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Genetics

Die Messung der differentiell methylierter Published: December 21, 2016 doi: 10.3791/54838

Introduction

Typ - 1 - Diabetes (T1D) ist eine Autoimmunerkrankung , die durch die Zerstörung der Insulin produzierenden Inselzellen β - Zellen durch autoreaktive T - Zellen 1 gekennzeichnet ist. Die Diagnose von T1D ist in der Regel bei der Messung von Hyperglykämie (Blutzucker> 200 mg / dl) in einem schlanken, jungen Person gemacht, die mit einer Ketoazidose als Beweis für Insulinmangel darstellen könnten. Zum Zeitpunkt der Diagnose von T1D gibt es Hinweise für einen wesentlichen Verlust von β - Zellfunktion und Masse (50-90%) 2. In klinischen Studien wurden mehrere immunmodulatorischen Medikamente, die zum Zeitpunkt der Diagnose eingeleitet wurden führte zur Stabilisierung der β-Zellfunktion (und vermutlich Masse), aber keine haben in klinischer Remission der Erkrankung führte, eine Feststellung, dass die Forderung nach der Entwicklung erhöht hat von Biomarkern für frühere Erkennung der Krankheit und für die Längs Verfolgung der Wirksamkeit von Kombinationstherapien 3,4. Die Bemühungen der internationalen Konsortien, eine solchedas Human Islet Research Network Consortium s an den National Institutes of Heath 5, haben die Notwendigkeit zur Entwicklung von Biomarkern betont , dass in T1D auf β Zellstress und Tod konzentrieren.

Im Einklang mit diesen Bemühungen haben unsere Gruppe und andere kürzlich Biomarker - Assays entwickelt, die epigenetisch modifizierte DNA - Fragmente messen zirkulierenden , die von sterbenden β - Zellen 6 in erster Linie entstehen - 9. In allen veröffentlichten Assays bisher hat sich der Schwerpunkt auf die Quantifizierung des humanen kodierenden Gens Präproinsulin (INS) gewesen, der größer Grade unmethylierte CpG - Stellen in den Codierungs- und Promotorregionen im Vergleich zu anderen Zelltypen veranschaulicht. Die Befreiung von nicht - methylierten INS DNA - Fragmente wurde die Hypothese aufgestellt , als in erster Linie vom Sterben (nekrotischen, apoptotischen) β - Zellen entstehen. Unsere jüngsten Studien haben gezeigt , dass in der Jugend, Erhöhungen in sowohl unmethylierte und methylierte DNA INS an Position -69 bp (bezogen auf ter Transkriptionsstartstelle) wurden in neu einsetzende T1D beobachtet und diente zusammen als spezifische Biomarker für diese Population 6. Diese Biomarker Assays beinhalten die Isolierung von zellfreien DNA aus Serum oder Plasma unter Verwendung handelsüblicher Kits Spin, gefolgt von einer Bisulfit-Umwandlung von der isolierten DNA (an nicht-methylierte Cytosine bis uracile konvertieren, so dass methylierte Cytosine intakt).

In diesem Bericht beschreiben wir die technischen Aspekte der Serumprobe Sammlung, Isolierung von zellfreien DNA aus Serum, Bisulfitumwandlung und Leistung von Tröpfchen digitalen PCR (von nun an, digitale PCR) für differentiell methyliert INS DNA.

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Representative Results

Um Daten in geeigneter Weise zu interpretieren, verwenden wir Plasmid - Kontrollen sowohl für die unmethylierte und methylierte Ziel INS DNA in jeder digitalen PCR - Lauf. Diese Kontrollen stellen sicher, dass Signale an methylierter und nicht methylierter DNA entsprechen, sind klar zu unterscheiden. Abbildung 1 zeigt die 2-D Streudiagramme zu Tröpfchen für Plasmid Kontrollen enthält Bisulfit umgewandelt unmethylierte INS DNA (1A) entspricht, methylierte INS DNA (1B) und eine 1: 1 - Gemisch der zwei Plasmide (Figur 1C). Plasmid unmethylierte INS enthält , wird durch die Tröpfchen positiv für die 6-Carboxyfluorescein (FAM) Signal angezeigt, während Plasmid INS durch die Tröpfchen positiv für das Signal VIC angezeigt wird methyliert enthält. In der 1: 1-Plasmid-Gemisch wurde eine Population doppelsträngiger positive Tröpfchen ist zu sehen, entsprechend Tröpfchen, die sowohl ArtenDNA. Zur Unterscheidung positive Tröpfchen aus negativen Tröpfchen werden Daten gated diese 2-D-Plots verwenden. Man beachte , daß in Figur 1A, gibt es eine leichte Verschiebung der FAM-positive Tröpfchen in die VIC Kanal, das anzeigt , dass die Sonde für die methylierte DNA INS weist gewisse Kreuzreaktivität für die unmethylierte DNA INS. Ebenso in Figur 1B, gibt es eine sehr geringe Verschiebung der VIC-positive Tröpfchen in der FAM Kanal anzeigt Kreuzreaktivität der Sonde für die unmethylierte DNA mit methylierter DNA. Ein wesentlicher Vorteil der digitalen PCR ist es immer noch spezifische Signale selbst unterscheiden kann, wenn Sonden nicht zu 100% spezifisch sind. Für eine entsprechende Poisson statistische Berechnungen durch die Software, sollte jeder PCR-Reaktion in mindestens 10.000 Gesamt Tröpfchen aufzuteilen, zeigen eine Gruppe von negativen Tröpfchen, und zeigen eine deutliche Amplitudendifferenz zwischen negativen und positiven Tröpfchen (für eine sichere Gating). Um zu demonstrieren, Linearität unserer Primer, wir performed Mischungen der beiden Plasmide über mehrere Größenordnungen. Wie in Figur 2 gezeigt, können variierende Konzentrationen eines Plasmid linear in der Gegenwart einer konstanten Menge des zweiten Plasmids nachgewiesen werden. Für neue Labore dieses Verfahren durchführen, empfehlen wir eine ähnliche Mischung Experiment konstruieren, um sicherzustellen, dass der Test in einem linearen Detektions Mode arbeitet.

Als nächstes wir Serum von drei Patienten mit neu aufgetretenem T1D erhalten (innerhalb von 2 Tagen nach der Diagnose) und drei Kontrollpersonen ohne T1D (Tabelle 1 für die klinische Merkmale sehen). Protokolle wurden von der Indiana University Institutional Review Board genehmigt. Die Eltern der Probanden eine schriftliche Einwilligung informiert. Abbildung 3 zeigt die Quantifizierung von nicht - methylierten und methylierten INS DNA - Kopienzahlen / ul Serum, umgerechnet 10 von diesen Kontrollen und T1D Themen zu protokollieren. Die Daten zeigen, dass i ndividuals mit T1D zeigen erhöhte Werte von sowohl methylierter und nicht methylierter DNA INS im Vergleich zu Kontrollen, ähnlich wie Daten , die zuvor 6 gemeldet.

Abbildung 1
Abbildung 1: Repräsentative 2-D - Plots von Plasmid - Kontrollen. Plasmid - Standards wurden erzeugt durch Fragmente von Bisulfit-umgewandelt INS DNA beherbergen unmethylierte oder methylierte Cytosin an Position -69 bp relativ zum INS Klonen Transkriptions - Seite. Es zeigen 2-D Diagramme Plasmid enthalten unmethylierte (A) und methylierten (B) INS - DNA und für ein 1: 1 - Mischung der zwei Plasmide (C). Die Pfeile kennzeichnen die nicht methylierten, methylierte und unmethylierte + methyliert (Doppel- positiv) INS DNA-haltigen Tröpfchen. FAM = Ziel 1; VIC = Target 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Die Quantifizierung von DNA - Targets Control Plasmid Mischungen verwenden. Plasmid - Standards geklonten Fragmente von Bisulfit-umgewandelt INS DNA beherbergen unmethylierte oder methylierte Cytosin an Position -69 bp relativ zum INS enthält Website Transkriptions - Start wurden bei den verschiedenen Kombinationen gemischt gezeigt, dann einer digitalen PCR zu multiplexen. Die Figur zeigt die Quantifizierung der Ziel-DNA-Fragmente, als Kopien / & mgr; l dargestellt; r 2 = 0,989 für unmethylierte DNA INS und r 2 = 0,998 für methylierte DNA INS. Bitte klicken Sie hier , um diesehen eine größere Version dieser Figur.

Figur 3
Abbildung 3: Die Umlauf Unmethylierte und methylierter INS - DNA - Spiegel in den Kontrollen und Patienten mit T1D. Serumproben wurden von vier Jugendlichen mit neu aufgetretenem T1D gesammelt und von 4 krankheitsfreie, unabhängige Kontrollen, dann verarbeitet für die Messung von differentiell methyliert INS DNA durch digitale PCR. Gezeigt sind Ergebnisse von digitalen PCR Assays für unmethylierte (A) und methylierten (B) INS DNA. Die Daten werden als einzelne Punkte angezeigt und Mittelwert ± SEM. Die Statistiken wurden durch einen zweiseitigen parametrischer Students t - Test analysiert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version von thi zu sehenWert.

Steuerung T1D bei Beginn
Alter (Jahre) 10,3 ± 1,3 9,2 ± 1,0
Weiblich männlich 1: 3 1: 3
BMI Z-Score 0,30 ± 0,9 0,74 ± 0,9
HbA 1C (%) 11,1 ± 0,6
C-Peptid (pmol / L) 285,5 ± 37,0

Tabelle 1: Demographische Daten der Kontrollen und Patienten mit T1D.

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Discussion

Die Methylierung von Cytosin durch DNA-Methyltransferasen ermöglicht die epigenetische Kontrolle der Transkription bei vielen Genen. Das INS - Gen beim Menschen wird fast ausschließlich in islet β - Zellen exprimiert, und es scheint Silencing seiner Transkriptions 11 eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Methylierung von Cytosin in dem INS - Gen zu sein. Als solches zeigen die meisten Zelltypen wesentlich höhere Frequenzen der Methylierung des INS - Gen an verschiedenen Cytosine verglichen Zellen 11 zu & beta; - 13. Es wurde vorgeschlagen , dass die Prävalenz von β Zelltod durch Analyse der Serumspiegel von zellfreien unmethylierte DNA INS überwacht werden könnte, die weitgehend aus β sterbende Zellen ergeben würden, die ihre DNA 12 befreien.

Die Bisulfit - Reaktion wandelt unmethylierte Cytosine in urazile, methylierte Cytosine unverändert 14 zu verlassen. Die Sequenzierung oder PCR-Analyse of Bisulfit-umgewandelten DNA erlaubt daher die Bestimmung, ob der ursprüngliche Cytosin methylierte oder nicht. Methylierungs-spezifische PCR unter Verwendung von Farbstoff-basierte Technologie nutzt Unterschiede in PCR - Effizienz durch 3 'Basenpaar - Mismatches zwischen Primern und Template, und ermöglicht dadurch , dass Unterscheidung von nicht - methylierten gegen methylierte Cytosine folgende Bisulfitumwandlung von DNA 15. Dementsprechend wurde auf Farbstoffbasis PCR verwendet , um das relative Verhältnis von unmethylierten zu methyliert INS in frühen Studien von T1D aussetzt 12,16 zu quantifizieren. Jedoch farbstoffbasierte PCR - Technologie hat mehrere Nachteile, einschließlich begrenzte Spezifität, fehlende absolute Quantifizierung von DNA - Fragment - Konzentrationen, und die Unfähigkeit , zu multiplexieren (dh detektieren sowohl methylierte und unmethylierte DNA - Spezies in der gleichen Reaktion). Andere Gruppen haben die direkte Sequenzierung der zellfreien DNA-Fragmente durchgeführt wird, eine Technik, die große Überwachung mehrerer differentiell methylierte CpG-Stellen mit viel ermöglichter Spezifität 9. Jedoch erfordert die Sequenzierungstechnik große Probenvolumina ist nicht leicht zugänglich unverbrauchten Proben zu verwenden, und ist teuer.

Als Folge dieser Einschränkungen unserer Gruppe und andere haben digitale PCR verwendet wird, eine Technik, die absolute Quantifizierung von DNA-Fragmenten stellt nur Mikrolitermengen von Serum aus frischem oder überhöht Proben erfordert, zugänglich ist zum Multiplexen, zeigt eine höhere Empfindlichkeit als herkömmliche quantitative PCR und ist kostengünstiger als die direkte Sequenzierung. Digital-PCR-Technologie umfasst die Verwendung von herkömmlichen Primer / Sonden-Assays und eine Mikrofluidik-basierte Partitionierung einer Wasser-in-Öl-PCR-Reaktion in ~ 20.000 Tröpfchen. thermische Zyklen der partitionierten Reaktions folgenden werden die Tröpfchen anschließend von einem Durchflusszytometer analysiert, um zu identifizieren, Tröpfchen mit positiven und negativen Signale. Poisson-Statistik wird verwendet um absolute Mengen zu berechnen (Kopienzahlen) jeder DNA-Spezies. Die konzeptionelle details der digitalen PCR wurden an anderer Stelle 17 beschrieben.

Dieses Protokoll beschreibt die Messung von β Zelltod in Menschen durch differentiell methylierte DNA INS durch digitale PCR gemessen wird . Unsere hier präsentierten Daten und anderswo 6 zeigen , dass Primer / Sonde - Kombinationen , die Differential - Methylierung von Cytosin an Position -69 (zu der Transkriptionsstartstelle des INS relativ) erfassen für eine ausreichende Spezifität aufweisen , entweder die nicht methylierten Cytosin (FAM - Sonde) oder der methylierte Cytosin ( VIC - Sonde) (siehe Abbildung 1A und B). Mischungen von Plasmiden sowohl methylierte und unmethylierte INS - Fragmente an der Position -69 bp (dh Bisulfit-umgewandelten DNA mit entweder Uracil oder Cytosin an Position -69 bp) zeigen Tröpfchen , die eine oder die andere Plasmid oder beide Plasmide (double-positive Signale enthält , in Abbildung 1C). Die Poisson statistische Berechnung nutzt the Tröpfchen Zahlen, die für eine gegebene Sonde positiv sind (ob Single-positive oder doppelt positiven), um die Kopienzahl jedes methylierte oder unmethylierte DNA-Fragment abzuleiten.

Wenn für die Messung von differentiell methylierte Cytosine Humanserum unter Verwendung von an Position -69 bp in zellfreien DNA (Abbildung 3), zeigen unsere Daten zwei wichtige Funktionen: (1) Ebenen von methylierter INS sind 5-10-fach höher in diesen Fächern als nicht - methylierten INS (unabhängig von der Diagnose), und (2) absolute Pegel beider unmethylierte und methylierte INS sind höher bei Patienten mit T1D neu einsetzende Vergleich zu den Kontrollen. Während die höheren Ebenen von methylierter INS im Vergleich zu nicht - methylierten INS wahrscheinlich die größere Last der zellfreien DNA ausgehend von nicht-β - Zellen reflektieren, reflektiert die höheren Ebenen der beiden Arten von INS in neu einsetzende T1D Themen , die sowohl für eine Erhöhung der vorherrschenden β Zelltod (unmethylierte INS), und möglicherweise den Tod / Umsatz von anderen Zelltypen , die mit dem Krankheitszustand assoziiert sind (zB angeborenen und adaptiven Immunzellen). Weitere Spekulationen auf den Erhebungen der beiden Arten von INS in neu einsetzende T1D Probanden wurde bisher 6 diskutiert. Unabhängig von den Quellen der beiden Arten von INS in Serum von diesen Personen ist es bemerkenswert , dass die Messung der Verhältnisse von unmethylierten zu methyliert INS (wie durch andere Forscher berichteten unter Verwendung farbstoffbasierte PCR) nicht die signifikanten Unterschiede in absoluten Niveaus aufgenommen haben hier beschriebenen und in unserer jüngsten Veröffentlichung 6, so dass für diese Art von Biomarkeranalyse die Macht der digitalen PCR betont.

Einige Vorsichtsmaßnahmen und Einschränkungen ist zu beachten,. Wir glauben, es ist wichtig, dass das Blut innerhalb von 4 Stunden der Entnahme verarbeitet wird und entweder sofort für die DNA-Isolierung verwendet oder bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung gespeichert. In nicht publizierten Studien haben wir observed der Sammlung einen gewissen Verlust an DNA Erholung nach 4 Stunden, möglicherweise an DNA - Abbau aufgrund, wie in 18 Studien der Langzeitlagerung von Proben gesehen. Aufgrund der erhöhten Empfindlichkeit der digitalen PCR, sollte besondere Sorgfalt Kontamination der Proben vermieden wird, die sonst nicht in der traditionellen qPCR bemerkbar wäre. Schließlich ist eine zentrale Einschränkung der Technik der Analyse von Proben, bei denen Tröpfchenerzeugung nicht ~ 10.000 Tröpfchen nicht übersteigt. Solche Proben bieten keine zuverlässige Poisson-Statistik, und als solche kann nicht interpretierbar betrachtet werden. Mehrere Ursachen solcher geringen Tropfenerzeugung könnten technische Fehler bei der Probenhandhabung, technische Probleme mit dem Tropfengenerator umfassen, oder Fragen im Zusammenhang mit der Qualität der verwendeten Reagenzien.

Zusammenfassend beschreibt dieser Bericht die detaillierten Protokoll für die Messung von differentiell methyliert, zellfreien INS DNA an Position -69 bp durch digitale PCR. Das hier beschriebene Protokoll kann auf jede angepasst werdenDNA-Spezies, für die Detektion von differentiell methylierte Cytosine gewünscht wird, ob aus dem Verkehr oder von isolierten Zellen und Geweben, und absolute Quantifizierung von DNA-Fragmenten zur Verfügung stellen kann.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Red Top Vacutainer  Beckon Dickinson 366441 no additive, uncoated interior, 10 ml
Cryovial Tube Simport T310-3A polypropylene, screw cap tube, any size
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51106
Poly(A) Sigma P9403 disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl 
Absolute Ethanol (200 Proof) Fisher Scientific BP2818-500
DPBS (with CaCl2 and MgCl2) Sigma D8662
0.2 ml PCR 8-strip Tubes MidSci AVST
8-strip Caps, Dome MidSci AVSTC-N
EZ DNA Methylation-Lightning Kit Zymo D5031
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Biorad 1863024
Buffer Control for Probes Biorad 1863052
Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix Life Technologies AH21BH1
EcoR1 New England Biolabs R0101L
twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted Eppendorf 951020346
Pierceable Foil Heat Seal Biorad 1814040
PX1 PCR Plate Sealer Biorad 1814000
QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System Biorad 1864101
Automated Droplet Generation Oil for Probes Biorad 186-4110
DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator Biorad 186-4108
Pipet Tips for Automated Droplet Generator Biorad 186-4120
Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator Biorad 186-4125
C1000 Touch Thermal Cycler Biorad 1851197
QX200 Droplet Reader Biorad 186-4003
ddPCR Droplet Reader Oil Biorad 186-3004

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References

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Genetik Heft 118 Biomarker Islet Diabetes Insulin Digital-PCR Epigenetik
Die Messung der differentiell methylierter<em&gt; INS</em&gt; DNA-Spezies in Humanserumproben als Biomarker von Islet β Cell Death
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Tersey, S. A., Nelson, J. B.,More

Tersey, S. A., Nelson, J. B., Fisher, M. M., Mirmira, R. G. Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet β Cell Death. J. Vis. Exp. (118), e54838, doi:10.3791/54838 (2016).

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