Introduction
1型糖尿病（T1D）は、自己反応性T細胞1によるインスリン産生膵島β細胞の破壊により特徴付けられる自己免疫疾患です。 T1Dの診断は、通常、インスリン欠乏の証拠としてケトアシドーシスを呈する可能性があるリーン、若い個体で高血糖（血糖値>が200mg / dl）の測定時に行われます。 T1Dの診断時に、β細胞機能及び質量の実質的な損失の証拠がある（50〜 - 90％）2。臨床研究では、診断時に制定されたいくつかの免疫調節薬は、疾患の臨床的寛解をもたらしたβ細胞機能（およびおそらく質量）が、いずれの安定化の発展のためにコールを調達している知見をもたらしました病気の早期発見のためとの併用療法3,4の有効性の長手方向の追跡のためのバイオマーカーの。国際コンソーシアムの取り組み、などヒース5の国立研究所のヒト膵島研究ネットワークコンソーシアムはね、T1D中のβ細胞ストレスと死に焦点を当てたバイオマーカーを開発する必要性を強調してきました。
9 -これらの取り組みに沿って、私たちのグループなどが最近β細胞6を死んでから主に生じる循環、エピジェネティック修飾されたDNA断片を測定するバイオマーカーアッセイを開発しました。現在まで発表されたアッセイの全てにおいて、焦点は他の細胞型と比較して、コードおよびプロモーター領域における非メチル化CpG部位のより大きな程度を実証するヒト遺伝子をコードするプレ（INS）の定量にされています。非メチル化INS DNA断片の放出は（壊死性、アポトーシス）β細胞を瀕死から主に発生していると仮定しました。我々の最近の研究では位置で、若者にいることを非メチル化とメチル化の両方INS DNAの上昇を示した-69 bpの（トンへの相対彼は新たな発症T1Dで観察され、そして一緒にこの集団6のような特異的バイオマーカーを務めた）転写開始部位。これらのバイオマーカーアッセイは、（ウラシルに非メチル化シトシンを変換するために、無傷のメチル化シトシンを残して）単離されたDNAの重亜硫酸塩変換に続く商用スピンキットを用いて、血清または血漿からの無細胞DNAの単離を伴います。
この報告書では、我々は、血清からの無細胞DNA、重亜硫酸塩変換、および示差的メチル化INS DNAのための液滴のデジタルPCR（以下、デジタルPCR）の性能の単離を、血清サンプル収集の技術的側面を説明します。
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Representative Results
適切にデータを解釈するために、我々は各デジタルPCR実行で非メチル化およびメチル化ターゲットINS DNAの両方のためのプラスミドコントロールを使用します。これらのコントロールは、メチル化および非メチル化DNAに対応する信号が明確に区別されていることを確認してください。 図1は、重亜硫酸塩変換されメチル化されていないINS DNA（ 図1A）を含むプラスミド対照、メチル化INS DNA（ 図1B）が液滴に対応する2次元散布図を示しており、1：二つのプラスミド（ 図1C）の1：1混合物。メチル化INSを含むプラスミドは、VIC信号に対する陽性の液滴によって示されているのに対し、非メチル化INSを含むプラスミドは、6-カルボキシフルオレセイン（FAM）信号用ポジティブ液滴によって示されています。 1：1のプラスミド混合物、二重陽性の液滴の人口は、両方の種を含む液滴に対応し、見られていますDNA。負の液滴からの正の液滴を区別するために、データは、これらの2-Dプロットを使用してゲートされます。 図1Aに、メチル化INS DNA用のプローブはメチル化されていないINS DNAのためのいくつかの交差反応性を示すことを示す、VICチャネルへのFAM陽性滴のわずかなシフトがあることに注意してください。同様に、 図1Bにおいて、FAMチャンネルにVIC陽性小滴の非常にわずかなシフトは、メチル化DNAと非メチル化DNAに対するプローブの交差反応性を示し、そこです。デジタルPCRの主な利点は、それがまだプローブ100％特異的ではない場合でも、特定の信号を判別することが可能です。ソフトウェアによる適切なポアソン統計計算のために、各PCR反応は、少なくとも合計10,000滴に分割する負の液滴のクラスタを表示し、（信頼性のゲーティングのための）負と正の液滴の間に明確な振幅差を示すべきです。私たちのプライマーの直線性を実証するために、我々のp桁違いに渡って二つのプラスミドの混合物をerformed。 図2に示すように、1つのプラスミドの種々の濃度を直線的に第二のプラスミドの一定量の存在下で検出することができます。新しいラボは、この手順を実行するために、我々は、アッセイが線形検出方式で動作していることを保証するために、同様の混合実験を構築することをお勧めします。
次に、我々は、（臨床的特徴については表1を参照）T1Dなし（診断の2日以内に）新規発症T1Dと3人の被験者と3対照個体の血清を得ました。プロトコルは、インディアナ大学施設内倫理委員会によって承認されました。対象者の保護者は、書面によるインフォームドコンセントを提供しました。 図3は、非メチル化とメチル化INS DNAの定量は、数/μlの血清をコピー示し、これらのコントロールとT1D被験者から10をログに記録する変換。私のデータショー T1Dの展示とndividualsは、以前に6報告されたデータに類似するコントロールと比較して、メチル化および非メチル化の両方INS DNAのレベルが上昇します。
図1： プラスミドコントロールの代表的な2次元プロット。プラスミド標準は、転写開始部位INSに位置-69 bpの相対的で重亜硫酸塩変換INS DNA保有する非メチル化またはメチル化シトシンの断片をクローニングすることによって生成されました。図示非メチル化（A）及びメチル（B）を含有するプラスミドを用いて、2次元プロットINS DNAであり、1：二つのプラスミド（C）の1：1混合物。矢印は、メチル化、非メチル化メチル化、及び非メチル化+（プラスダブル）INS DNA含有液滴を識別します。 FAM =目標1。 VIC =ターゲット2。REF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： コントロールプラスミド混合物を使用して、DNA標的の定量。位置で非メチル化またはメチル化シトシンを保有する重亜硫酸塩変換INS DNAのクローニングされた断片を含むプラスミド規格-69 INS bpの相対は、転写開始部位は、デジタルPCRを多重化するために施された後、示された様々な組み合わせで混合しました。図は、コピー/μlとして提示標的DNA断片の定量を示します。メチル化INS DNAのためのR 2 = 0.989非メチル化INS DNA用とr 2 = 0.998。 にはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
図3：T1D とコントロールと被験者における 非メチル化およびメチル化 INS DNA レベルの 循環 。血清サンプルは、デジタルPCRにより示差的にメチル化INS DNAの測定のために処理した後、新規発症T1Dとし、4無病、無関係な対照から4青少年から収集しました。 （A）非メチル化及びメチル化のためのデジタルPCRアッセイの結果（B）INS DNAも示されています。データは、個々の点として表示され、平均±SEMです。統計は、両側パラメトリックスチューデントt検定によって分析しました。 THIの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。sのフィギュア。
| コントロール | 発症時のT1D | |
| 年齢（歳） | 10.3±1.3 | 9.2±1.0 |
| 女性/男性 | 1：3 | 1：3 |
| BMI Zスコア | 0.30±0.9 | 0.74±0.9 |
| HbA 1C（％） | 11.1±0.6 | |
| C-ペプチド（ピコモル/ L） | 285.5±37.0 |
表1：T1Dとコントロールと被験者の人口統計。
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Discussion
DNAメチルトランスフェラーゼによってシトシンのメチル化は、多くの遺伝子における転写のエピジェネティックな制御を可能にします。ヒトでのINS遺伝子がほぼ独占的に膵島β細胞で発現し、その転写11のサイレンシングにINS遺伝子中のシトシンのメチル化の頻度との間に相関関係があるように表示されます。 13 -このように、ほとんどの細胞型は、β細胞11に比べ、様々なシトシンにおけるINS遺伝子のメチル化の実質的に高い周波数を示します。それらのDNA 12を遊離β細胞死滅から主として生じるであろう、β細胞死の有病率は、無細胞非メチル化INS DNAの血清レベルの分析によって監視することができることが提案されています。
重亜硫酸塩反応は14不変のメチル化シトシンを残し、ウラシルに非メチル化シトシンを変換します。シークエンシングまたはPCR分析OFの重亜硫酸塩変換DNAは、したがって、元のシトシンがメチル化されたかどうかの決意を可能にします。メチル化特異的PCR染料ベースの技術を使用して、プライマーとテンプレートとの間の3 '塩基対のミスマッチによるPCR効率の違いを利用し、それによってDNA 15の重亜硫酸塩変換以下のメチル化シトシン対非メチル化の区別を可能にします。従って、染料ベースのPCRは、T1Dが12,16を被験体の初期の研究でメチル化INSの非メチル化の相対的な割合を定量しました。しかし、染料ベースのPCR技術は、限られた特異性、DNA断片濃度の絶対定量化の欠如、および多重化することができない（ すなわち 、同じ反応においてメチル化及び非メチル化の両方のDNA種を検出する）を含むいくつかの欠点を有しています。他のグループは、非常に大きいと、いくつかの示差的にメチル化CpG部位の監視を可能にする技術を無細胞DNA断片の直接配列決定を行いましたER特異性9。しかしながら、シークエンシング技術は、大量のサンプル容量を必要とする簡単バンクサンプルの使用に適していないで、かつ高価です。
これらの制限の結果として、当社グループと他の人がデジタルPCR、DNA断片の絶対定量を提供する技術を採用している、新鮮なまたはバンクサンプルからの血清の唯一のマイクロリットルの量を必要とし、多重化に適している、伝統的な定量的PCRよりも高い感度を示しています、および直接配列決定よりも安価です。デジタルPCR技術は、従来のプライマー/プローブアッセイを使用すると、〜2万滴への水の油中PCR反応のマイクロ流体ベースの分割を含みます。分割された反応の熱サイクルの後、液滴はその後、正および負の信号で液滴を識別するために、フローサイトメーターによって分析されます。ポアソン統計を各DNA種の絶対量（コピー数）を計算するために使用されます。概念DデジタルPCRのetailsは、他の場所17に記載されています。
このプロトコルは、デジタルPCRにより示差的にメチル化されたINSの DNAを測定することにより、ヒトにおけるβ細胞死の測定を説明します。我々のデータは、位置のシトシンの差動メチル化を検出するプライマー/プローブの組み合わせということショーをここで提示し、他の場所で6 -69（INSの転写開始部位に対して）非メチル化シトシン（FAMプローブ）またはメチル化シトシン（いずれかのために十分な特異性を示しますVICプローブ）（ 図1AおよびBを参照してください）。位置でメチル化および非メチル化の両方INS断片を含むプラスミドの混合物を-69塩基対（ すなわち 、重亜硫酸塩変換DNAは、位置にウラシルまたはシトシンのいずれかを有する-69 bp）の展示1を含む液滴または他のプラスミド、またはその両方のプラスミド（二重陽性シグナル図1C中）。ポアソン統計的計算は番目を利用します所定のプローブについて陽性である電子滴数、各メチル化または非メチル化DNA断片のコピー数を導出する（単一陽性または二重陽性かどうか）。
位置での差別的メチル化シトシン-69無細胞DNA中の塩基対（ 図3）を測定するためのヒト血清を利用する場合、我々のデータは、次の2つの主要な機能を示しています（1）メチル化INSのレベルは、これらの科目に高い5〜10倍されています非メチル化INS（関係なく、診断の）よりも、および（2）の両方の非メチル化およびメチル化INSの絶対レベルは、対照と比較して新規発症T1Dの被験者に高くなっています。メチル化されていないINSと比較して、メチル化されたINSの高いレベルは、おそらく非β細胞から発せられる無細胞DNAの大きな負担を反映したのに対し、新規発症T1D被験者におけるINSの両種のより高いレベルは、おそらく流行βの増加の両方を反映しています細胞死（非メチル化INS）、および場合によっては死/病状（ 例えば、先天性および適応免疫細胞）に関連付けられている他の細胞型の代謝回転。新規発症のT1D被験者におけるINSの両種の標高に関するさらなる投機は、先に6議論されました。かかわらず、これらの個体からの血清中のINSの両方の種のソースの、メチル化INSへの非メチル化の比の測定は（染料系PCRを使用して、他の研究者によって報告されたように）絶対レベルの有意な差異をピックアップしなかったであろうことは注目に値しますこのようにバイオマーカー解析このタイプのデジタルPCRの力を強調し、ここで説明すると私たちの最近の刊行物6インチ
いくつかの注意事項と制限事項が注目されるべきです。我々は、血液が収集の4時間以内に処理され、いずれか一方がDNA単離のために直ちに使用するか、または将来の使用のために-80ºCで保存することが重要であると感じています。未発表の研究では、我々はOBSを持っていますサンプル18の長期保存の研究に見られるように、恐らくDNA分解のために、収集の4時間後のDNAの回収の一部の損失をerved。そのため、デジタルPCRの感受性増大のため、特別なケアは、そうでなければ、従来の定量PCRに顕著ではないであろうサンプルの汚染を避けるために注意すべきです。最後に、技術の主要な制限は、液滴の生成は〜万滴を超えないサンプルの分析です。このようなサンプルは、信頼性の高いポアソン統計を提供しない、そのように解釈不能と見なすことができます。このような低液滴生成の複数の原因は、使用する試薬の品質に関連するサンプルの取り扱いにおける技術的なエラー、液滴生成器に関する技術上の問題、または問題が含まれる場合があります。
要約すると、このレポートには、位置-69デジタルPCRによる塩基対で示差的にメチル化、無細胞INS DNAの測定のための詳細なプロトコルを記述しています。ここで説明するプロトコルは、いずれにも適合させることができますDNA種はれる示差的メチル化シトシンの検出は、循環から、または単離された細胞および組織からか、望まれ、そしてDNAフラグメントの絶対的な定量化を提供することができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
