Introduction
סוכרת מסוג 1 (T1D) היא מחלה אוטואימונית אשר מאופיינת על ידי ההרס של איון מייצר אינסולין β תאים על ידי תאי אוטוריאקטיבים T 1. האבחנה של T1D היא בדרך כלל מתבצעת בזמן המדידה של היפרגליקמיה (הגלוקוז בדם> 200 mg / dl) אצל אדם רזה וצעיר, עלול להוות עם בחמצת כעדות לחוסר באינסולין. בעת האבחנה של T1D, יש ראיות על אובדן משמעותי של תפקוד התא β ומסה (מ -50 - 90%) 2. במחקרים קליניים, מספר תרופות modulatory החיסונית שהונהגו בעת האבחנה הביאה להתייצבות של תפקוד התא β (ומן הסתם מסה), אבל אף אחד מהם לא הביא רמיסיה קלינית של מחלת, ממצא גייסה השיחה לפיתוח של סמנים ביולוגיים לגילוי מוקדם של המחלה ועבור מעקב האורך של האפקטיביות של שילוב טיפול בעזרת 3,4. מאמצי קונסורציומים בינלאומיים, כזהזה הקונסורציום רשת המחקר איילט האדם במכונים הלאומיים של הית 5, הדגישו את הצורך לפתח סמנים ביולוגיים המתמקדים מתח מוות תאי β ב T1D.
עולה בקנה אחד עם המאמצים האלה, הקבוצה שלנו ואחרים פיתחו לאחרונה מבחני סמן ביולוגי המודדים במחזור, קטעי דנ"א שונה epigenetically שעולים בעיקר ממוות תאי β 6 - 9. בכל המבחנים שפורסמו עד כה, הדגש היה על quantitation של preproinsulin קידוד הגן האנושי (INS), אשר מביא לידי ביטוי מעלות פחות או יותר של אתרי CPG unmethylated באזורי קידוד אמרגן בהשוואה לסוגי תאים אחרים. שחרור שברי DNA unmethylated אח"י שוער כמו הנובעת בעיקר ממוות (נמקי, אפופטוטיים) תאי β. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי שלנו בנוער, הגבהים בשני DNA אח"י unmethylated ו מפוגל ב- BP עמדה -69 (ביחס ל- tהוא תעתיק להתחיל באתר) נצפו T1D חדש-onset, ויחד שימש סמנים ספציפיים לאוכלוסייה זו 6. מבחני סמן ביולוגי אלה כרוכים הבידוד של DNA התא מתוך סרום או פלזמה באמצעות ערכות ספין מסחרי, ואחריו המרה bisulfite של ה- DNA מבודד (להמיר cytosines הלא מפוגל כדי uracils, עוזב cytosines מפוגל ללא פגע).
בדו"ח זה, אנו מתארים את ההיבטים הטכניים של אוסף מדגם בסרום, בידוד של DNA התא מתוך בסרום, המרה bisulfite, והביצועים של PCR דיגיטלי אגל (להלן, דיגיטלי PCR) עבור ה- DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לפרש את הנתונים כראוי, אנו משתמשים שולטים פלסמיד היא DNA אח"י יעד unmethylated ו המפוגלת בכל ריצת PCR דיגיטלית. בקרות אלה להבטיח כי האותות המתאימים DNA המפוגל unmethylated וניתן להבחין בבירור. איור 1 מציג את מגרשים פיזור 2-D המתאים טיפות עבור פקדי פלסמיד המכיל אח"י unmethylated המרה bisulfite DNA (איור 1 א), DNA אח"י מפוגל (איור 1B), ו- 1: תערובת 1 של שני פלסמידים (תרשים 1C). פלסמיד המכיל unmethylated אח"י מותווה על ידי טיפות חיובית עבור האות 6-Carboxyfluorescein (FAM), ואילו פלסמיד המכיל מפוגל אח"י מותווה על ידי טיפות חיובית עבור האות VIC. ב 1: תערובת פלסמיד 1, אוכלוסייה של טיפות פעמים החיוביות נתפסת, מתאים טיפות המכילות שני המינים שלDNA. כדי להבחין טיפות חיוביות מטיפות שליליות, נתונים הם מגודרים באמצעות חלקות 2-D אלה. שים לב באיור 1A, יש תזוזה קלה של טיפות FAM החיובי לתוך תעלת VIC, המציין כי החללית עבור DNA אח"י המפוגל מפגינה כמה תגובתיות צולבות עבור DNA אח"י unmethylated. באופן דומה, באיור 1B, יש תזוזה קלה מאוד של טיפות VIC חיובי לתוך התעלה FAM, המציין תגובה צולבת של החללית עבור DNA unmethylated עם DNA מפוגל. יתרון עיקרי של ה- PCR הדיגיטלי זה עדיין יכול להפלות אותות ספציפיים גם כאשר חלליות אינן 100% ספציפיות. עבור חישובים סטטיסטיים מתאימים פואסון על ידי התוכנה, כל תגובת PCR צריכה לחלק לתוך לפחות 10,000 טיפות כוללות, להציג מקבץ של טיפות שליליות, ולהראות הבדל משרעת ברור בין טיפות שליליות וחיוביות (עבור gating האמין). כדי להדגים הליניאריות של פריימרים שלנו, אנו pתערובות erformed של שני פלסמידים לרוחב סדרות כמה וכמה. כפי שניתן לראות בתרשים 2, ריכוזים שונים של פלסמיד אחד יכול להתגלות באופן ליניארי בנוכחות כמות קבועה של הפלסמיד השני. עבור מעבדות חדשות ביצוע הליך זה, אנחנו ממליצים בניית ניסוי בתערובת דומה על מנת להבטיח כי assay פועלת בצורת איתור ליניארי.
הבא, השגנו בסרום של שלושה נושאים עם T1D חדש-onset (בתוך 2 ימי אבחון) ושלושה אנשים שליטים ללא T1D (ראה לוח 1 עבור מאפיינים קליניים). הפרוטוקולים שאושרו על ידי הדירקטוריון סקירה מוסדיים אוניברסיטת אינדיאנה. הורים של נושאים הניתנים בכתב הסכמה מדעת. איור 3 מציג את לכמת unmethylated ו מפוגל אח"י DNA להעתיק מספרים / סרום μl, המרה להיכנס 10 מ פקדים אלה ונושאים T1D. הנתונים מראים כי אני ndividuals עם רמות גבוהות התערוכה T1D של שני מפוגל unmethylated אח"י DNA בהשוואה לקבוצת הביקורת, בדומה לנתונים שדווחו 6 בעבר.
איור 1: מגרשי 2-D נציג של בקרות פלסמיד. סטנדרטי פלסמיד נוצרו על ידי שיבוט שבר ציטוזין unmethylated מחסה DNA אח"י מרת bisulfite או המפוגל ב מיקום יחסי -69 נ"ב אל אח"י יעתיק להתחיל באתר. המוצגים הם מגרשים 2-D באמצעות פלסמיד המכיל (א) unmethylated ו מפוגל (B) אח"י DNA ובמשך 1: תערובת 1 של שני פלסמידים (C). חצים לזהות את unmethylated, מפוגל, ו unmethylated + מפוגל (ובבדיקה חיובי) אח"י טיפות DNA המכיל. FAM target = 1; VIC target = 2.נ"צ = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: כימות של מטרות DNA באמצעות בקרת פלסמיד תערובות. סטנדרטי פלסמיד המכיל שברים משובטים של ציטוזין unmethylated מחסה DNA אח"י מרת bisulfite או המפוגל ב מיקום יחסי -69 נ"ב אל אח"י יעתיק להתחיל באתר היו מעורבים בחלק השילובים השונים לעין, אז נתון זמניים הדיגיטלי PCR. האיור מציג את quantitation של שברי DNA היעד, כפי שהוצגו עותקים / μl; r 2 = 0.989 עבור unmethylated אח"י דנ"א r 2 = 0.998 עבור DNA אח"י מפוגל. אנא לחץ כאן כדילצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: במחזור רמות unmethylated ו Methylated אח"י דנ"א בקרות נושאים עם T1D. דגימות סרום שנאספו 4 נוער עם T1D חדש-onset וממנה 4 שולטת ללא מחלה, לא קשור, אז מעובד למדידת DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי על ידי דיגיטלית PCR. מוצגים הן תוצאות של מבחני PCR דיגיטליים (א) unmethylated ו מפוגל (B) אח"י DNA. נתונים מוצגים כנקודות פרט ממוצעים ± SEM. סטטיסטיקה נותחו על ידי מבחן t דו-זנבי סטודנטים פרמטרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של תיהדמות של.
| בקרות | T1D בתחילתה | |
| גיל (שנים) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| נקבה זכר | 1: 3 | 1: 3 |
| Z- ציון BMI | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| HbA 1C (%) | 11.1 ± 0.6 | |
| C-peptide (pmol / L) | 285.5 ± 37.0 |
טבלה 1: דמוגרפיה של בקרות נושאים עם T1D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מתילציה של cytosines ידי methyltransferases DNA מאפשרת השליטה אפיגנטיים של שעתוק גנים רבים. גן אח"י בבני האדם הוא כמעט לידי ביטוי אך ורק איון β תאים, נראה שיש קורלציה בין תדירות מתילציה של cytosines בגן INS כדי להשתיק של השעתוק שלה 11. ככזה, סוגי התאים ביותר מציגים תדירות גבוהה יותר באופן משמעותי של מתילציה של גני אח"י ב cytosines השונה לעומת בטא תאים 11 - 13. הוצע כי השכיחות של מוות תאי β יכול להיות במעקב על ידי ניתוח של רמות בסרום של DNA אח"י unmethylated ללא תאים, אשר יצוצו בעיקר ממוות תאי β כי לשחרר DNA שלהם 12.
התגובה bisulfite ממירה cytosines unmethylated לתוך uracils, עוזב cytosines מפוגל 14 ללא שינוי. o רצף או ניתוח PCRbisulfite מרת f DNA ולכן מאפשר קביעה אם ציטוזין המקורי היה מפוגל או לא. מתילציה ספציפי PCR באמצעות טכנולוגיה מבוססת צבע מנצל הבדלים ביעילות PCR בשל 3 'חוסר התאמה בסיס-זוג בין פריימרים ותבנית, ובכך מאפשר הבחנה של unmethylated לעומת cytosines מפוגל עקב המרת bisulfite של DNA 15. בהתאם לכך, לצבוע מבוסס PCR שמש לכמת את המשקל היחסי של unmethylated כדי אח"י מפוגל במחקרים המוקדמים של T1D נושאי 12,16. עם זאת, הטכנולוגיה PCR מבוססי צבע יש כמה חסרונות, כולל סגוליות מוגבל, חוסר quantitation המוחלט של ריכוזי קטע DNA, וחוסר היכולת זמנית (כלומר, לזהות שני המינים DNA מפוגל unmethylated באותה תגובה). קבוצות אחרות ביצעו רצף ישיר של קטעי דנ"א ללא תאים, טכניקה המאפשרת ניטור של כמה דיפרנציאלי אתרי CPG מפוגל עם הרבה יותר גדולאה סגולי 9. עם זאת, טכניקת הרצף דורשת כרכי מדגם גדולים, הוא לא מקובל בקלות להשתמש דגימות פקידה, והוא יקר.
כתוצאה ממגבלות אלו, הקבוצה ואחרים שלנו יש מועסקים דיגיטלי PCR, טכניקה המספקת quantitation המוחלט של קטעי דנ"א, דורש כמויות של סרום מיקרוליטר רק ממדגמים טריים או פקידה, ניתן ריבוב, מגלה רגישות רבים יותר מאשר מסורתי PCR כמוני , והוא זול יותר מאשר רצף ישיר. הטכנולוגיה הדיגיטלית PCR כרוכה בשימוש מבחני פריימר / בדיקה קונבנציונאלי וכן מחיצות מבוססי מיקרופלואידיקה של תגובת PCR מים ב-שמן לתוך ~ 20,000 טיפות. בעקבות רכיבה תרמית של התגובה למחיצות, הטיפות מכן מנותחים על ידי cytometer זרימת לזהות טיפות עם אותות חיוביים ושליליים. סטטיסטיקת פואסון משמשת לחישוב כמויות מוחלטות (מספרי עותק) של כל מין DNA. ד מושגיתetails דיגיטלים PCR תואר במקום אחר 17.
פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מוות תאי β בבני אדם על ידי מדידת DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי על ידי דיגיטלית PCR. הנתונים שלנו שהוצגו כאן ובמקומות אחרים 6 מראים כי פריימר / שילובים חלליים מאתרות מתילציה הפרש של ציטוזין במיקום -69 (ביחס לאתר סטארט התעתיק של אח"י) להפגין סגולי מספיק גם את ציטוזין unmethylated (בדיקת FAM) או ציטוזין המפוגל ( חללית VIC) (ראה איור 1 א 'ו-ב'). תערובות של פלסמידים המכילים הן מפוגל unmethylated שברי אח"י במיקום -69 נ"ב (כלומר, bisulfite המרה DNA שיש או אורציל או ציטוזין במיקום -69 נ"ב) טיפות התערוכה המכיל אחד או פלסמיד אחרים, או שניהם פלסמידים (פעמיים חיובי אותות באיור 1C). החישוב הסטטיסטי פואסון מנצל המספרי אגל דואר כי הם חיוביים עבור בדיקה נתונה (אם חד חיובי או פעמים חיוביות) כדי לגזור את מספרי העותק של כל קטע DNA מפוגל או unmethylated.
כאשר ניצול נסיוב אדם לשקילת cytosines מפוגל דיפרנציאלי במיקום -69 נ"ב הדנ"א של התא חינם (איור 3), הנתונים שלנו להפגין שתי תכונות עיקריות: (1) רמות של אח"י מפוגל הם 5-10 גבוה פי הנושאים הללו מ unmethylated INS (ללא קשר לאבחנה), ו- (2) רמות מוחלטת של שני אח"י unmethylated ו מפוגל גבוהים בנבדקים עם T1D חדש-onset בהשוואה לקבוצת הביקורת. בעוד הרמות הגבוהות יותר של אח"י מפוגל לעומת unmethylated אח"י משקפות קרובות לוודאי את העומס הגדול יותר של ה- DNA בתא ללא שמקורם בתאים שאינם β, הרמות הגבוהות יותר של שני המינים של אח"י במקצועות T1D חדש-onset כנראה משקפות הוא מגידול β נפוץ מוות של תאים (לפי unmethylatedS), ואולי אף מוות / מחזור של סוגי תאים אחרים משויכים של מצב המחלה (למשל, מולדים ותאי חיסון אדפטיבית). ספקולציות נוספות על הגבהים של שני המינים של אח"י במקצועות T1D חדש-onset נדונו 6 בעבר. לא משנה את המקורות של שני המינים של אח"י בסרום מיחידים אלה, וזה ניכר כי למדידת יחס של unmethylated כדי מפוגל INS (כפי שדווח על ידי חוקרים אחרים באמצעות הצבע מבוסס PCR) לא הייתי בוחר את ההבדלים המשמעותיים ברמות מוחלטות שתואר כאן וגם בפרסום 6 האחרון שלנו, ובכך מדגיש את הכח של PCR הדיגיטלי עבור סוג זה של ניתוח סמן ביולוגי.
כמה אמצעי זהירות והגבלות יצוינו. אנחנו מרגישים שזה חשוב כי דם מעובד בתוך 4 שעות של איסוף או להשתמש מיד לבידוד DNA או לאחסן ב -80 ºC לשימוש עתידי. במחקרים לא פורסם, יש לנו observed לאובדן חלק התאוששות DNA לאחר 4 שעות של איסוף, אולי בזכות השפלה DNA, כפי שניתן לראות במחקרים של אחסון לטווח ארוך של דגימות 18. בגלל הרגישות המוגברת של דיגיטלי PCR, טיפול מיוחד יש לנקוט כדי למנוע זיהום של דגימות שאחרת לא להיות מורגש המסורתית qPCR. לבסוף, למגבלה העיקרית של הטכניקה היא ניתוח של דגימות שבו הדור אגל אינו עולה ~ 10,000 טיפות. דגימות כאלה אינם מספקים סטטיסטיקה פואסון אמין, וככזה עשוי להיחשב uninterpretable. סיבות מרובות של דור אגל נמוך כזה עשויות לכלול טעויות טכניות טיפול מדגם, בעיות טכניות עם גנרטור האגל, או בעיות הקשורות לאיכות של חומרים כימיים המשמשים.
לסיכום, הדו"ח יתואר פרוטוקול מפורט למדידת DNA אח"י מפוגל דיפרנציאלי, תא ללא במיקום -69 נ"ב ידי דיגיטלית PCR. הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים לכלמיני DNA עבורו זיהוי של cytosines המפוגל דיפרנציאלי הוא רצוי, אם ממחזור או מן תאים ורקמות מבודדים, והוא יכול לספק quantitation המוחלט של קטעי דנ"א.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
