sie den unverdünnten Kulturüberstand.
- Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser. Je 50 ul der Probe pro Vertiefung und in einer feuchten Kammer für 1 h bei RT inkubiert. Vorbereiten des sekundären Antikörperlösung in einer 1: 5000-Verdünnung eines Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP).
- Waschen Sie die Platte 3-mal mit Leitungswasser und 50 & mgr; l des sekundären Antikörperlösung pro Vertiefung. Inkubieren für 45 min bei RT in einer feuchten Kammer.
- Eine frische Substratlösung. Machen Stammlösungen von 0,1 M NaH 2 PO 4 und 0,1% Wasserstoffperoxid. Nehmen Sie 5 Teile NaH 2 PO 4, 4 Teile Wasserstoffperoxid und 1 Teil Tetramethylbenzidin für die frische Substratlösung.
- Waschen Sie die Platte 10-mal mit Leitungswasser. Je 50 ml frisches Substratlösung in die Vertiefungen und Inkubation 5 - 10 min in derdunkel.
- Stoppen Sie die Reaktion mit 50 & mgr; l 1 MH 2 SO 4 pro Vertiefung. Mit Hilfe eines Plattenlesegerät, messen die optische Dichte bei 450 nm mit einer Referenzwellenlänge von 630 nm.
4. Herstellung von Zellkulturen Myeloma
- Von nun an führen alle Arbeiten unter sterilen Bedingungen.
- Bereiten Sie ein frisches Kulturmedium für die Zellkultivierung. Supplement 500 ml RPMI1640 mit 10% fötalem Kälberserum (50 ml), 2 mM L-Glutamin (5 ml) und 50 uM Mercaptoethanol (5 ml). Ersetzen Sie den Glutamin alle 7 Tage.
- Tauen Sie ein Fläschchen mit murinen SP2 / 0-Zellen in warmem Wasser. Übertragung der Zelllösung in 10 ml frisches Kulturmedium und zentrifugieren für 10 min bei 200 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 1 ml frischem Kulturmedium.
- Übertragen , um die Zellen in einem 25 cm 2 -Kolben und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator. Erweitern Sie die Zellen auf zwei 75-m 2 Flaschen befErz-Fusion. Konservieren Aliquots für die Langzeitlagerung, wie in Schritt 7 beschrieben.
5. Herstellung von Feeder-Zellen
- Opfere eine 12 Wochen alte NMRI Maus (nach nationalen und institutionellen Richtlinien, zB durch CO 2 Inhalation). Entfernen Sie das Fell und reinigen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
- Injizieren von 5 ml eiskaltem RPMI-Medium in den Bauch massieren den Bauch mit einer Pinzette und absaugen Feeder-Zellsuspension. Legen Sie die Zellen in einem leeren 50-ml-Röhrchen. Führen Sie diesen Schritt noch einmal. 7 bis 10 ml der Zellsuspension feeder sollte abgerufen werden.
- Bereiten einen 100 ml-Feeder-Zellsuspension durch Zugabe von 90 mL Vollzellkulturmedium (RPMI 1640, 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 uM Mercaptoethanol). Mischen Sie es und dann 100 & mgr; l / Vertiefung in 10 x 96-Well-Zellkulturplatten. Inkubieren der Platten über Nacht bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator.
6. Zellfusion
- Sacrifice der immunisierten Maus durch Genickbruch oder CO 2 Inhalation und auszuschneiden die Milz 14. Nehmen zusätzliche Blut aus dem Herzen und bereiten die Serum, wie in Schritt 2.3 als Positivkontrolle im ELISA beschrieben.
- Bereiten Sie eine Milz-Zellsuspension durch die Milz durch eine Zelle Sieb drücken. Füllen Sie bis zu 20 ml mit Vollzellkulturmedium. Ernte der Zellen in 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C). Überstand verwerfen.
- Spülen der Zellkulturflasche und Ernte der myeloma Zellen durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C) und den Überstand zu verwerfen.
- Resuspension der Zellpellets in 20 ml balanced salt Puffer (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl 2, 2,5 mM MgCl 2 und 5 mM Tris-HCl; pH 7,4) und erneut zentrifugieren. Wiederholen der Waschschritte dreimal.
- Zur Einstellung des Splenozyten-: Myelom-Zellverhältnis, zählen die Zellen nach dem zweiten Waschschritt durch Tannest Resuspendieren des Pellets in 1 ml BSS-Puffer. Machen Sie eine Verdünnung von 1:10 und Transfer 10 ul in eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie die Zellen und bestimmen die Zellkonzentration in 1 ml.
- Stellen Sie die Zellzahlen in den BSS-Puffer bis drei Teilen Splenozyten und einteiliger Myelomzellen in einem 1 ml Endvolumen. Nehmen Sie 200 ul der Zellsuspension und mischen Sie es mit 200 ul PEG8000 (1 g in 4 ml BSS-Puffer). Übertragen Sie die 400 & mgr; l in eine Elektroporationsküvette mit einem Durchmesser von 2 mm und stellen Sie den Puls (600-650 V und 25 ms).
- Nach dem Puls der Zellen bei RT für 3 min in der Küvette inkubiert. Entfernen Sie die Zellen und legte sie tropfenweise in einen Erlenmeyerkolben mit 100 ml HAT-Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM Glutamin, 50 uM Mercaptoethanol, 100 uM Hypoxanthin, 5,8 uM Azaserin und 16 uM Thymidin).
- Wiederholen Sie die Fusion 4-mal, bis die 1-ml-Charge ausgegeben wird. Inkubieren den Erlenmeyerkolben für 3 h bei 37 ° C und 5% CO 2in einem Inkubator.
- Ergänzen Sie die Zellsuspension erneut mit Hypoxanthin, Azaserin und Thymidin, bevor sie die Zellen auf den Feeder-Layer-Beschichtung. Füge 100 & mgr; l der Zellsuspension pro Vertiefung auf die Feeder - Schicht - Platten und Inkubation der Platten bei 37 ° C und 5% CO 2 (in einem Inkubator). Die endgültige Konzentration innerhalb des Bohrlochs sollte 100 uM Hypoxanthin, 5,8 uM Azaserin und 16 uM Thymidin sein.
- Durchführen einer mikroskopischen Untersuchung (Vergrßerung: 10fach Objektivlinse, 10X Okular) für klonale Wachstum in jeder Vertiefung der Platte nach 7 Tagen, um zu bestimmen, ob die Vertiefungen mono- oder polyklonalen sind. Monoklonale Zellen sind eine Gruppe von Zellen, die aus einer einzigen Zelle stammen. Polyklonalen Zellen sind mehrere Cluster von Zellen in einem gut. Ändern Sie den kompletten Medien nach 7 Tagen und Inkubation wieder für 7 Tage im HAT-Medium.
- Ändern Sie das HAT-Medium und pflegen die Zellen in Vollzellkulturmedium. Verwenden Sie den Überstand eine E auszuführenLISA, wie in Schritt 3. Positive Hybridomzellen beschrieben müssen in 24-Well-Platten expandiert werden nach den Tests für die Produktion von spezifischen Antikörpern. Wenn die Zellen polyklonal sind, hat eine begrenzte Verdünnung durchgeführt werden (beschrieben in Stufe 8).
7. Kryokonservierung von Hybridome
- Cryoconserve positive mono- und polyklonalen Hybridome für die Langzeitlagerung. Ernte der Zellen aus einer 24-Well-Platte mit einer Konfluenz von> 60% durch Zentrifugation (200 xg, 10 min und 4 ° C).
- Das Pellet in 500 & mgr; l Vollzellkulturmedien und gibt sie in eine Kryoröhrchen. In 500 & mgr; l Gefriermedium (RPMI 1640, 20% FCS und 15% Dimethylsulfoxid), mischen Sie es und steckte es in eine Styropor-Box oder einem speziellen Gefrierkasten. Bei -80 ° C für 3 Tage. Nach 3 Tagen kann die Kryoröhrchen für langfristige Lagerung in flüssigen Stickstoff überführt werden.
8. Begrenzung Verdünnung von polyklonalen Hybridome
- Makea feeder layer Kultur, wie 5. Ernte positive polyklonale Zellen in Schritt beschrieben ist, wie in Schritt 7.1 beschrieben. Zählen Sie die Zellen, wie in Schritt 6.5, und stellen Sie die Zellzahl auf 10 Zellen / ml, mit einem Endvolumen von 10 ml für eine 96-Well-Platte. 100 l / Vertiefung auf die Feeder-Schicht.
- Inkubieren für 7 Tage bei 37 ° C und analysieren die Klonwachstum mikroskopisch (Vergrößerung: 10x Objektivlinse, 10x Okular). Machen Sie einen ELISA von dem Kulturüberstand, wie in Schritt 3 beschrieben, und identifizieren die geeigneten monoklonalen Hybridome für die Massenkultur.
9. Massenkultur und Aufreinigung von monoklonalen Antikörpern
- Übertragung der monoklonalen Hybridome mit den entsprechenden ELISA - Signale bis 25 cm 2 oder 75 cm 2 -Kolben und sammeln , um 500 ml des Kulturüberstand auf. Testen Sie die Kultur wöchentlich für spezifische Antikörperproduktion und zur Erhaltung 3-5 Aliquots pro Hybridom für die Langzeitlagerung, wie in Schritt 7 beschrieben.
- Bereiten Sie eine Protein - A - Säule durch Waschen mit Waschpuffer (verdünnt den Bindungspuffer 1: 3 in dH 2 O). Führen Sie den Überstand von Schritt 9.2 über die Säule und sammeln den Durchfluss. Eluieren des gebundenen Antikörpers mit 0,1 M Citrat, pH 3,5, und neutralisiert den pH-Wert sofort mit 500 ul Tris-HCl, pH 9,0.
- Charakterisieren der eluierten Antikörper durch SDS-PAGE, Western Blot und ELISA, und bestätigen Sie für die endgültige Anwendung.
- Für die SDS-PAGE, nehmen Sie 3 bis 5 ug gereinigte Antikörperlösung pro Spur (eine 20-ul-Probe), 5 ul 4x SDS-Probenladepuffer hinzufügen (8% SDS, 20% 2-Mercaptoethanol, 40% Glycerin und 0,015 % Bromphenol, reduziert) und erhitzt die Sonden bei 95 ° C für 5 min. Als Kontrolle verwenden die gleiche Probe mit einer gereinigten antibody des gleichen Isotyps, aber irrelevanter Spezifität.
- Legen Sie die Proben auf einem 12,5% SDS-Gel, legen 5 ul einer ungefärbten Protein Leiter in einer zusätzlichen Spur, und trennen Sie diese durch Elektrophorese. Stain das Gel mit Coomassie Brilliant Blue und dokumentieren die Ergebnisse. Eine grundlegende SDS - Protokoll wurde im Jahr 1970 15 von Laemmli etabliert.
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Representative Results
1 zeigt ein Beispiel für den Antigen-spezifischen Serumtiter für eine Immunisierung im Labor durchgeführt. 5.000.000 im Vergleich zu einem Serum eines naiven Maus: In dieser Figur wurden die Immunseren A und B von 1:50 bis 1 titriert. Das Antigen wurde auf der festen Phase beschichtet ist, und die spezifischen Antikörper wurden mit einem POD-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Ig-Antikörper nachgewiesen. Beide Seren der immunisierten Mäuse zeigten eine signifikant höhere Antigen-spezifischen Titer im Vergleich zu der naiven Maus. Das Signal bei einer Verdünnung von 1: 5000 reicht aus, um den nächsten Schritt zu bewegen, die der Zellfusion.
Das Wachstum der Hybridome sichtbar war nach 7 bis 10 Tagen nach der HAT - Selektion durch die Entwicklung von Zellklonen, wie in Abbildung 2 dargestellt. Das Bild wurde von einem 96-Well-Platte entnommen 10 Tage nach der Fusion. Die Zellklone und der aminopterinemono- oder Polyklonalität der Wellswurden durch einzelne mikroskopische Analysen (: 10fach Objektiv, 10x Okular Vergrößerung) überwacht. Monoklonale Vertiefungen wurden mit einem Punkt auf der Oberseite der Platte markiert. Wenn die Platten in ELISA, antigenspezifische Signale von monoklonalen Hybridome getestet wurden, leicht identifiziert werden. Positive Hybridom-Kulturen wurden rekloniert, expandiert und kryokonserviert, bis die Kultur war monoklonaler, stabil und antigenspezifisch. Der Kulturüberstand wurde während der Zeit der Kultivierung gesammelt, um die erzeugten monoklonalen Antikörper über Protein A-vermittelter Affinitätschromatographie zu reinigen. Figur 3 zeigt eine Standard Elutionsprofil eines monoklonalen Antikörpers mit einem IgG1 - Isotyp.
Gereinigte monoklonale Antikörper wurden weiter durch eine SDS PAGE charakterisiert, wie in 4 gezeigt. Bei 50 und 25 kDa wurden die schweren und leichten Ketten deutlich sichtbar, was die Reinigung eines Antikörpermoleküls. Lane 2 showed einen Kontroll-Antikörper mit dem gleichen Isotyp.
Abbildung 1: Serum Titration nach der Immunisierung. 5,000,000 und getestet für die Antigenspezifität mittels ELISA: Die Seren von zwei Mäuse wurden in Verdünnungen von 1:50 bis 1 titriert. Als Kontrollserum einer nicht-immunisierten Maus wurde in einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Die Antigen-spezifische Signale waren positiv für beide immunisierten Mäuse und die Splenozyten der Maus A wurden Hybridom Generation verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Fotografien von Mono- und polyklonalen Hybridome. Mono- und polyklonalen hybridomas wurden mikroskopisch 10 Tage nach der Zellfusion untersucht. Die Bilder zeigen das herkömmliche Resultat für stabile Hybridomzellinien mit monoklonalen (A) und polyklonalen (B) Eigenschaften. Ein Maßstab: 10 & mgr; m; B Maßstab: 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Standard Elutionsprofil für einen monoklonalen Antikörper mit einem IgG1 Isotyp. Der erzeugte monoklonale Antikörper wurde mittels Protein A-vermittelter Affinitätschromatographie gereinigt, und das Elutionsprofil eines IgG1-Antikörpers ist in der Abbildung dargestellt. Der erste Peak zeigt die eluierte monoklonale Antikörper-Molekül bei pH 5,0. Die folgenden Spitzen zeigen, pH 3,5 und pH 2,0. Der pH-Reduktion ist notwendig,vollständig die Säule aller Substanzen reinigen und die Säulenmatrix für die nächsten purifications zu regenerieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Standard SDS PAGE für einen monoklonalen Antikörper mit einem IgG1 Isotyp. Die Reinheit des Antikörpers Eluent wurde durch eine Coomassie-gefärbte SDS-PAGE bestimmt. 5 ug der Antikörperlösung wurden L2 angelegt und unter reduzierenden Bedingungen auf 5 & mgr; g eines Standard-IgG1-Antikörper in L3 verglichen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern von Hybridoma-Technologie erfordert eine intensive und ausführliche Epitop-Analyse, insbesondere im Hinblick auf die endgültige Anwendung, wenn der Antikörper das Ziel erkennen sollte. Dies wird oft von den Benutzern unterschätzt und führt zu Antikörpern mit schwachen Leistungen. Der Fusionsprozess ist immer zufällig, was bedeutet, dass das Ergebnis der spezifischen Hybridomen auf das Zellverhältnis in hohem Maße abhängig ist und die Vitalität an dieser Stelle. Nach limited dilution sind die Zellen sehr instabil und erfordern strenge Kontrolle des Zellwachstums und der Antikörperproduktion. Diese Parameter sollten sorgfältig analysiert werden, wenn das Verfahren zur Fehlerbehebung.
Weitere Einschränkungen der Technik umfassen die benötigte Zeit für die Zelllinie Erzeugung und die Auswahl der gewünschten Antikörper-produzierenden Zelle. Aufgrund der tetraploiden Chromosomensatz nach der Fusion sind die Zellen sehr instabil und danach die Menge reduzieren wieder haploid. Das könnteführen zu dem Verlust von Antikörper-Genen, die Zellen veranlassen, keine Antikörper mehr erzeugen. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Auswahl der gewünschten Antikörper-produzierenden Zellen auf der Kulturüberstand beruht und nicht auf den gereinigten Antikörperlösungen. Daher wird eine endgültige Charakterisierung des Antikörpers ist, in den meisten Fällen nur nach Massenkultur des ausgewählten Hybridom-Klon. Somit ist die Gefahr der Antikörper nicht in der Lage ist, in der Endanwendung zu arbeiten, ist sehr hoch.
Mehrere technologische Änderungen, wie zum Beispiel Laser-fähigen Analyse und Verfahrenstechnik (LEAP) 16, Affinitätsabfang-Oberflächen - Display (ACSD) 17 oder Gel - Mikrotropfen - Technologie 18 wurden beschrieben , um die Nachteile bei der Auswahl geeigneter Antikörper zu umgehen. Alle diese Methoden sind in der Lage verschiedene Aspekte der Hybridom Generierung und Selektion zu verbessern, aber die meisten von ihnen erfordern teure Ausrüstung oder Optimierung für jede einzelne Zelle line 16.
Eine weitere Verbesserung oder Modifikation, die in unserem Labor entwickelt wurde , ist eine neue Impfstrategie mit chimären Virusähnliche Partikel (VLPs), wie in 19 Messerschmidt et al. Die Partikel können an der Oberfläche dieser Teilchen in dem viralen Mantel-Struktur und präsentiert eingebettet durch die gewünschten Epitop-Sequenzen modifiziert werden. Dies führt zu sehr schnellen und spezifischen Immunisierung nach 4 Wochen in den entsprechenden Tieren. Die erzeugten monoklonalen Antikörper haben IgG2 oder IgG1-Isotypen und sind abhängig von der Auswahl Epitop hochspezifisch für das native Antigen. Wir entwickelten auch einen bestimmten Selektionsschritt für Hybridomzellen durch künstliche Zelloberflächenmarker verwendet wird. Die verwendeten transgenen Myelomzellen zeigen eine stabil eingeführt Oberflächenmarker. Diese Oberflächenmarker können verwendet werden, um Antigen- oder Isotyp-spezifisch Hybridomzellen direkt nach der Fusion zu sortieren, ohne die limitierende Verdünnung und ohne übermäßige ELISA-Screening,wie eigentlich notwendig in herkömmlichen Hybridomtechnik 20.
Wie oben erwähnt, gibt es einige vielversprechende Alternativen in monoklonalen Antikörpern, die in der Zukunft, die Handhabung verbessern könnte und die Nachteile der aktuellen Hybridomtechnik reduzieren. Dennoch erfordert das Verfahren immer die detaillierte Identifikation des gewünschten Epitops in Kombination mit einer strengen und sorgfältig Anwendung geplant, so dass der erzeugte monoklonale Antikörper erfolgreich funktioniert. Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern durch Hybridom-Technologie wird ein wichtiger und notwendiger Schritt in der Zukunft aufgrund der enormen Bedarf in der Wissenschaft, Diagnose und Therapie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) | Sigma Aldrich | 39391-10ML | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| ovalbumin | Sigma Aldrich | A5503 | |
| bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A2153 | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| Falcon tubes 15 mL | Biochrom GmbH | P91015 | |
| reaction vials, 1.5 mL | Carl Roth GmbH & C0.KG | CNT2.1 | |
| hollow needle | Carl Roth GmbH & C0.KG | C724.1 | |
| glass wool | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6574.1 | |
| Sephadex G25 coarse | Sigma Aldrich | GE-17-0034-02 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | F5881-10ML | |
| ELISA plates, 96 well | Greiner bio-one | 655101 | |
| neonatal calf serum | Biochrom GmbH | S1025 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 | |
| Pipette tips 200 µL | Greiner bio-one | 739291 | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | Dianova | 115-035-003 | |
| tetramethylbenzidine | Carl Roth GmbH & C0.KG | 6350.2 | |
| Natriumdihydrogenphosphat | Carl Roth GmbH & C0.KG | K300.2 | |
| peroxide/urea | |||
| sulphuric acid | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4623.3 | |
| RPMI 1640 | Life technologies GmbH | 31870074 | |
| L-glutamine | Carl Roth GmbH & C0.KG | HN08.2 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| TC-flask 25 cm2 | Peske GmbH | 86-V025 | |
| TC-flask 75 cm2 | Peske GmbH | 86-V075 | |
| ethanol, 96% | Carl Roth GmbH & C0.KG | P075.1 | |
| cell strainer | VWR international | 734-0002 | |
| Falcon tubes 50 mL | Biochrom GmbH | P91050 | |
| PEG 8000 | Sigma Aldrich | 1546605 | |
| electroporation cuvette, 2 mm | Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. | EKL2,25 | |
| hypoxanthine | Sigma Aldrich | H9636-25G | |
| azaserine | Sigma Aldrich | A4142 | |
| thymidine | USB Europa GmbH | 22305 1 GM | |
| TC-plates 96 well | Biochrom GmbH | P92696 | |
| TC-plates 24 well | Biochrom GmbH | P92424 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| dimethylsulfoxide | Carl Roth GmbH & C0.KG | 4720.1 | |
| protein A sepharose | Sigma Aldrich | P3391-1G | |
| SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 | Carl Roth GmbH & C0.KG | K929.1 | |
| unstained protein ladder | BioRad Laboratories | 161-0363 | |
| comassie brilliant blue R-250 | BioRad Laboratories | 161-0406 |
References
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