Introduction
1型糖尿病(T1D)是一种自身免疫性疾病是受自身反应性T细胞1特征在于胰岛素产生胰岛β细胞的破坏。 T1D的诊断通常是在贫,年轻个体,谁可能酮症酸中毒表现为胰岛素缺乏的证据后高血糖症(血糖> 200mg / dl的)测量的。在T1D的诊断时,存在用于β细胞功能和质量的显着损失的证据(50 - 90%)2。在临床研究中,在诊断时被提起的几个免疫调节药物导致β细胞功能(大概质量),但没有的稳定已导致疾病的临床缓解,已提出的呼叫为发展的裁断生物标志物为早期检测疾病的和组合的有效性的纵向跟踪治法3,4。由国际财团的努力,这样的S中的人胰岛研究网络协会在希思5全国学院,都强调了需要开发侧重于T1Dβ细胞应激和死亡的生物标志物。
在这些努力线,我们组和其他人最近开发了测量循环,从垂死的β细胞主要6出现表观遗传学修饰的DNA片段的生物标志物检测- 9。在所有的公布分析迄今,重点是对人类基因编码前胰岛素原(INS),这表明更高的程度相比其他细胞类型的非甲基化CpG部位中的编码和启动子区域的定量。未甲基化的INS DNA片段的解放被假设为主要从死亡线上(坏死,凋亡)β细胞发生。我们最近的研究表明,青少年,在这两个非甲基化和甲基化DNA INS海拔在位置-69基点(相到t他转录起始位点),新发1型糖尿病进行观察,并一起担任特异性标志物为这个人口6。这些生物标志物测定涉及使用商业自旋试剂盒的血清或血浆的无细胞的DNA的分离,接着是分离的DNA的亚硫酸氢盐转化率(以非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶,留下甲基化的胞嘧啶完整)。
在这份报告中,我们描述了血清样品的采集,从血清中游离DNA,亚硫酸氢盐转化和滴数字PCR(下文,数字PCR)的性能隔离的差异甲基化DNA INS技术方面。
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Representative Results
为了正确地解释数据,我们使用质粒控制在每个数字PCR同时运行非甲基化和甲基化的目标DNA INS。这些控件确保对应于甲基化和未甲基化的DNA的信号是清晰可辨。 图1示出对应于液滴对含亚硫酸氢盐转化的未甲基化的INS的DNA( 图1A)质粒对照,甲基化的INS的DNA( 图1B)的2-D散点图,并以1:两种质粒( 图1C)的1:1混合物。含有甲基化的质粒INS通过飞沫积极为6-羧基(FAM)信号指示,而含有甲基化的质粒INS由飞沫积极为VIC信号指示。在1:1的质粒混合物,双阳性液滴群所看到的,对应于含有两个物种的液滴脱氧核糖核酸。从消极的区分水滴飞沫积极,数据使用的是这些2-D地块门。需要注意的是在图1A中,有FAM阳性液滴入VIC通道的轻微移位,这表明对甲基化的INS的DNA探针显示出为未甲基化的INS DNA一些交叉反应性。同样地,在图1B中 ,有国际中心阳性液滴的非常轻微的换挡到FAM通道,说明探头交叉反应性与甲基化DNA的未甲基化的DNA。数字PCR的一个主要优点是它仍可以区分特定信号,即使当探针是不是100%特异性的。对于由软件相应的泊松统计计算,每个PCR反应应该划分为至少10,000个液滴,显示负数液滴群,并显示阴性和阳性液滴之间明显的幅度差(可靠的门控)。为了证明我们的引物的线性度,我们p跨越几个数量级的两个质粒的erformed混合物。 如图2中所示,改变一个质粒的浓度可以线性的第二质粒的恒定量的存在下检测到的。为新的实验室执行此过程,建议构造一个类似混合物实验,以确保该试验是在一个线性检测方式操作。
接下来,我们得到的三个主题的新发T1D血清(2天内诊断)和三个对照个体而不T1D(见临床特征表1)。协议是由美国印第安纳大学机构审查委员会批准。的提供对象的父母书面知情同意。 图3示出的非甲基化和甲基化的INS的DNA拷贝数/微升血清定量,换算成记录10从这些控制和T1D受试者。数据显示,我既甲基化和未甲基化的DNA INS 1型糖尿病的展品水平升高ndividuals与对照组相比,类似于以前6日报道的数据。
图1: 质粒控制的代表性的2-D地块。通过在相对位置-69碱基对克隆亚硫酸氢盐转化的INS的DNA携带的非甲基化或甲基化胞嘧啶的片段与INS转录起始位点中产生的质粒的标准。示出的是使用含有未甲基化的(A)和甲基化(B)的质粒的2-D图INS DNA和为1:两种质粒(C)的1:1混合物。箭头识别甲基化的非甲基化,甲基化,和未甲基化的+(双精度型阳性)INS含DNA的微滴。 FAM =目标1; VIC =目标2。REF =“http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图2: 使用控制质粒DNA混合物的目标定量。含亚硫酸氢盐转化的INS的DNA携带的非甲基化或甲基化胞嘧啶的克隆片段在相对位置-69碱基对INS转录起始位点的质粒的标准在所示的各种组合进行混合,然后进行复数字PCR。图中显示的目标DNA片段,表现为拷贝/μL的定量; R 2 = 0.989对于未甲基化的INS的DNA和r 2 = 0.998为甲基INS的DNA。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3: 在 循环 控制 非甲基化和甲基 INS DNA 和科目1型糖尿病。血清样品从4青年新发T1D收集,并从4无病,无关的控制,然后通过数字PCR处理的差异甲基化DNA INS测量。示出的是对于未甲基化的(A)和甲基化(B)中 的INS的DNA数字PCR测定结果。数据显示为单个点,平均±SEM。统计数据是由双尾学生参数t检验。 请点击此处查看THI一个更大的版本的身影。
控制 | 1型糖尿病发病 | |
年龄(岁) | 10.3±1.3 | 9.2±1.0 |
女人男人 | 1:3 | 1:3 |
BMI Z得分 | 0.30±0.9 | 0.74±0.9 |
糖化血红蛋白 (%) | 11.1±0.6 | |
C-肽(皮摩尔/ L)的 | 285.5±37.0 |
表1:控制和科目1型糖尿病的人口。
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Discussion
通过DNA甲基化的胞嘧啶甲基化使得转录在许多基因的表观遗传调控。在人体中的INS基因在胰岛β细胞几乎完全表达,似乎有在INS基因胞嘧啶甲基化的频率之间的相关性,以它的转录11的沉默。因此,大多数细胞类型显示在较β细胞11多种胞嘧啶的INS基因的甲基化相当高的频率- 13。已经提出了β细胞死亡的发生率可通过无细胞未甲基化的INS DNA的血清水平,这将从死于该释放他们的DNA 12β细胞很大程度上出现的分析来监测。
亚硫酸氢钠反应未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶,留下不变14甲基化的胞嘧啶。测序或PCR分析Ò因此˚F亚硫酸氢盐转化的DNA的允许的原始胞嘧啶是否是甲基化或不判定。使用基于染料的技术甲基化特异性PCR利用由于引物和模板之间的3'碱基对错配的PCR效率的差异,并由此允许下列DNA 15的亚硫酸氢盐转化的非甲基化与甲基化的胞嘧啶的区别。因此,基于染料PCR来定量在T1D受试者12,16早期研究的未甲基化的,以甲基化的INS的相对比。然而,基于染料的PCR技术有几个缺点,包括有限的特异性,缺乏DNA片段浓度的绝对定量的,以及无法多路复用( 即 ,检测在相同的反应都甲基化和未甲基化的DNA种类)。其他团体已执行无细胞的DNA片段直接测序,一种允许若干差异甲基化CpG部位的监测与多大呃特异性9。然而,测序技术需要大体积样品,是不容易适合于使用编组的样品,并且是昂贵的。
由于这些限制,我们组和其他人已经使用数字PCR,提供了DNA片段的绝对定量的技术的结果,需要从新鲜或存留样品的血清仅微升数量时,是适合于复用,显示出比传统的定量PCR更高的灵敏度,比直接测序更便宜。数字PCR技术包括使用常规的引物/探针测定法和水包油PCR反应到〜20,000个液滴的基于微流体的分区。以下经分区的反应的热循环,液滴随后通过流式细胞仪分析,以确定具有正和负信号的液滴。泊松统计来计算各DNA物种的绝对量(拷贝数)。概念ð数字PCR的etails已在其他地方描述17。
此协议通过数字PCR测量差异甲基化的INS脱氧核糖核酸描述β细胞死亡在人体中的测量。我们的数据这里提出和其他地方6表明,引物/探针组合,在-69位置检测(相对于INS的转录起始位点)表现出足够的特异性或者非甲基化胞嘧啶(FAM探针)或甲基化胞嘧啶胞嘧啶差异甲基化( VIC探头)( 见图1A和1B)。在位置同时含有甲基化和未甲基化的INS片段-69碱基的质粒的混合物( 即 ,亚硫酸氢盐转化的具有任一尿嘧啶或胞嘧啶在位置-69 bp的DNA)含有一个或另一个质粒,展品液滴或两种质粒(双阳性信号在图1C)。泊松统计计算采用日Ë液滴数是正对于给定的探针(无论单阳性或双阳性)来推导每甲基化或未甲基化的DNA片段的拷贝数。
当利用人血清中差异甲基化的胞嘧啶的测定在无细胞的DNA位置-69碱基( 图3),我们的数据表明两个关键特征:(1)甲基化的INS水平在这些受试者5-10倍高比未甲基化的INS(无论诊断的),和(2)两个非甲基化和甲基化的INS的绝对水平是在受试者新发T1D与对照相比高。而较高水平的甲基化的INS相比未甲基化的INS可能反映由非β细胞所产生的无细胞DNA的较大的负担,在更高水平的INS在新发T1D受试者两个物种的可能反映了在流行β的增加细胞死亡(未甲基化的中S)和可能死亡/与该疾病状态( 例如,先天和适应性免疫细胞)相关的其它细胞类型的营业额。对INS的新发1型糖尿病患者这两个物种的海拔还进一步猜测是以前6讨论。不管INS在从这些个体的血清两个物种的来源,值得注意的是,对甲基化的INS的非甲基化比率也不会拾起在绝对水平的显著差异(由其他研究者使用染料-基于PCR报告的)的测量这里描述的和在我们最近的出版物6,从而强调数字PCR的功率对于这种类型的生物标志物的分析。
一些预防措施和限制应予注意。我们认为重要的是,血液被采集的4小时内处理并且立即用于DNA分离或储存在-80ºC供将来使用。在未发表的研究,我们有OBServed DNA回收率的一些损失后收集的4小时,或许由于DNA降解,如在样品18的长期储存研究中观察。因为数字PCR的增加的敏感性,特别应注意,以避免样品的污染,否则将无法在传统的qPCR明显。最后,该技术的一个关键限制是,其中液滴生成不超过〜万液滴样品的分析。这些样品不提供可靠的泊松统计,并且因此可以被认为难以解释。如此低的液滴产生的多种原因可能包括与所用试剂的质量在样品处理技术错误,与微滴发生器技术问题,或问题。
总之,本报告描述了在位置-69通过数字PCR bp的差异甲基化,无细胞的INS的DNA测定的详细协议。这里所描述的协议可以适于任何DNA种类的量差异甲基化的胞嘧啶的检测是需要的,无论从循环或从分离的细胞和组织,并能提供的DNA片段的绝对定量。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
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