Introduction
Tip 1 diyabet (T1D) oto-reaktif T hücreleri 1 hücrelerden β insulin üreten bağımsız tahrip edilmesi ile karakterize edilen bir otoimmün hastalıktır. T1D tanısı tipik insülin eksikliği delil olarak ketoasidoz ile karşımıza olabilir yalın, genç birey, hiperglisemi (kan şekeri> 200 mg / dl) ölçümü üzerine yapılır. Tip 1 diyabetin tanısı zamanda, β hücre fonksiyonu ve kütlenin önemli bir kayıp kanıtlar vardır (50 -% 90) 2. Klinik çalışmalarda, tanı anında tesis edildi birkaç immün modülatör ilaçlar, hastalığın klinik remisyon sonuçlanmıştır β hücre fonksiyonu (ve muhtemelen kütle), ancak hiçbiri stabilizasyonu geliştirilmesi için çağrı yükseltti bir bulgu sonuçlandı hastalığın erken tespiti için ve için biyomarkerların kombinasyonun etkinliği uzunlamasına izleme 3,4 terapiler. uluslararası konsorsiyumlar tarafından çabalar, böyle birHeath 5 National Institutes of Human Adacık Araştırma Ağı Konsorsiyumu s, T1D içinde β hücre stres ve ölüm odaklanmak Biyobelirteçleri geliştirilmesi gerektiğini vurgulamışlardır.
9 - Bu çalışmalar doğrultusunda, grubumuz ve diğerleri son zamanlarda β hücreleri 6 ölüyor öncelikle ortaya çıkan epigenetik değiştirilmiş DNA fragmanları dolaşan ölçerek biyobelirtecin deneyleri geliştirdik. Bugüne kadar yayınlanan deneylerin tümünde, odak diğer hücre tiplerine göre kodlama ve yükseltici bölgelerinde metillenmemiş CpG bölgelerinin daha yüksek seviyede gösteren insan geni kodlayan prepro (INS) ölçülmesi olmuştur. Unmethylated INS DNA fragmanları kurtuluş (nekrotik, apoptotik) β hücreleri ölüyor öncelikle kaynaklanan olarak varsayılmıştır. Bizim son çalışmalar gençlik, pozisyon -69 bp metillenmemiş ve metile hem INS DNA'daki yükselmeler (göreceli t olduğunu gösterdiO yeni başlayan T1D gözlendi) sitesi başlatmak ve birlikte bu nüfus 6 gibi özel biyomarkerlar görev transkripsiyon bölgesinin. Bu biyomarker deneyler, izole edilmiş bir DNA bisülfit dönüştürülmesi takip ticari eğirme kitleri kullanılarak serum veya plazma hücre içermeyen DNA izolasyonu, içeren (urasillere olmayan metillenmiş sitosinler dönüştürmek için sağlam metillenmiş sitosinler bırakarak).
Bu yazıda farklı şekilde metillenmiş INS DNA serum örneği toplama, serumdan hücre içermeyen DNA, bisülfit dönüşüm ve (bundan böyle, dijital PCR) damlacık dijital PCR performansı izolasyonu teknik yönlerini açıklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uygun verileri yorumlamak için, her dijital PCR vadede unmethylated ve metile hedef INS DNA hem de plazmid denetimlerini kullanın. Bu kontroller metil ve unmethylated DNA karşılık gelen sinyaller açıkça ayırt olduğundan emin olun. Şekil 1, bisülfitle dönüştürülmüş metillenmemiş INS DNA (Şekil 1A) ihtiva eden plasmid kontrol, metil INS DNA (Şekil 1B) için damlacık tekabül eden 2-B dağılım grafiklerini gösterir, ve bir 1: İki plazmid (Şekil 1C) 1 karışımı. Metillenmemiş INS ihtiva eden plazmid plazmid INS VIC sinyali pozitif damlacıkları ile gösterilir metile ihtiva ise, 6-karboksifloresan (FAM) sinyali pozitif damlacıkları ile gösterilir. , 1: 1, plazmid karışımı, çift-pozitif damlacıkların bir popülasyonu her iki türü içeren damlacıklar karşılık gelen görülürDNA. Negatif damlacıkların pozitif damlacıkları ayırt etmek için, veriler bu 2-D grafikleri kullanılarak Geçitli. Şekil 1A, metil INS DNA probu metillenmemiş INS DNA bir miktar çapraz reaktivite sergileyen gösteren VIC kanalına FAM pozitif damlacıkların bir hafif bir kayma olduğunu not edin. Benzer şekilde, Şekil 1B, metillenmiş DNA ile metillenmemiş DNA prob çapraz reaktivite gösteren FAM kanala VIC pozitif damlacıkların çok küçük bir kayma vardır. Dijital PCR önemli bir avantajı probları% 100 spesifik olmadığı zaman o bile hala belirli sinyalleri ayırt edebilen olduğunu. yazılım tarafından uygun Poisson istatistik hesaplamalar için, her PCR reaksiyon, en az 10.000 toplam damlacıklar halinde bölüm negatif damlacıkların bir küme görüntülemek ve (güvenilir yolluk için) negatif ve pozitif damlacıklar arasında açık bir genlik farkı göstermesi gerekir. Bizim astar doğrusallığın göstermek için, biz pbüyüklüğü ölçüsünde boyunca iki plazmid erformed karışımlarıdır. Şekil 2'de de gösterildiği gibi, tek bir plazmit değişen konsantrasyonlarda doğrusal ikinci bir plazmid sabit bir miktarının mevcudiyetinde tespit edilebilir. Yeni laboratuarları bu yordamı gerçekleştirmek için, biz tahlil doğrusal algılama moda çalıştığından emin olmak için benzer bir karışım denemesi inşa öneririz.
Sonra, yeni başlangıçlı tip 1 diyabetin üç denek serum elde T1D olmadan ve üç kontrol bireylerin (klinik özellikleri için bakınız Tablo 1) (Tanı 2 gün içinde). Protokoller Indiana Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylanmıştır. sağlanan konuların Ebeveynler onam yazılı. Şekil 3 metillenmemiş ve metillenmiş INS DNA numaraları / ul serum kopya kantitatif gösterir, bu kontroller ve T1D'nin deneklerden 10 günlük dönüştürülür. veriler gösteriyor ki ben Daha önce 6 bildirilen verilere benzer kontrollerle karşılaştırıldığında metil ve unmethylated hem INS DNA T1D sergi yüksek seviyeleri ile ndividuals.
Şekil 1: Plazmid Kontrollerinin Temsilcisi 2-D Arsalar. Plazmid standartları sitesi dönüşüm başlangıç INS pozisyon -69 bp arasındaki en bisülfitle dönüştürülmüş DNA, INS barındıran metillenmemiş veya metil sitozinin fragmanları klonlanmasıyla elde edilmiştir. Gösterilen metillenmemiş (A) ve metillenmiş (B) ihtiva eden plasmidi kullanılarak 2-B araziler INS DNA, ve 1: İki plazmid (C) 'nin 1 karışımı. Oklar metile, metillenmemiş metillenmiş ve metillenmemiş + (pozitif da çift) INS DNA içeren damlacıkların tanımlar. FAM = Hedef 1; VIC = Hedef 2.ref = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54838/54838fig1large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: Kontrol Plazmid Karışımları kullanılarak DNA Hedefler miktar tayini. Siteyi dönüşüm başlangıç INS pozisyon -69 bp nispetle bisülfit dönüştürülen INS DNA barındıran unmethylated veya metil sitozin klonlanmış fragmanlarını içeren plazmid standartları dijital PCR multipleks maruz sonra, gösterilen çeşitli kombinasyonlarda da karıştırıldı. Şekil kopya / ul olarak sunulan olan hedef DNA parçaları, kantitatif göstermektedir; R2 = 0.989 metillenmemiş INS DNA ve R2 = 0.998 metile INS DNA. Için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek.
Şekil 3: T1D ile Metillenmemiş ve metillenmiş INS DNA Denetimleri'ndeki Seviyeleri ve Konular Sirkülasyon. Serum numuneleri yeni başlayan tip 1 diyabetin 4 gençlik toplandı ve 4 hastalıksız ilgisiz kontrollerden daha sonra dijital PCR ile diferansiyel metile INS DNA'nın ölçülmesi için süreçten geçirildi. Metillenmemiş (A) ve metile (B) INS DNA dijital PCR deneylerinin sonuçları gösterilmektedir. Veriler bireysel noktaları olarak görüntülenir ve ortalama ± SEM edilir. İstatistikler bir iki kuyruklu parametrik Öğrenciler t testi ile analiz edilmiştir. Thi büyük halini görmek için buraya tıklayınızs rakam.
| kontroller | Başlangıç T1D'nin | |
| Yaş (yıl) | 10.3 ± 1.3 | 9.2 ± 1.0 |
| Kadın erkek | 1: 3 | 1: 3 |
| BMI Z-Skor | 0.30 ± 0.9 | 0.74 ± 0.9 |
| HbA1C (%) | 11.1 ± 0.6 | |
| C-peptid (pmol / L) | 285,5 ± 37,0 |
Tablo 1: T1D ile Kontroller ve Deneklerin Demografik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA methyltransferases tarafından sitozinler metilasyon birçok genin de transkripsiyon epigenetik kontrol sağlar. İnsanlarda INS gen neredeyse sadece hücrelerde β adacığın ifade ve onun transkripsiyon 11 susturmak için INS geninde sitozinlerin metilasyon sıklığı arasında bir ilişki olması görünür. 13 - Bunun gibi, çoğu hücre tipleri hücreler 11 ß göre çeşitli sitozinlerin de INS geninin metilasyon önemli ölçüde daha yüksek frekansları göstermektedir. Β hücre ölümü sıklığı DNA'larını 12 serbest β hücrelerin ölme büyük ölçüde ortaya çıkacak hücresiz metile edilmemiş INS DNA serum seviyelerinin analizi ile takip edilebilir önerilmiştir.
Bisülfit reaksiyonundan 14 değişmeden metillenmiş sitosinler bırakarak urasillere halinde metillenmemiş sitosinler dönüştürür. Ardışık veya PCR analizi of bisülfit dönüştürülen DNA nedenle orijinal sitozin metillenmiş olup olmadığı belirlenmesini sağlar. Metilasyon spesifik PCR boya temelli teknoloji kullanılarak astar ve şablon arasındaki 3 'baz çifti uyuşmazlıkları nedeniyle PCR verimlilik farklılıkları sömüren ve böylece DNA'nın 15 bisülfit dönüşümü aşağıdaki metillenmiş sitozinlerin vs metillenmemiş özelliğini sağlar. Bu duruma göre, boya bazlı PCR T1D'nin 12,16 tabi erken çalışmalarda metile INS ile metile edilmemiş göreceli oranını ölçmek için kullanıldı. Ancak, boya bazlı PCR teknolojisi sınırlı özgüllük, DNA fragmanı konsantrasyonlarının mutlak kantitatif eksikliği ve (yani, aynı reaksiyonda metil ve unmethylated DNA türleri hem algılama) multipleks yetersizlik dahil olmak üzere birçok sakıncaları vardır. Diğer gruplar hücre içermeyen DNA parçalarının doğrudan sıralama, büyük bir çok birkaç farklı şekilde metile CpG siteleri izlenmesine olanak sağlar tekniğini gerçekleştirdinizer özgüllük 9. Bununla birlikte, bir sıralama tekniğinin, büyük örnek hacimleri gerektiren, kolayca öbekli örneklerin kullanımı için uygun değildir ve pahalıdır.
grup ve diğer dijital PCR DNA fragmanlarının mutlak kantitatif sağlayan bir teknik kullanılabilir olması, Bu sınırlamaların bir sonucu olarak, taze veya öbekli numunelerden serum sadece bir mikrolitre miktarlarda gerektirir, çoğullama için uygun olan geleneksel kantitatif PCR daha yüksek bir duyarlılık gösterir ve doğrudan sekanslama daha az pahalıdır. Dijital PCR teknolojisi konvansiyonel primer / prob deneyleri kullanımı ve ~ 20,000 damlacıklar halinde bir su-içinde-yağ PCR reaksiyonunun bir mikroakışkan bazlı bölümleme içerir. bölmeli reaksiyonun termal çevrim ardından damlacıklar daha sonra pozitif ve negatif sinyaller damlacıklar belirlemek için bir akış sitometresinde analiz edilmiştir. Poisson istatistiklerine her DNA türlerinin mutlak miktarları (kopya sayısı) hesaplamak için kullanılır. kavramsal dDijital PCR etails başka 17 tarif edilmiştir.
Bu protokol, dijital PCR ile diferansiyel metile INS DNA ölçerek insanlarda β hücre ölümü ölçümü açıklanır. Bizim verilerimiz burada sunulan ve başka yerlerde 6 gösteri bu konumda -69 de metillenmemiş sitozin (FAM prob) veya metil sitozin biri için yeterli özgüllük gösterirler (INS transkripsiyon başlangıç sitesine göre) sitozin diferansiyel metilasyonu tespit primer / prob kombinasyonları ( VIC prob) (Şekil 1A ve B). Pozisyonda -69 bp metil ve unmethylated hem INS parçalarını içeren plazmid karışımları (yani, bisülfit dönüştürülmüş urasil veya sitozin pozisyonunda -69 bp herhangi birine sahip olan DNA) bir ya da diğer plazmid içeren sergi damlacıkları ya da her iki plazmidler (çift pozitif sinyaller Şekil 1C). Poisson istatistiksel hesaplama th kullanırHer metillenmiş veya metillenmemiş DNA parçasının kopya sayısını elde etmek için (-tek pozitif veya çift-pozitif olsun) verilen bir sonda için pozitif e damlacık numaraları.
Hücre-serbest DNA pozisyon -69 bp (Şekil 3) farklı olarak metile sitozinlerin ölçümü için insan serumu kullanarak, bizim veri iki temel özellikleri göstermektedir: metillenmiş INS (1) düzeyleri bu konularda yüksek 5-10 kat vardır unmethylated INS (bakılmaksızın tanı) ve metillenmemiş ve metillenmiş INS hem (2) mutlak seviyeleri daha kontrollerle karşılaştırıldığında yeni başlangıçlı T1D olan kişilerde daha yüksektir. Metillenmemiş INS göre metillenmiş INS yüksek düzeyde muhtemel olmayan β hücrelerinden kaynaklanan hücresiz DNA daha büyük bir yük yansıtan ise, yeni başlayan T1D'nin kişilerde INS her iki türün yüksek düzeyde muhtemel yaygın p bir artış yansıtmaktadır hücre ölümü (unmethylated INS), ve muhtemelen ölüm / hastalık durumu (örn doğal ve kazanılmış bağışıklık hücreleri) ile ilişkili diğer hücre tiplerinin ciro. Yeni başlayan T1D'nin konularda INS iki türün kotlarda daha fazla spekülasyon önce 6 tartışıldı. Ne olursa olsun bu bireylerden serumdaki INS iki türün kaynaklarının, bu önemli olduğunu mutlak düzeylerinde anlamlı farklılıklar almış olmaz (boya bazlı PCR kullanılarak diğer araştırmacılar tarafından bildirilen) metillenmiş INS için unmethylated oranlarının ölçümü böylece biyomarker analizi bu tür dijital PCR gücünü vurgulayan, burada açıklanan ve bizim son yayında 6.
Bazı önlemler ve sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Biz kan toplama 4 saat içinde işlenir ve her iki DNA izolasyonu için hemen kullanılabilir veya ileride kullanılmak üzere -80 ° C'de saklanan önemli olduğunu düşünüyoruz. Yayınlanmamış çalışmalarda, biz obs varNumuneler 18 uzun süreli depolama yapılan çalışmalar gibi, belki de, DNA bozulması nedeniyle toplama 4 saat sonra, DNA kurtarma bazı zarar erved. Çünkü dijital PCR artan duyarlılık, özel bakım, aksi takdirde geleneksel qPCR farkedilir olmaz örneklerin kirlenmesini önlemek için alınmalıdır. Son olarak, tekniğin önemli bir sınırlama, damlacık oluşturma ~ 10,000 damlacıkları geçmeyen numunelerin analizidir. Bu tür örnekler, güvenilir Poisson istatistiklerini vermeyin ve gibi uninterpretable kabul edilebilir. Böyle düşük damlacık oluşturma Çoklu nedenleri kullanılan reaktiflerin kalitesiyle ilgili numune işleme teknik hatalar, damlacık jeneratör ile teknik sorunları veya sorunları içerebilir.
Özet olarak, bu rapor pozisyonda -69 dijital PCR ile bp diferansiyel metile, hücresiz INS DNA ölçümü için ayrıntılı bir protokol açıklamaktadır. Burada açıklanan protokol bir uyarlanabilirDNA dizilerinin olan farklı olarak metillenmiş sitozinlerin algılama dolaşımdan veya izole edilmiş hücrelerden ve dokulardan olup, arzu edilir ve DNA fragmanlarının mutlak kantitatif sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Red Top Vacutainer | Beckon Dickinson | 366441 | no additive, uncoated interior, 10 ml |
| Cryovial Tube | Simport | T310-3A | polypropylene, screw cap tube, any size |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51106 | |
| Poly(A) | Sigma | P9403 | disloved in TE buffer (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) to 5 µg/µl |
| Absolute Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
| DPBS (with CaCl2 and MgCl2) | Sigma | D8662 | |
| 0.2 ml PCR 8-strip Tubes | MidSci | AVST | |
| 8-strip Caps, Dome | MidSci | AVSTC-N | |
| EZ DNA Methylation-Lightning Kit | Zymo | D5031 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Biorad | 1863024 | |
| Buffer Control for Probes | Biorad | 1863052 | |
| Human Unmethylated/Methylated Primer/Probe mix | Life Technologies | AH21BH1 | |
| EcoR1 | New England Biolabs | R0101L | |
| twin.tec PCR Plate 96, semi-skirted | Eppendorf | 951020346 | |
| Pierceable Foil Heat Seal | Biorad | 1814040 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Biorad | 1814000 | |
| QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System | Biorad | 1864101 | |
| Automated Droplet Generation Oil for Probes | Biorad | 186-4110 | |
| DG32 Cartridge for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4108 | |
| Pipet Tips for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4120 | |
| Pipet Tip Bins for Automated Droplet Generator | Biorad | 186-4125 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | Biorad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Biorad | 186-4003 | |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Biorad | 186-3004 |
References
- Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
- Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
- Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778 (2014).
- Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
- Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
- Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
- Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591 (2014).
- Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
- Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
- Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
- Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953 (2009).
- Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
- Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
- Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
- Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
- Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942 (2012).
- Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).
