Introduction
제 1 형 당뇨병 (T1D)은 자기 반응성 T 세포를 1 β 세포의 인슐린 - 생성 췌장의 파괴를 특징으로하는자가 면역 질환이다. T1D의 진단은 일반적으로 인슐린 결핍의 증거로 케톤 산증으로 야기 될 수 있습니다 린, 젊은 개인에 고혈당 (혈당> 200 밀리그램 / DL)의 측정에 따라 이루어집니다. T1D의 진단시, β 세포 기능 및 질량의 상당한 감소에 대한 증거가있다 (50 - 90 %)이. 임상 연구에서, 진단시 제정 된 여러 면역 조절 성 약물, 질병의 임상 적 관해 이어질 β 세포 기능 (그리고 아마도 질량), 그러나 아무도의 안정화 개발을위한 전화를 제기 한 연구 결과를 초래 질병의 초기 탐지와 대한 바이오 마커의 조합의 효과의 길이 추적 3,4 치료. 국제 컨소시엄의 노력, 이러한히스 (5)의 국립 연구소에서 인간의 작은 섬 연구 네트워크 컨소시엄이야, T1D의 β 세포 스트레스와 죽음에 초점 바이오 마커의 개발 필요성을 강조했다.
9 - 이러한 노력에 맞춰, 우리 그룹 등 최근 β 세포 6 죽어 주로 발생, 후 성적 변형 된 DNA 조각을 순환 측정 바이오 마커 분석을 개발했다. 지금까지 발표 된 검정 모두에서, 초점이 다른 세포 유형에 비해 코딩 및 프로모터 영역의 비 메틸화 된 CpG 부위의 큰 정도를 보여주는 인간 유전자 부호화 preproinsulin (INS)의 정량에있다. 메틸화 INS DNA 단편의 해방은 (괴사, 세포 사멸) β 세포를 죽음에서 주로 발생으로 가정 하였다. 우리의 최근의 연구는 청소년, 위치 -69 bp의에서 메틸화 및 메틸화 모두 INS의 DNA에 고도는 (상대가 마에 것으로 나타났다그는 새로운 발병 T1D에서 관찰되었다) 사이트를 시작, 함께이 인구 6과 같은 특정 바이오 마커를 제공 전사. 이러한 바이오 마커 분석이 분리 된 DNA의 중아 변환 다음에 상용 스핀 키트를 사용하여 혈청 또는 혈장에서 무 세포 DNA의 분리를 포함 (우라실에 비 메틸화 된 시토신을 변환하는 그대로 메틸화 된 시토신을 떠나).
이 보고서에서 우리는 차별적 메틸화 INS DNA에 대한 혈청 샘플 수집, 혈청에서 무 세포 DNA, 중아 변환 및 (이제부터는, 디지털 PCR) 방울 디지털 PCR의 성능 분리의 기술적 측면에 대해 설명합니다.
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Representative Results
적절하게 데이터를 해석하기 위해, 우리는 각 디지털 PCR 실행의 메틸화 및 메틸화 대상 INS의 DNA 모두 플라스미드 컨트롤을 사용합니다. 이러한 컨트롤은 메틸화 및 비 메틸화 된 DNA에 대응하는 신호가 명확하게 구별되어 있는지 확인하십시오. 도 1은 바이 설 파이트 변환 메틸화 INS DNA (도 1a)를 포함하는 플라스미드 컨트롤 메틸화 INS DNA (도 1b)에 대한 물방울에 대응하는 2-D 산점도를 나타내고, 1 개의 플라스미드 (도 1C) 1 혼합물. 메틸화 INS를 포함하는 플라스미드 플라스미드는 INS가 VIC 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다 메틸화 함유하는 반면, 6 카르복시 (FAM) 신호에 대한 긍정적 인 방울로 표시됩니다. 1 년 : 1 플라스미드 혼합물, 더블 긍정적 인 방울의 인구는 모두 종을 포함 물방울에 대응 볼 수있다DNA. 네거티브 긍정적 방울 방울을 구별하기 위해, 데이터는 이러한 2-D 플롯을 이용하여 게이팅된다. 도 1a에, 메틸화 INS DNA에 대한 프로브가 메틸화 INS DNA에 대한 몇 가지 교차 반응을 나타내는 것을 나타내는 VIC 채널에 FAM 양성 방울의 약간의 변화가 있습니다. 유사하게,도 1b에서, 메틸화 된 DNA와 함께 DNA 메틸화에 대한 프로브의 교차 - 반응성을 나타내는 FAM 채널에 VIC 양성 방울의 아주 약간의 변화가있다. 디지털 PCR의 가장 큰 장점은 프로브가 100 % 특정되지 않습니다 때, 여전히 심지어 특정 신호를 구별 할 수 있습니다. 소프트웨어에 의해 적절한 푸 아송 통계 계산, 각 PCR 반응은, 적어도 10,000 총 방울로 분할 부정적인 방울의 클러스터를 표시하고 (신뢰할 수있는 게이트에 대한) 부정과 긍정적 인 방울 사이에 명확한 진폭 차이를 보여 주어야한다. 우리의 프라이머의 선형성을 보여주기 위해, 우리 쪽수십배에서 두 플라스미드의 erformed의 혼합물을 포함한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 하나의 플라스미드의 다양한 농도는 선형 초 플라스미드 일정량의 존재를 검출 할 수있다. 새로운 랩이 절차를 수행하기 위해, 우리는 상기 분석은 선형 검출 방식으로 작동되도록하여 유사한 실험 혼합물을 구성 바랍니다.
다음으로, 우리는 새로운 발병 T1D 세 환자의 혈청을 얻어 T1D없이 세 가지 제어 개인 (임상 적 특성에 대한 표 1 참조) (진단 2 일 이내). 프로토콜은 인디애나 대학 임상 시험 심사위원회의 승인을했다. 제공 과목의 부모는 동의를 통보하여 작성. 그림 3은 메틸화 및 메틸화 INS DNA 숫자 / μL 혈청을 복사의 정량을 보여주고, 이러한 컨트롤 및 T1D 과목에서 10 로그로 변환. 데이터가 보여 내가 그 이전에 6보고 된 데이터와 유사한 컨트롤에 비해 메틸화 및 비 메틸화 모두 INS DNA의 T1D 전시 상승 수준 ndividuals.
그림 1 : 플라스미드 컨트롤의 대표 2-D 플롯. 플라스미드 표준이 사이트를 시작 전사 이민국에 위치 -69 bp의 상대에 중아 변환 INS DNA 메틸화 은닉 또는 메틸화 된 시토신의 조각을 복제하여 생성되었다. 도시 메틸화 (A)와 변성 (B)를 함유하는 플라스미드를 사용하여 2-D 플롯 INS DNA이며 1 : 두개의 플라스미드 (C) 1 혼합물. 화살표는 메틸화 1, 메틸화 메틸화 및 비 메틸화 + (긍정적 이중 -) INS DNA 함유 방울을 식별합니다. FAM = 대상 1; VIC = 대상 2.심판 = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 제어 플라스미드 혼합물을 사용하여 DNA 대상의 정량. 사이트를 시작 전사 이민국에 위치 -69 BP 상대적인 중아 변환 INS 은닉 DNA 메틸화 또는 메틸화 된 시토신의 클로닝 된 단편을 포함하는 플라스미드 표준은 디지털 다중화 PCR을 실시한 후, 도시 된 다양한 조합으로 혼합 하였다. 도면은 복사 / μL로 제시 대상 DNA 단편의 정량을 나타낸다 R 2 = 0.989 메틸화 INS DNA 및 R 2 = 0.998 메틸화 INS DNA합니다. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
그림 3 : T1D과 메틸화 및 메틸화 INS DNA 컨트롤의 수준 및 주제를 순환. 혈청 샘플은 새로운 발병 T1D 4 청소년에서 수집 4 무병, 관련이없는 컨트롤에서 다음 디지털 PCR에 의해 차별적 메틸화 INS의 DNA 측정을 위해 처리 하였다. 메틸화 (A)와 변성 (B) INS 디지털 DNA PCR 분석의 결과를 나타낸다. 데이터는 각각의 점으로 표시 ± SEM을 의미한다. 통계는 양측 파라 메트릭 학생 t 테스트에 의해 분석 하였다. 생의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오의 그림입니다.
| 통제 수단 | 발병 T1D | |
| 나이 (10 세) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| 여성 남성 | 1 : 3 | 1 : 3 |
| BMI Z-점수 | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| 당화 1C (%) | 11.1 ± 0.6 | |
| C-펩타이드 (pmol의 / L) | 285.5 ± 37.0 |
표 1 : T1D와 컨트롤 및 주제의 인구 통계.
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Discussion
DNA의 methyltransferases에 의해 시토신의 메틸화는 많은 유전자의 전사의 후생 유전 학적 제어 할 수 있습니다. 인간의 INS 유전자는 거의 독점적으로 세포 β 섬으로 표현, 그 전사 (11)의 침묵에 INS 유전자의 시토신 메틸화의 주파수 사이의 상관 관계가있을 나타납니다. 13 - 따라서, 대부분의 세포 유형은 세포를 11 β에 비해 다양한 사이토에서 INS 유전자의 메틸화가 실질적으로 높은 주파수를 나타낸다. 이는 β 세포 사멸의 빈도가 DNA 12 해방 β 세포 죽음에서 크게 발생하는 것이다 무 세포 INS 메틸화 DNA의 혈청 농도의 분석에 의해 모니터링 될 수 있다고 제안되었다.
바이 설 파이트 반응은 14 변경 메틸화 된 시토신을 떠나, 우라실에 비 메틸화 된 시토신 변환합니다. 시퀀싱 또는 PCR 분석을 오F 아황산 수소 변환 DNA 따라서 원래 시토신이 메틸화 여부를 여부의 결정을 할 수 있습니다. 메틸화 특이 PCR 염료 기반 기술을 사용하여 프라이머와 템플릿 간의 3 '염기 쌍의 불일치로 인해 PCR 효율의 차이를 악용, 따라서 DNA (15) 중아 변환 다음과 메틸화 된 시토신 대 메틸화의 구별을 할 수 있습니다. 따라서, 염료 계 PCR은 T1D는 12, 16 : 주제의 초기 연구에 메틸화 INS로 메틸화의 상대적인 비율을 정량 하였다. 그러나, 염료 계 PCR 기술은 제한된 특이 DNA 단편 농도 절대 정량의 부족하고 (즉, 동일한 반응에서 메틸화 및 메틸화 DNA 종 모두 검출) 멀티플렉싱 할 수 없다는 등 여러 가지 단점을 가지고있다. 다른 그룹은 무 세포 DNA 단편의 염기 서열 분석, 큰 많은 여러 차분 메틸화 된 CpG 부위를 모니터링 할 수있는 기술을 수행 한어 특이성 9. 그러나 시퀀싱 기술은 많은 양의 샘플을 필요로 쉽게 뱅크 샘플로 사용 의무가없고, 고가이다.
우리 그룹과 다른 디지털 PCR, DNA 단편의 절대 정량을 제공하는 기술을 채용 한 이러한 한계 때문에, 신선 또는 뱅크 샘플 혈청의 마이크로 리터의 양을 필요로 다중화 할 의무가 전통적인 정량적 PCR보다 감도를 나타낸다 및 직접 염기 서열보다 저렴하다. 디지털 PCR 기술은 종래 프라이머 / 프로브 분석법의 사용 ~ 20,000 소적으로 유중 PCR 반응의 마이크로 유체 기반의 분할을 포함한다. 파티션 반응의 열 사이클 후에, 소적은 연속적으로 양 및 음의 신호와 방울을 식별하는 유동 세포 계측기에 의해 분석된다. 푸 아송 통계는 각각의 DNA 종의 절대량 (카피 수)를 계산하는데 사용된다. 개념적 D디지털 PCR의 etails는 다른 17 설명 하였다.
이 프로토콜은 디지털 PCR에 의해 차등 INS 메틸화 된 DNA를 측정함으로써 인간에서의 β 세포 사멸의 측정을 설명한다. 우리의 데이터는 여기에 제시된 다른 곳 6은 그 위치 -69에서 비 메틸화 된 시토신 (FAM 프로브) 또는 메틸화 된 시토신 중 하나에 충분한 특이성을 나타내는 (INS의 전사 시작 사이트를 기준으로) 시토신의 차동 메틸화를 검출 프라이머 / 프로브 조합 ( VIC 프로브) (도 1A 및 B 참조). 위치에 -69 혈압을 메틸화 및 비 메틸화 모두 INS 단편을 포함하는 플라스미드의 혼합물 (즉, 중아 변환 우라실 또는 시토신 위치 -69 bp의에서 하나를 갖는 DNA) 하나 또는 다른 플라스미드를 포함하는 전시 방울 또는 둘 모두 플라스미드를 (두 번 긍정적 인 신호 그림 1C에서). 푸 아송 통계 계산 제를 사용한다각 메틸화 또는 비 메틸화 된 DNA 단편의 사본 번호를 유도하는 (단일 긍정적 또는 이중 양성 여부) 지정된 프로브에 대한 긍정적 인 전자 방울 번호.
무 세포 DNA에 위치 -69 BP (그림 3)에서 차별적 메틸화 된 시토신의 측정을 위해 인간 혈청을 이용하면, 우리의 데이터는 두 가지 주요 기능을 보여줍니다 메틸화 INS (1) 수준이 과목에서 높은 5 ~ 10 배입니다 메틸화 INS (에 관계없이 진단), 및 메틸화 및 메틸화 INS 두 (2) 절대 수준보다 컨트롤에 비해 새로운 발병 T1D과 과목에서 더 높다. 메틸화 INS에 비해 메틸화 INS의 높은 수준의 가능성이 비 β 세포에서 나오는 무 세포 DNA의 더 큰 부담을 반영하는 반면, 새로운 발병 T1D 과목에서 INS의 두 종의 높은 수준의 가능성이 유행 β의 증가를 모두 반영 세포 사멸 (메틸화 INS) 및 가능한 사망 / 질병 상태 (예를 들어, 선천성 및 후천성 면역 세포)와 관련된 다른 종류의 세포 회전율. 새로운 발병 T1D 과목에서 INS의 두 종의 고도에 대한 자세한 투기는 이전에 6 논의되었다. 에 관계없이 이러한 개인의 혈청 INS의 두 종의 소스, 그것은 주목할 만하다 그 절대 수준에서 유의 한 차이를 포착하지 않았을 것이다 (염료 기반 PCR을 사용하여 다른 연구자에 의해보고 된) 메틸화 INS에 메틸화의 비율의 측정 따라서 바이오 마커 분석이 유형의 디지털 PCR의 힘을 강조 여기서 설명하고 최근 간행물 6인치
일부주의 사항 및 제한 사항에 유의해야한다. 우리는 피가 컬렉션의 4 시간 이내에 처리되고 하나가 DNA의 격리를 위해 즉시 사용하거나 나중에 사용하기 위해 -80 ºC에서 보관하는 것이 중요하다 생각합니다. 미발표 연구에서는 OBS가샘플 (18)의 장기간 저장의 연구에서와 같이, 아마도 DNA 분해 때문에, 수집의 4 시간 후, DNA 복구의 일부 손실 erved. 때문에 디지털 PCR의 증가 된 감도, 특별한주의는 달리 전통적인 qPCR에 눈에 띄는되지 않을 것 샘플의 오염을 방지하기 위해주의해야한다. 마지막으로,이 기술의 주요 제한은 액적 생성 ~ 10,000 방울을 초과하지 않는 샘플에 대한 분석이다. 이러한 샘플은 신뢰성 푸 아송 통계를 제공하지 않으며, 같은 해석 불가능한 것으로 간주 될 수있다. 낮은 액적 생성의 여러 원인으로는 사용 시약의 품질과 관련 시료 처리에 기술적 오류, 방울 생성기와 기술적 인 문제 또는 문제를 포함 할 수 있습니다.
요약하면,이 보고서는 위치 -69 디지털 PCR에 의한 혈압의 차별적 메틸화, 무 세포 INS의 DNA의 측정을위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 여기에 설명 된 모든 프로토콜에 적용될 수있다DNA 종되는 차동 시토신 메틸화의 검출은 순환 또는 분리 된 세포 및 조직에서의 여부, 요구되고, DNA 단편의 절대 정량을 제공 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
