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Immunology and Infection

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Published: January 2, 2017 doi: 10.3791/54832

Introduction

Il IBRIDOMA presentato in questo protocollo è stato descritto da Köhler e Milstein 1 nel 1975 e, ad eccezione di alcuni miglioramenti tecnici, la procedura principale non è cambiata radicalmente nel corso degli ultimi 40 anni 2. Lo scopo di questo protocollo è quello di spiegare una strategia più appropriata di immunizzazione, un metodo standard per la generazione di anticorpi monoclonali, e un esempio di un metodo di convalida (ELISA).

Gli anticorpi sono strumenti incredibili e contribuiscono ad una vasta gamma di approcci tecnologici, come la citometria a flusso, l'ordinamento delle cellule magnetiche, o immunofluorescenza, nonché alle opzioni diagnostiche e terapeutiche per il monitoraggio e il trattamento della malattia 3. La disponibilità commerciale di anticorpi monoclonali per il target desiderato è dimostrata dalla presenza di oltre 24 diversi database web con quasi innumerevoli quantità di anticorpi o prodotti anticorpi legati 4. Nel 2015, unmolecole ntibody facevano parte di un dibattito internazionale 5-7 a causa di seri problemi in una corretta validazione e caratterizzazione di anticorpi disponibili in commercio.

Può essere difficile e costoso trovare anticorpi specifici per un antigene bersaglio, e spesso, non hanno affinità o la specificità necessaria. Sebbene generando un anticorpo è ancora tempo e richiede personale specializzato per sviluppare e convalidare l'anticorpo, producendo un anticorpo singolarmente potrebbe meglio di acquistare uno.

A causa del fatto che la produzione di anticorpi richiede tempo e richiede esperienza, metodi alternativi per la produzione di molecole di legame sono state sviluppate per superare questi problemi. Il metodo alternativo più comunemente usato è la produzione ricombinante di anticorpi a catena singola con phage display. I geni per la regione di legame variabile vengono estratti dalle cellule e combinati con la proteina di rivestimento di un fago. i scatena ingle viene espresso sulla superficie di un batteriofago e proiettato in diversi passaggi panning 8. La produzione di anticorpi a catena singola è un po 'più veloce, ma richiede anche un abile sperimentatore. Gli svantaggi di alcuni anticorpi a catena singola ricombinanti sono scarsa stabilità e la mancanza di idoneità della diagnostica in vitro. Nella maggior parte dei test diagnostici, un Fc-recettore per il rilevamento è necessario, che deve essere aggiunto ad un anticorpo a catena singola ricombinante dopo. Di nuovo, questo richiede tempo e ancora più complessa rispetto alla tecnica ibridoma. Nella diagnostica in vitro, full-length monoclonale di topo e di coniglio anticorpi sono stati dimostrato di essere la scelta migliore.

Uno dei principali passi nella generazione di anticorpi monoclonali deve essere fatto prima che il lavoro in laboratorio inizia: il disegno del immunoconiugato. Le domande che devono essere affrontate sono: Qual è la composizione fisica del bersaglio nella Applicat finaleione, e le cui matrici sono presenti? Quale concentrazione target avere nella domanda? Qual è l'applicazione finale, e quali sono i requisiti che l'anticorpo deve soddisfare?

Sempre tener conto che se viene usato un frammento peptidico lineare, deve anche essere lineare nel epitopo finale nella destinazione di scelta; altrimenti, l'anticorpo non si legherà. Naturalmente, indipendentemente dal metodo di screening, anticorpi potrebbero essere selezionati per riconoscere diversi formati antigenici in diverse applicazioni, ma devono essere convalidati molto preciso. Queste sono le ragioni per le quali lo sviluppo di anticorpi e la convalida sono tali processi ambiziosi.

La scelta del formato antigenica per l'immunizzazione è fondamentale per lo sviluppo di anticorpi e determina il successo o il fallimento di questo processo. Una volta che i topi esprimono un rilevante titolo anticorpale, le cellule di milza sono isolati e fusi con cellule di mieloma. Le linee cellulari di mieloma più comunimurino lo sviluppo di anticorpi monoclonali sono X63-Ag 8,653 9 e Sp2 / 0-Ag 14 10 da una / c ceppo di topi Balb. Le cellule discendono da un linfoma a cellule B maligni e sono stati selezionati perché non secernono qualsiasi delle loro catene pesanti e leggere. Le cellule possono essere adattati ad un rapporto compreso tra 1:10 e 10: 1 (splenociti contro cellule di mieloma). In questo protocollo, le cellule sono state adattate ad un rapporto di 3: 1 e fuse da polietilenglicole (PEG) e elettrofusione, secondo Stoicheva e Hui 11.

La fusione di cellule B e cellule di mieloma è un processo casuale. Pertanto, ibridi di due B linfociti o due cellule di mieloma potrebbero essere generati, ma questi ibridi non sarebbero in grado di sopravvivere per un lungo tempo di coltura. Le cellule subiscono una selezione ipoxantina, aminopterina e timidina (HAT), per cui solo le cellule di ibridoma fuse possono sopravvivere grazie alla possibilità di utilizzare il percorso de novo di sintesi delle pirimidine. Per la generazione di monanticorpi oclonal, è necessario ottenere una linea cellulare proveniente da una cellula madre. Il monoclonalità è garantita limitando le tecniche di diluizione e l'analisi microscopica della crescita cellulare. I sovranatanti di ibridoma sono proiettati per la produzione di anticorpi specifici, per lo più da ELISA o citometria a flusso, e le migliori leganti sono selezionati. Dopo cultura di massa e la purificazione, la molecola anticorpo può infine essere caratterizzata e convalidato per l'applicazione desiderata.

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Protocol

Balb / c o topi NMRI (Mus musculus) dalla nostra colonia riproduttiva presso l'Università di Potsdam (Potsdam, Germania) sono stati utilizzati per la produzione di anticorpi monoclonali. Il lavoro animale è stato condotto in base alle pertinenti linee guida nazionali ed internazionali. Lo studio è stato approvato dal Ministero del Brandeburgo Ambiente, salute e protezione dei consumatori (numero di riferimento V3-2347-A16-4-2012).

1. Preparazione di immunoconiugati

  1. Per accoppiare l'antigene ad un vettore, utilizzare protocolli di attacco standard via amino-, carbossilici o sulfo-gruppi, come da glutaraldeide, N - (3-dimetilamminopropil) - N -ethylcarbodiimide (EDC), o N - [y-maleimidobutyryloxy ] succinimmide estere (solfo-GMBS).
  2. Per meccanico (per esempio, con glutaraldeide) 13, utilizzare la proteina bersaglio o peptide e il vettore (ovoalbumina, sieroalbumina bovina, o keyhole limpet hemocyanin) in un rapporto 1: 1. Diluire il pr bersagliootein o peptide in tampone fosfato salino (PBS) e la proteina carrier in 50 mM NaHCO 3 buffer. Adattare il volume e la concentrazione per la quantità necessaria per le vaccinazioni.
    1. Mescolare entrambe le soluzioni e aggiungere 1,25% glutaraldeide. Mescolare e incubare il campione per 4 ore a temperatura ambiente (RT). Per selezionare le cellule di ibridoma, rendere lo stesso immunoconiugato, ma con un altro vettore, al fine di evitare la selezione di leganti carrier aspecifiche.
  3. Dializzare campione accoppiamento eseguendo una dialisi veloce con resina commerciale grossolana (ad esempio, Sephadex G25).
    1. Perforare il fondo di una fiala di reazione da 1,5 ml con un ago cavo e collocarlo in una provetta da 15 ml. Mettere lana di vetro nella parte inferiore per sigillare e coprire con 300 mg di resina grossolana (a volume di 0,5 mL).
    2. Con attenzione, mettere 1 ml di PBS goccia a goccia in un tubo di reazione da 1,5 ml e fare in modo che la lana di vetro è ancora sigillando la perforazione. Lasciate che la resina grossolana sbene e centrifugare la colonna a 500 xg per 2 min. Una tale colonna può essere utilizzata per dializzare 200 microlitri del campione accoppiamento. Per i volumi più elevati, rendere più colonne.
    3. Cambiare il tubo e rilasciare la soluzione di accoppiamento sulla resina grossolana gonfiato. Centrifugare nuovamente a 500 xg per 2 min. Rimuovere l'eluente dal tubo e utilizzarlo per l'immunizzazione.

2. immunizzazione degli animali

  1. Scegli due o tre da 6 a 12 settimane di età topi Balb / c per l'immunizzazione.
  2. Per un animale, preparare 150 - 200 ug del immunoconiugato in 200 ml di PBS e mescolare con 100 ml di adiuvante completo Freund's (CFA). Mescolare la soluzione 3 volte con un ago corto e sottile (0,6 mm di diametro) in una siringa da 1 ml. Iniettare la soluzione per via intraperitoneale nel mouse.
  3. Dare un iniezione di richiamo 6 settimane più tardi con la stessa quantità del immunoconiugato, ma senza CFA. Prendere il sangue 7 giorni dopo (fuori del seno retroorbital) e prepare il siero incubando il sangue per 3 - 4 ore a temperatura ambiente (RT).
    1. Centrifugare la miscela a 3.000 xg per 5 min. Prendere il surnatante siero e trasferirlo in un nuovo tubo. Conservarlo a -20 ° C. Eliminare il pellet.
  4. Analizzare i sieri tramite ELISA, come descritto al punto 3. Per la fusione, scegliere il mouse con il più alto titolo di siero.
  5. In preparazione per la fusione delle cellule, aumentare il mouse con 150 - 200 ug del immunoconiugato in 300 ml di PBS senza adiuvante solo 4 giorni prima della fusione.

3. ELISA

  1. Preparare una soluzione di antigene con una concentrazione di 5 mg / ml in PBS e trasferire 50 microlitri in ciascun ELISA pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  2. Incubare la piastra per 2 ore a 37 ° C o per una notte a 4 ° C in una camera umida.
  3. Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto. Bloccare i pozzetti con 80 ml di PBS / 5% di siero di vitello neonatale (NCS) per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente in un ch umidoambra. Preparare le diluizioni di siero in un 1: Serie 5 a partire da 01:50. Per l'analisi della coltura cellulare, usare la cultura surnatante non diluito.
  4. Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto. Pipettare 50 ml del campione per pozzetto e incubare per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umida. Preparare la soluzione di anticorpo secondario in una diluizione 1: 5000 di un anticorpo IgG anti-topo di capra coniugato con perossidasi di rafano (HRP).
  5. Lavare la piastra 3 volte con acqua di rubinetto e aggiungere 50 ml della soluzione di anticorpo secondario per pozzetto. Incubare per 45 minuti a RT in una camera umida.
  6. Preparare una soluzione substrato fresco. Fare soluzioni stock di 0,1 M NaH 2 PO 4 perossido di idrogeno e lo 0,1%. Prendere 5 parti NaH 2 PO 4, 4 parti di perossido di idrogeno, e 1 parte di tetrametilbenzidina per la soluzione substrato fresco.
    1. Lavare la piastra 10 volte con acqua di rubinetto. Pipettare 50 ml di soluzione di substrato fresco nei pozzetti e incubare per 5 - 10 minuti inbuio.
  7. Arrestare la reazione con 50 microlitri 1 MH 2 SO 4 per pozzetto. Utilizzando un lettore di piastre, misurare la densità ottica a 450 nm con una lunghezza d'onda di riferimento a 630 nm.

4. Preparazione del mieloma culture cellulari

  1. D'ora in poi, eseguire tutti i lavori in condizioni sterili.
  2. Preparare il mezzo di coltura fresco per la coltivazione delle cellule. Supplement 500 ml di RPMI1640 con 10% siero fetale di vitello (50 mL), 2 mM L-glutammina (5 mL), e 50 mM mercaptoetanolo (5 mL). Sostituire la glutammina ogni 7 giorni.
  3. Scongelare una fiala di murine SP2 / 0 cellule in acqua tiepida. Trasferire la soluzione di cellule in 10 ml di terreno di coltura fresco e centrifugare per 10 min a 200 x g. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di terreno di coltura fresco.
  4. Trasferire le cellule in 2 beuta da 25 cm e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore. Espandere le cellule a due 75-m 2 palloni BEFla fusione del minerale. Conservare aliquote per la conservazione a lungo termine, come descritto al punto 7.

5. Preparazione di cellule di alimentazione

  1. Sacrifica una 12 settimane di età del mouse NMRI (secondo le linee guida nazionali ed istituzionali, ad esempio, da CO 2 inalazione). Rimuovere la pelliccia e pulire l'addome con il 70% di etanolo.
  2. Iniettare 5 ml di ghiaccio freddo media RPMI nell'addome, massaggiare l'addome con una pinzetta, e aspirare la sospensione cellulare alimentatore. Collocare le cellule in un tubo vuoto a 50 mL. Eseguire questo passaggio ancora una volta. 7 a 10 ml di sospensione cellulare alimentatore devono essere recuperati.
  3. Preparare una sospensione cellulare alimentatore da 100 mL aggiungendo 90 ml di terreno di coltura cellulare completo (RPMI 1640, 10% di siero fetale di vitello, 2 mM glutammina e 50 mM mercaptoetanolo). Mescolare e trasferire 100 l / pozzetto in piastre di coltura cellulare 10 x 96 pozzetti. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C e 5% CO 2 in un incubatore.

6. fusione cellulare

  1. Sacrificare il immunizzato da dislocazione cervicale o di CO 2 inalazione e accise la milza 14. Prendere sangue addizionale dal cuore e preparare il siero, come descritto nel passaggio 2.3, come controllo positivo in ELISA.
  2. Preparare una sospensione di cellule spleniche premendo milza attraverso un colino cella. Riempire fino a 20 ml con mezzo di coltura cellulare completo. Raccogliere le cellule in provette da 50 ml per centrifugazione (200 xg, 10 min, 4 ° C). Eliminare il surnatante.
  3. Risciacquare il pallone di coltura delle cellule e raccogliere le cellule del mieloma per centrifugazione (200 xg, 10 min, e il 4 ° C) e scartare il surnatante.
  4. Risospendere il pellet di cellule in 20 mL di tampone salina bilanciata (BSS) (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl 2, 2.5 mM MgCl 2, e 5 mM Tris-HCl, pH 7.4) e centrifugare di nuovo. Ripetere il lavaggio passi tre volte.
  5. Per la regolazione del splenocyte: rapporto di cellule di mieloma, contare le cellule dopo la seconda fase di lavaggio da abetest risospendere il pellet in 1 ml di tampone BSS. Effettuare una diluizione 1:10 e trasferire 10 microlitri di una camera di conteggio delle cellule. Contare le cellule e determinare la concentrazione cellulare in 1 mL.
  6. Regolare il numero di cellule nel buffer BSS a tre-parti di splenociti e le cellule di mieloma di un pezzo in un volume finale di 1 ml. Prendere 200 microlitri della sospensione cellulare e mescolare con 200 ml di PEG8000 (1 g in 4 mL di tampone BSS). Trasferire 400 microlitri in una cuvetta elettroporazione con un diametro di 2 mm e impostare l'impulso (600 - 650 V e 25 ms).
    1. Dopo l'impulso, incubare le cellule a temperatura ambiente per 3 minuti nella cuvetta. Rimuovere le cellule e metterli goccia a goccia in una beuta con 100 mL di HAT Medium (RPMI 1640, 10% FCS, 2 mM glutammina, 50 mM mercaptoetanolo, 100 pM ipoxantina, 5.8 pM azaserine, e 16 mM di timidina).
    2. Ripetere la fusione 4 volte fino a quando è trascorso il lotto 1-mL. Incubare la beuta per 3 ore a 37 ° C e 5% CO 2in un incubatore.
  7. Supplemento la sospensione cellulare di nuovo con ipoxantina, azaserine, e timidina prima placcatura le cellule sullo strato alimentatore. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare per pozzetto alle piastre feeder layer e incubare le piastre a 37 ° C e 5% CO 2 (in un incubatore). La concentrazione finale all'interno del pozzo deve essere di 100 micron ipoxantina, 5.8 micron azaserine, e 16 micron timidina.
  8. Eseguire un'analisi microscopica (ingrandimento: lente obiettivo 10X, 10X oculare) per la crescita clonale in ciascun pozzetto della piastra dopo 7 giorni, al fine di determinare se i pozzi sono mono o policlonali. cellule monoclonali sono un cluster di cellule originate da una singola cellula. cellule policlonali sono diversi gruppi di cellule in un pozzo. Cambiare il supporto completo dopo 7 giorni e incubare ancora per 7 giorni in mezzo HAT.
  9. Modificare il mezzo HAT e coltivare le cellule in terreno di coltura cellulare pieno. Utilizzare il surnatante per eseguire una ELISA, come descritto nel passaggio 3. cellule di ibridoma positive deve essere espanso in piastre da 24 pozzetti secondo i test per la produzione di anticorpi specifici. Se le cellule sono policlonali, una diluizione limitata deve essere effettuata (descritto al punto 8).

7. crioconservazione di ibridomi

  1. Cryoconserve mono positivo e ibridomi policlonali per la conservazione a lungo termine. Raccogliere le cellule da una piastra 24 pozzetti con una confluenza di> 60% per centrifugazione (200 xg, 10 min, 4 ° C).
  2. Risospendere il pellet in 500 ml di piena terreni di coltura cellulare e trasferirlo in un cryotube. Aggiungere 500 ml di mezzo di congelamento (RPMI 1640, il 20% FCS, e il 15% dimetilsolfossido), mescolare, e metterlo in in una scatola di polistirolo o di una scatola di congelamento speciale. Conservare a -80 ° C per 3 giorni. Dopo 3 giorni, il cryotube può essere trasferita in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

8. diluizione limite di policlonale ibridomi

  1. makEA cultura feeder layer, come descritto al punto 5. Harvest cellule policlonali positive, come descritto al punto 7.1. Contare le cellule, come descritto al punto 6.5, e regolare il numero di cellulare a 10 cellule / ml, con un volume finale di 10 ml per una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 100 microlitri / pozzetto sullo strato alimentatore.
  2. Incubare per 7 giorni a 37 ° C e analizzare la crescita clonale microscopio (ingrandimento: 10X lente dell'obiettivo, 10X oculare). Fare un test ELISA del surnatante cultura, come descritto al punto 3, ed identificare le ibridomi monoclonali appropriati per la cultura di massa.

9. Massa cultura e Purificazione di anticorpi monoclonali

  1. Trasferire i ibridomi monoclonali con gli appropriati segnali ELISA a 25 cm 2 o 75 cm 2 palloni e raccogliere fino a 500 ml di surnatante cultura. Testare il settimanale di coltura per la produzione di anticorpi specifici e conservare 3 - 5 aliquote per ibridoma per la conservazione a lungo termine, come descritto al punto 7.
  2. Preparare una proteina Una colonna mediante lavaggio con tampone di lavaggio (diluire il tampone di legame 1: 3 in dH 2 O). Passare il surnatante dal punto 9.2 sopra la colonna e raccogliere il flow-through. Eluire l'anticorpo legato con 0,1 M citrato, pH 3,5 e neutralizzare immediatamente il pH con 500 ml di Tris-HCl, pH 9,0.
  3. Caratterizzare l'anticorpo eluita mediante SDS-PAGE, Western Blot, ed ELISA, e convalidare per l'applicazione finale.
    1. Per la pagina SDS, prendere 3-5 mg di soluzione di anticorpo purificato per corsia (un campione di 20 ml), aggiungere 5 ml di 4x SDS tampone campione di carico (8% SDS, 20% 2-mercaptoetanolo, 40% glicerina, e 0.015 % bromofenolo, ridotto), e riscaldare le sonde a 95 ° C per 5 min. Come controllo, utilizzare lo stesso campione con un purificatontibody dello stesso isotopo, ma la specificità irrilevante.
    2. Caricare i campioni su un gel SDS 12,5%, posizionare 5 ml di una scala di proteine ​​senza macchia in una corsia supplementare, e separarli mediante elettroforesi. Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue e documentare i risultati. Un protocollo di base SDS è stato istituito con Laemmli nel 1970 15.

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Representative Results

La Figura 1 mostra un esempio del titolo sierico antigene-specifica per una vaccinazione effettuata in laboratorio. In questa figura, i sieri immuni A e B sono stati titolati da 1:50 a 1: 5.000.000 rispetto a un siero di un mouse naif. L'antigene è stato rivestito sulla fase solida e gli anticorpi specifici sono stati rilevati con una capra POD-coniugato anticorpo anti-topo Ig. Entrambi i sieri dei topi immunizzati mostrato una significativamente maggiore titolo antigene-specifica rispetto al mouse naif. Il segnale ad una diluizione di 1: 5.000 è sufficiente per passare alla fase successiva, la fusione cellulare.

La crescita di ibridomi era visibile dopo 7 a 10 giorni di selezione HAT per lo sviluppo di cloni cellulari, come mostrato nella Figura 2. L'immagine è stata scattata da una piastra a 96 pozzetti 10 giorni dopo la fusione. I cloni cellulari e aminopterinemono- o policlonalità dei pozzettisono stati monitorati dai singoli analisi al microscopio (ingrandimento: lente obiettivo 10X, 10X oculare). pozzi monoclonali sono state marcate con un punto sulla parte superiore della piastra. Quando le piastre sono stati testati in ELISA, segnali antigene-specifiche da ibridomi monoclonali possono essere facilmente identificati. culture ibridomi positivi sono stati recloned, ampliati, e crioconservati fino a quando la cultura era monoclonale, stabile, e antigene-specifica. Il supernatante della coltura è stato raccolto durante il tempo di coltura per purificare l'anticorpo monoclonale prodotto tramite cromatografia di affinità con proteina A-mediata. La figura 3 mostra un profilo di eluizione standard di un anticorpo monoclonale con isotipo IgG1.

Anticorpi monoclonali purificati sono stati ulteriormente caratterizzati da un PAGE SDS, come mostrato nella figura 4. A 50 e 25 kDa, le catene pesanti e leggere sono chiaramente visibili, indicando la purificazione di una molecola di anticorpo. Corsia 2 showed un anticorpo di controllo con lo stesso isotopo.

Figura 1
Figura 1: Titolazione siero dopo l'immunizzazione. I sieri da due topi sono stati titolati in diluizioni da 1:50 fino a 1: 5.000.000 e testato per specificità antigenica da parte di un test ELISA. Come siero di controllo di un topo non immunizzato è stato utilizzato in una diluizione 1:50. I segnali antigene-specifiche sono stati positivi sia per i topi immunizzati ed i splenociti di topo A sono stati utilizzati per la produzione di ibridomi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2: Fotografie di mono- e policlonali ibridomi. Mono e hy policlonalebridomas sono stati analizzati al microscopio 10 giorni dopo la fusione cellulare. Le immagini mostrano il risultato convenzionale per linee cellulari derivate da ibridomi stabili con monoclonale (A) e policlonali proprietà (B). Una barra di scala: 10 micron; B barra della scala: 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: Standard profilo di eluizione per un anticorpo monoclonale IgG1 con Isotipo. L'anticorpo monoclonale generato è stato purificato tramite cromatografia di affinità proteina A-mediata, e il profilo di eluizione di un anticorpo IgG1 è mostrato nella figura. Il primo picco indica la molecola anticorpo monoclonale eluita a pH 5.0. I seguenti picchi indicano pH 3,5 e pH 2,0. La riduzione del pH è necessariopulire completamente la colonna di tutte le sostanze e rigenerare la matrice colonna per i prossimi purificazioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: PAGINA SDS standard per un anticorpo monoclonale IgG1 con Isotipo. La purezza dell'eluente anticorpo è stato determinato da un Coomassie macchiati SDS-PAGE. 5 mg di soluzione di anticorpo erano stati applicati a L2 e confrontata con 5 mg di un anticorpo IgG1 standard L3 in condizioni ridotte. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La generazione di anticorpi monoclonali di IBRIDOMA richiede un'analisi intensa e dettagliata epitopo, soprattutto per quanto riguarda l'applicazione finale, quando l'anticorpo dovrebbe riconoscere il bersaglio. Questo è spesso sottovalutata dagli utenti e conduce agli anticorpi con prestazioni deboli. Il processo di fusione è sempre casuale, il che significa che il risultato di ibridomi specifici è fortemente dipendente dal rapporto cellulare e la vitalità a questo punto. Dopo diluizione limitata, le cellule sono molto instabili e richiedono monitoraggio rigoroso della crescita cellulare e la produzione di anticorpi. Questi parametri devono essere attentamente analizzate durante la risoluzione del metodo.

Ulteriori limitazioni della tecnica comprendono il tempo necessario per la generazione linea cellulare e la selezione della cella anticorpo-produzione desiderata. Grazie al set di cromosomi tetraploide dopo la fusione, le cellule sono molto instabili e successivamente ridurre il set di aploidi di nuovo. Questo potrebbeportano alla perdita di geni anticorpali, provocano le cellule non producono più anticorpi. Un'altra limitazione è che la selezione delle cellule produttrici di anticorpi desiderati si basa sul supernatante della coltura e non delle soluzioni anticorpi purificati. Pertanto, una caratterizzazione finale di anticorpo è, nella maggior parte dei casi, solo dopo le cultura di massa del clone di ibridoma selezionato. Pertanto, il rischio che l'anticorpo non è in grado di lavorare nell'applicazione finale è molto elevata.

Diverse modifiche tecnologiche, come l'analisi del laser-enabled e la tecnologia di elaborazione (LEAP) 16, esposizione di superficie cattura affinità (ACSD) 17, o gel tecnologia microdrop 18, sono stati descritti al fine di eludere gli inconvenienti durante la selezione di anticorpi adeguati. Tutti questi metodi sono in grado di migliorare diversi aspetti della generazione di ibridomi e selezione, ma la maggior parte di essi richiedono attrezzature costose o di ottimizzazione per ogni singola cella liNE 16.

Un altro miglioramento o modifica che è stato sviluppato nel nostro laboratorio è una strategia di immunizzazione romanzo con particelle virali chimeriche-simili (VLP), come descritto nella Messerschmidt et al 19. Le particelle possono essere modificati dalle sequenze epitopi desiderati incorporati nella struttura del mantello virale e presentate sulla superficie di tali particelle. Questo porta a molto veloce e preciso immunizzazione dopo 4 settimane negli animali corrispondenti. Gli anticorpi monoclonali generati hanno IgG2 o IgG1 isotipi e dipendono dalla selezione epitopo altamente specifico per l'antigene nativo. Abbiamo anche sviluppato una fase di selezione specifico per le cellule di ibridoma utilizzando marcatori di superficie delle cellule artificiali. Le cellule di mieloma transgenici utilizzati visualizzare un marcatore di superficie stabilmente inserito. Questo marcatore di superficie può essere usata per antigene o isotipo-specificamente ordinare cellule di ibridoma direttamente dopo la fusione, senza limitare la diluizione e senza eccessivi di screening ELISA,come è in realtà necessario IBRIDOMA convenzionale 20.

Come accennato in precedenza, ci sono alcune alternative promettenti disponibili a generazione anticorpo monoclonale che, in futuro, potrebbero migliorare la maneggevolezza e ridurre gli inconvenienti della IBRIDOMA corrente. Tuttavia, la procedura richiederà sempre l'identificazione dettagliata dell'epitopo desiderato in combinazione con un'applicazione rigorosa e accuratamente pianificata in modo che l'anticorpo monoclonale generato funziona correttamente. La generazione di anticorpi monoclonali di IBRIDOMA sarà un passo importante e necessario in futuro, a causa della enorme richiesta nel campo della scienza, la diagnostica e la terapia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882
N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide (EDC) Sigma Aldrich 39391-10ML
Sulfo-GMBS Perbio Science Germany 22324
ovalbumin Sigma Aldrich A5503
bovine serum albumin Sigma Aldrich A2153
keyhole limpet hemocyanin Sigma Aldrich H8283
Falcon tubes 15 mL Biochrom GmbH P91015
reaction vials, 1.5 mL Carl Roth GmbH & C0.KG CNT2.1
hollow needle Carl Roth GmbH & C0.KG C724.1
glass wool Carl Roth GmbH & C0.KG 6574.1
Sephadex G25 coarse Sigma Aldrich GE-17-0034-02
Freund´s adjuvant, complete Sigma Aldrich F5881-10ML
ELISA plates, 96 well Greiner bio-one 655101
neonatal calf serum Biochrom GmbH S1025
TipOne Tips 1,000 µL Starlab S1111-2021
Pipette tips 200 µL Greiner bio-one 739291
HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody Dianova 115-035-003
tetramethylbenzidine Carl Roth GmbH & C0.KG 6350.2
Natriumdihydrogenphosphat Carl Roth GmbH & C0.KG K300.2
peroxide/urea
sulphuric acid Carl Roth GmbH & C0.KG 4623.3
RPMI 1640 Life technologies GmbH 31870074
L-glutamine Carl Roth GmbH & C0.KG HN08.2
beta-mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250
fetal calf serum Invitrogen 10270106
TC-flask 25 cm2 Peske GmbH 86-V025
TC-flask 75 cm2 Peske GmbH 86-V075
ethanol, 96% Carl Roth GmbH & C0.KG P075.1
cell strainer VWR international 734-0002
Falcon tubes 50 mL Biochrom GmbH P91050
PEG 8000 Sigma Aldrich 1546605
electroporation cuvette, 2 mm Biodeal Handelsvertretung Edelmann e.K. EKL2,25
hypoxanthine Sigma Aldrich H9636-25G
azaserine Sigma Aldrich A4142
thymidine USB Europa GmbH 22305 1 GM
TC-plates 96 well Biochrom GmbH P92696
TC-plates 24 well Biochrom GmbH P92424
cryotubes, 1 mL Sigma Aldrich V7384-1CS
dimethylsulfoxide Carl Roth GmbH & C0.KG 4720.1
protein A sepharose Sigma Aldrich P3391-1G
SDS sample loading buffer, Roti-Load 1 Carl Roth GmbH & C0.KG K929.1
unstained protein ladder BioRad Laboratories 161-0363
comassie brilliant blue R-250 BioRad Laboratories 161-0406

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References

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Immunologia anticorpi monoclonali IBRIDOMA cellule di mieloma linfociti B antigene immunconjugate
Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia
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Holzlöhner, P., Hanack, K. Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology. J. Vis. Exp. (119), e54832, doi:10.3791/54832 (2017).

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